分子生物学第三次课

分子生物学第三次课第1页，共66页，2023年，2月20日，星期三原核生物染色体外裹着稀疏的蛋白质，这些蛋白质与DAN的折叠、复制、重组及转录有关。真核生物DNA和蛋白质完全融合在一起，蛋白质与DNA的质量比为2：1，蛋白质包括组蛋白和非组蛋白染色体的倍数：原核生物染色体一般为单倍体，大多只带有单拷贝基因每个基因序列几乎都与它所编码的蛋白质呈线性对应关系真核生物除性细胞外染色体都是二倍体，每个基因都有2个拷贝DNA与蛋白质的关系第2页，共66页，2023年，2月20日，星期三2.原核生物基因组原核生物基因组特点：基因连续，没有内含子结构简练：DNA分子绝大部分用来编码蛋白质，小部分不转录DNA序列控制基因表达存在转录单元：原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因丛集在基因组的一个或几个特定的部位，形成功能转录单元。并被一起转录为含多个mRNA的分子，叫多顺反子mRNA.重叠基因：原核生物中的一些细菌和动物病毒中有重叠基因，即同一段DNA能携带两种不同的蛋白质信息。如：ФX174是一种单链DNA病毒，含有9个重叠基因，有几种情况：一个基因完全在另一个基因里，部分重叠，两个基因只有一个碱基重叠。原核生物基因组具有单个复制起点第3页，共66页，2023年，2月20日，星期三染色体DNA蛋白质组蛋白非组蛋白第4页，共66页，2023年，2月20日，星期三3.真核生物染色体中的蛋白质蛋白质组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4非组蛋白组蛋白的特征：进化上极端保守，尤其是H3、H4，没有组织特异性，仅发现鸟类两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5,精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白。肽链上氨基酸分布不对称，碱性氨基酸分布在N端，疏水基团在C段。组蛋白的修饰作用，包括甲基化，乙酰化、磷酸化、及糖基化修饰作用发生在细胞周期的特定时期和组蛋白的特定位点上。MG1G2S第5页，共66页，2023年，2月20日，星期三组蛋白修饰的生物学意义：乙酰化、甲基化修饰能为相关调控蛋白提供附着位点，一般的乙酰化能选择性使某些染色质区域的结构从紧密变得松散，开放某些基因转录，甲基化和可逆磷酸化的调节在信号转导过程中有重要的作用，是细胞生命活动的调控中心第6页，共66页，2023年，2月20日，星期三4.真核生物基因组DNA真核生物基因组比较大，包括核基因组和细胞器基因组含有大量的重复序列，功能DNA序列大多数被不编码非功能DNA隔开使基因组不连续真核生物的基因为单顺反子真核生物基因组有多个复制起点第7页，共66页，2023年，2月20日，星期三5.核小体的结构：核小体由H2A、H2B、H3、H4各两分子组成的八聚体和大约200bpDNA组成，八聚体在中间，DNA分子盘绕在外，H1在核小体的外面。一个核小体中组蛋白和DNA比例是200bpDNA,H2A、H2B、H3、H4各两个，H1一个。第8页，共66页，2023年，2月20日，星期三DNA-------核小体--------螺线管----------超螺旋--------染色体

11nm30nm300nm1400nm7倍6倍40倍5倍200bp约为68nm第9页，共66页，2023年，2月20日，星期三染色质和核小体DNA和组蛋白有怎样的关系？几个有趣的发现：染色质DNA的Tm值比纯DNA高，说明染色质中的DNA可能与蛋白质分子相互作用染色质状态下DNA聚合酶和RNA聚合酶催化DNA的复制和转录低于自由DNA的反应DNA酶1对染色质DNA的消化慢于对纯DNA的消化染色质在电子显微镜下为核小体组成的念珠状结构核酸酶处理染色质得到片段的长度均为200bp的倍数第10页，共66页，2023年，2月20日，星期三染色体上的非组蛋白：非组蛋白约占组蛋白的60%-70%，种类约有20-100种之间，非组蛋白包括酶类RNA聚合酶及与细胞分裂有关的酶，核孔复合体蛋白、肌动蛋白等。特性：具有多样性和异质性，不同组织的细胞其种类和数量都不相同对DNA具有识别特异性，能识别特异DNA序列，识别信息来源于DNA序列本身，识别信息促在于双螺旋的大沟内具有多种动能，参与表达调控，染色质高级结构的形成第11页，共66页，2023年，2月20日，星期三

物种基因组大小/Mb单倍体染色体数目

人330023

豌豆48007

线虫15511

鼠260021

玉米250010

水稻43024

果蝇2784

部分动植物及细菌染色体数第12页，共66页，2023年，2月20日，星期三C值矛盾C值指的是生物单倍体基因组所含的DNA总量C值矛盾是指基因数量与生物体进化程度不成正比是人类基因组的200倍是人类基因组的12倍第13页，共66页，2023年，2月20日，星期三

