第二章均相酶反应动力学

第二章均相酶催化反应动力学EnzymeReactionDynamics目录2.1酶催化反应概论2.2单底物酶催化反应动力学2.3有抑制剂的酶催化反应动力学2.4复杂的酶催化反应动力学2.5酶反应过程的影响因素2200types6kinds:氧化还原酶水解酶裂合酶异构酶连接酶转移酶2.1酶催化反应概论酶的分类氧化还原酶（英文名称：Oxidordeuctase）定义：能催化两分子间发生氧化还原作用的酶的总称。其中氧化酶（oxidase;oxydase）能催化物质被氧气所氧化的作用，脱氢酶（dehydrogenase）能催化从物质分子脱去氢的作用。主要存在于细胞中。转移酶（英文名称：Transferase)定义：催化将功能团从一种底物转移到另一种底物的酶。能够催化除氢以外的各种化学功能团(官能团)从一种底物转移到另一种底物的酶类。例如转甲基酶、转氨酶、己糖激酶、磷酸化酶等。水解酶（英文名称：Hydrolase）定义：催化水解反应的酶，也可以说它们是一类特殊的转移酶，用水作为被转移基团的受体。裂合酶（英文名称：Lyase）

定义：催化分子裂解或移去基团的酶。反应中发生电子重排(消除反应)，但不是水解或氧化还原反应。可使C-C(EC4.1.-)、C-O(EC4.2.-)、C-N(EC4.3.-)及类似的键裂解，并在其一个产物中形成双键或环，或在其逆反应中加一个基团于双键上。二磷酸酮糖裂合酶(醛缩酶)，苹果酶裂合酶(丙酮酸脱羧酶)柠檬酸裂合酶(柠檬酸合成酶)。异构酶（英文名称：Isomerase）

定义：催化一种同分异构体转变为另一同分异构体的酶。根据反应方式而分类：（1）结合于同一碳原子的基团的立体构型发生转位反应（消旋酶、差向异构酶），如UDP葡萄糖差向酶（生成半乳糖）；（2）顺反异构；（3）分子内的氧化还原反应（酮糖-醛糖相互转化等），如葡萄糖磷酸异构酶（生成磷酸果糖）；（4）分子内基团的转移反应（变位酶），如磷酸甘油酸变位酶；（5）分子内脱去加成反应。葡萄糖-6-磷酸果糖-6-磷酸

定义：催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与ATP的分解反应相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷（ATP)的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等。催化反应的机制如下：A+B+ATP←→A·B+ADP+Pi或A+B+ATP←→A·B+AMP+PPi连接酶（英文名称：Ligase）降低反应的活化能(Ea)，加快反应速率不能改变反应的方向和平衡关系，即不能改变反应的平衡常数K不能改变反应的自由能变化(ΔG)反应前后酶本身不被消耗酶的催化共性思考：由于酶的加入，使反应的方向改变？酶只能催化可以自发进行的反应，而不可能催化不能自发进行的反应，也不可能改变反应的平衡点？ArehighlyefficientReactionsarespecificCalledforco-factorparticipationReactionconditionsareverymildAreverysensitiveandeasytodenatureorde-activate（Why？How？）Highprocess

绝对专一性；相对专一性；立体专一性；官能团专一性；序列专一性酶的催化特性反应速率及其测定反应速率：单位时间内反应物或生成物浓度的改变。设瞬时dt内反应物浓度的很小的改变为dS，则：若用单位时间内生成物浓度的增加来表示，则：tPtv酶催化动力学基本概念反应分子数反应分子数：是在反应中真正相互作用的分子的数目。如：A→P属于单分子反应根据质量作用定律，单分子反应的速率方程式是：又如：A＋B→C＋D属于双分子反应其反应速率方程可表示为：判断一个反应是单分子反应还是双分子反应，必须先了解反应机制，即了解反应过程中各单元反应是如何进行的。反应机制往往很复杂，不易弄清楚，但是反应速率与浓度的关系可用实验方法来确定，从而帮助推论反应机制。反应级数又如某一反应：A+B→C+D式中k为反应速率常数根据实验结果，整个化学反应的速率服从哪种分子反应速率方程式，则这个反应即为几级反应。例：对于某一反应其总反应速率能以单分子反应的速率方程式表示，那么这个反应为一级反应。符合双分子反应的表达式，为二级反应。把反应速率与反应物浓度无关的反应叫做零级反应。

r=k反应分子数和反应级数对简单的基元反应来说是一致的，但对某些反应来说是不一致的。例如：Sucrose+H2O→Glucose+Frucose是双分子反应，但却符合一级反应方程式。Sucrase因为蔗糖的稀水溶液中，水的浓度比蔗糖浓度大得多，水浓度的减少与蔗糖比较可以忽略不计。因此，反应速率只决定于蔗糖的浓度。

r=kCs浓度因素（酶浓度，底物浓度，产物浓度等）外部因素（温度，压力，pH，溶液的介电常数，离子强度等）内部因素（底物及效应物浓度，酶的结构）影响酶促反应的主要因素酶与底物的作用机理LockandKeyModelInduced-FitModel象手与手套的关系；当低物接近酶的活性中心并与之结合时，酶的构象能发生改变，更适合于底物的结合。

Singlesubstratereaction（单底物反应）:Twosteps:SubstrateScombineswithenzymeEtoproduceESpositionofEStoproducePandEisreleasedM-M方程的建立：2.2.1Michaelis-MentenEquation（M-M方程）2.2单底物酶催化反应动力学＋k+1k-1ESES＋Ek+2P

2.2单底物酶催化反应动力学＋k+1k-1ESES＋Ek+2P快速平衡学说的几点假设条件：酶和底物生成复合物[ES]，酶催化反应是经中间复合物完成的。底物浓度[S]远大于酶的浓度[E]，因此[ES]的形成不会降低底物浓度[S]，底物浓度以初始浓度计算。不考虑P+E→ES这个可逆反应的存在。[ES]在反应开始后与E及S迅速达到动态平衡。快速平衡假设E:free-enzymeES:enzyme-substratecomplexS:SubstrateP:Productk+1,k-1,k+2:reactionrateconstants反应速率常数Definitionofreactionrate反应速率:ForsubstrateSForproductPReversible可逆Irreversible不可逆根据物质作用定律，P的生成速率表示为:Equilibriumassumption“平衡”假设:总酶量保持不变Thetotalenzymeconcentrationstaysconstantduringreaction;与底物浓度cs相比，酶浓度很小，因此因生成中间酶底物复合物ES而消耗的底物S很少;theformationoftheenzyme-substratecomplexdoesnotsignificantlydepletethesubstrate(1)(2)＋k+1k-1ESES＋Ek+2PFastSlow由ES向产物P分解转化的速度明显小于ES回复为E+S的分解速率,因此复合物ES的可逆反应处于准平衡态.Theenzyme-substratecomplexformationrateismuchfasterthanitsreleasingtoproduct.Sothefirststepisinequilibrium.FastSlowES在反应开始后与E及S迅速达到动态平衡。(3)＋k+1k-1ESES＋Ek+2P对于酶复合物ES的解离平衡过程来说，由公式(3)，其解离常数可以表示为,ES

E+Sk-1k+1反应体系中酶量守恒：由公式(3)得：代入公式(1),变换后得：即,代入公式得到(1)(4)推导过程:代入式(4)得：式中：rmax:最大反应速率如果酶的量发生改变，最大反应速率相应改变。KS:解离常数，饱和常数

低KS值意味着酶与底物结合力很强，

(看看KS的公式就知道了，why？)。当反应初始时刻，底物CS>>CE,几乎所有的酶都与底物结合成复合物ES，因此CE0≈CES,反应速率最大，此时产物的最大合成速率为：M-MEquation(5)Enzymereactionkineticparameters酶反应动力学常数:KS：Michaelisconstant.

rmax：MaximumrateMichaelisconstantequalsthesubstrateconcentrationathalfofmaximumrate当反应速率达到最大反应速率的一半时，米氏常数等于底物浓度SS当酶底物复合物ES生成产物的速率与其分解成酶和底物的速率相差不大时，上述“平衡”假设不适应。Why？Quasi-steadyassumption拟稳态假设:K+2isverybigRelativelyslowFastES的生成速率与其解离速率相等，其浓度不随时间而变化。拟稳态假设拟稳态的几点假设条件：酶和底物生成复合物[ES]，酶催化反应是经中间复合物完成的。底物浓度[S]远大于酶的浓度[E]，因此[ES]的形成不会降低底物浓度[S]，底物浓度以初始浓度计算。在反应的初始阶段，产物浓度很低，P+E→ES这个可逆反应的速率极小，可以忽略不计。[ES]的生成速率与其解离速率相等，其浓度不随时间而变化。Experimentaldatademonstratedtheconcentrationprofiles.当反应系统中[ES]的生成速率与分解速率相等时，[ES]浓度保持不变的状态称为稳态。由于反应体系中底物浓度要比酶的浓度高的多，酶底物复合物ES分解生成产物时，释放的酶E又会迅速与底物S结合，从而维持反应体系中酶底物复合物ES的浓度维持不变，即不随时间变化而变化Quasi-steadyassumption拟稳态假设:（6）Ifk+2<<k+1?（7）Keypoint!ComparisonwithM-constant:S平衡假设与稳态假设快速平衡学说与稳态学说在动力学方程形式上是一致的，但Km和KS表示的意义是不同的。当k+2<<k-1时，Km=KS这意味着生成产物的速率远远慢于[ES]复合物解离的速率。这对于许多酶反应也是正确的。MixedorderwithrespecttoS当Cs<<Km时，曲线近似为直线，反应速率与底物浓度近似成正比的关系，可看作为一级反应。当Cs>>Km时，曲线近似为一水平线，底物浓度继续增加时，反应速率变化不大，可看作为零级反应。当在两者之间，则符合M-M方程表达式。双曲线型。米氏常数Km的意义Km值代表反应速率达到rmax/2时的底物浓度。Km是酶的一个特性常数，Km的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。但底物种类、反应温度、pH和离子强度等因素会影响Km值。因此可以用Km值来鉴别酶。Km值可以判断酶的专一性和天然底物。当k+2<<k-1时，Km＝KS

，那么Km可以作为酶和底物结合紧密程度的一个度量，表示酶和底物结合的亲合力大小。若已知Km值，可以计算出某一底物浓度时，其反应速率相当于rmax的百分率。例如:当CS=3Km时，代入米氏方程后可求得r=0.75rmaxKm值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径。催化可逆反应的酶，对正逆两向底物的Km值往往是不同的，例如谷氨酸脱氢酶，NAD+的Km值为2.5×10-5mol/L，而NADH为1.8×10-5mol/L。测定这些Km值的差别及正逆两向底物的浓度，可以大致推测该酶催化正逆两向反应的效率。问题:产物的积累使逆反应的影响不可忽略产物可能会抑制或激活酶的活力随着反应的进行，酶的活力可能会失活反应体系中的一些杂质可能会影响到酶的活性…….2.为什么说低Km值意味着酶与底物的结合力强？1.为什么只有初始反应速率可以使用？考虑一下Km的定义：问题:3.为什么k+2往往会小于k-1？因为生成复合物ES的结合力是很弱的，因而其解离速率很快；而复合物生成产物则包括化学键的生成和断开，其速率当然要慢得多。因此在一般情况下，ES→E+P这一步是整个过程的限速步骤。k+2表示当酶被底物饱和时，每秒种每个酶分子转换底物的分子数，这个常数又称转换数（kcat），kcat越大，表示酶的催化效率越高。k+2=kcat=rmax/CE0kcat/Km:作为酶催化效率的参数是很恰当的。它的上限是k+1,即生成ES复合物的速率。换言之，酶的催化效率不能超过E和S形成ES的扩散控制的结合速率。扩散限制了k+1的数值，在水中扩散的速率常数大约为108-109mol-1Ls-1。(9)AnalysisofM-Mequation--Threestages米氏方程三个不同动力学特点的区域:Cs<<Km:linearly1storderreaction一级反应:

rs=rmaxCs/Km=KCs

integrated:2.2.2动力学特征与参数求取:如何解释？

(10)B)Cs>>Km:Zeroorderreaction零级反应:

rs=rmax

Integrated:如何解释？

分批酶反应体系中Cs随时间的变化过程可以用表示为：Integrated:C)Middlestate:符合M-M方程

(11)由公式：得，如何解释？

结合t=0，CS=CS0的初值积分，Twobasicparameters:Km,rmaxThroughkineticexperimentstodeterminethetwoparameters.M-Mequationisnon-linearequation,Howtodothedataprocess?Determinationofkineticparameters参数求取的方法:Linearization线性法:Integration积分法:L-Bplot(12)1）Lineweaver-Burekmethod:---reciprocallinearization(L-B法)s取倒数得：1.Linearization线性法:(13)2）Hanes-Woolfmethod（H-W法）:H-Wplot乘以CS得：(14)3）Eadie-Hofsteemethod（E-H法）:E-Hplots重排得：上述方法共同特点：要从动力学实验中获取不同CS值得rS值，而rS不能从实验直接获得；实验中能直接得到的是不同时间t时的底物浓度CS；微分法作图；2.Integrationmethod积分法:Integrated:与对应作图，得到一直线，or:(15)(15)例2-1：某酶催化反应，其Km=0.01mol/L,现测得该反应进行到10min时，底物浓度为3.4×10-5,已知CS0=3.4×10-4

mol/L.假定该反应可用M-M方程表示。试求：

(1)最大反应速率是多少?

(2)反应20min后，底物浓度为多少？解：已知米氏方程及题中条件知CS0<<Km则米氏方程可表示为10min时,CS=3.4×10-5,代入上式可得：Vmax=(0.01×ln10)/10=0.0023molL-1min-1当t=20min,lnCS=lnCS0-Vmaxt/Km

=ln(3.4X10-4)-0.0023X20/0.01

CS20min=3.42X10-6mol/L2.2.3底物抑制动力学Question:Isthereanyphenomenawhensubstrateinhibition?底物抑制现象？EES+SXPSESS定义：在底物浓度增加时，反应速率不增反降，这种由底物浓度增大而引起反应速率下降的作用称之为“底物抑制作用”。SEShasnotactivity三元复合物EnzymeisconsumedSubstrateinhibitionmechanism（底物抑制机理）Induction：Keypoints：平衡假设ExpressionofcSESKSI：底物抑制的解离常数Fromequation（1），（2），（3）,thefollowingexpressionscanbeobtained:快速平衡法推导动学方程：式中:Namely,thenorNamely,thenorDiscussions：LowsubstrateconcentrationTheoriginMichaelis-Mentenequationobtained,thusnoinhibitionobserved.HighsubstrateconcentrationTheinhibitioneffectisdominant.Howtodeterminetheo