生命的特征是什么？生命的特征就是“活的”。生命现象最本质的内容就是自复制（自我繁殖和自我组织）。一个受精卵为什么变成一朵鲜花或一头大象？生物的性状是由什么决定的？又是怎样代代相传的呢？人也是从受精卵逐渐发育成完整的个体的，而决定一个人将来长成什么样子的生命蓝图就储存在受精卵的DNA中。DNA（或RNA）携带着决定蛋白质结构的遗传信息而且代代相传，这就我们遗传信息的传递（即复制、转录和翻译）要讨论的内容。为什么要讲复制？就是要了解：子代DNA为什么能真实获得亲代DNA的遗传信息；复制是怎样进行的？第14页，共66页，2023年，2月20日，星期三

第三节DNA的复制

DNA复制可能的几种方式

全保留式半保留式混合式第15页，共66页，2023年，2月20日，星期三密度梯度实验

——实验结果支持半保留复制的设想含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液第二代梯度离心结果第16页，共66页，2023年，2月20日，星期三AGAACTTTCTTGAAAGAACTTTCTTGAATCTTGAAAGAACTT母代DNA子代DNA第17页，共66页，2023年，2月20日，星期三

按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性,是物种稳定性的分子基础。1.半保留复制的含义及意义

当DNA进行复制时，双螺旋结构解开成两条单链，各自作为模板合成与之互补的新链。在子代DNA双链中，一条是来自于亲代，另一条完全重新合成。第18页，共66页，2023年，2月20日，星期三3.DNA复制的起点方向和速度生物的复制单位称为复制子。DNA复制由固定起始点开始，从一个DNA复制起点开始最终由这个起点起始的复制叉完成的片段。一个复制子有一个起点，细菌、病毒、线粒体DNA分子都为单个复制子，而真核生物可以同时有多个复制起点以既是说真核生物包含多个复制子第19页，共66页，2023年，2月20日，星期三3x13bp直接重复序列保守序列GATCTNTTNTTTTDnaA结合位点，4x9bp保守序列TTATCCACA大肠杆菌DNA复制起始点保守序列分布图1、20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC的4

个9bp保守序列结合2、在复制起始复合物的作用下使3x13bp重复序列变形，形成开链（1）起始位点的序列特征：第20页，共66页，2023年，2月20日，星期三第21页，共66页，2023年，2月20日，星期三复制的起始需要解决两个问题：DNA解开成单链，提供模板生成引物，提供3-OH末端第22页，共66页，2023年，2月20日，星期三复制时DNA双链解开分成二股单链‚新链沿着张开的二股单链生成，复制中形成的这种Y字形的结构称为复制叉

双向等速复制为主（2）复制叉（replicationfork)3553新链3535亲代DNA复制方向第23页，共66页，2023年，2月20日，星期三(3)引物合成DnaAn,n',n'‘,DnaB、C和IDNA拓扑异构酶引物酶OHSSB3535第24页，共66页，2023年，2月20日，星期三真核生物的染色体庞大、复杂，有多个复制起始点，同时进行多个DNA片段的复制。两个起始点之间的DNA片段，称为一个复制子（replicon）。真核生物也是双向等速复制为主。第25页，共66页，2023年，2月20日，星期三DNA聚合酶催化游离的脱氧核苷酸结合到新链3’末端，使其不断延长5’3’5’DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol(4)

复制延长的过程dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTP第26页，共66页，2023年，2月20日，星期三聚合反应的特点：

聚合反应具有方向性:53DNA聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的3-OH逐个添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。第27页，共66页，2023年，2月20日，星期三DNA聚合酶

DNA聚合酶催化的反应dTTP3'(dNMP)n+dNTP(dNMP)

n+1+ppi3'

ATGCAATTGC5'||||5

TACGppiT

全称：依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase,DDDP）第28页，共66页，2023年，2月20日，星期三大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III的性质比较性质聚合酶I聚合酶II聚合酶III3’-5‘外切5’-3’外切新生链合成相对分子量/103细胞内分子数生物学活性++-1034001+--90？0.05+--90010-2015第29页，共66页，2023年，2月20日，星期三5’AGCTTCAGGATA3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAGCGAC5’35

外切酶活性

53外切酶活性?DNA损伤修复，冈崎片段引物去除能辨认错配的碱基对，校对作用核酸外切酶活性

第30页，共66页，2023年，2月20日，星期三前导链(leadingstrand)

顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行的，所得到一条连续片段的子链。5’3’3535解链方向

复制的半不连续性第31页，共66页，2023年，2月20日，星期三3535解链方向复制方向与解链方向相反，须等待解开足够长度的模板链才能继续复制，所得到一条由不连续片段组成的子链。

随从链

(laggingstrand)

冈崎片段（Okazakifragment）

3’5’3’3’5’第32页，共66页，2023年，2月20日，星期三5`5`5`DNaseIOHP5`DNA聚合酶dNTP5`5`PATPADP+Pi5`5`DNA连接酶

随从链上不连续性片段的连接第33页，共66页，2023年，2月20日，星期三（5）复制的终止到达终止子序列（Ter）时，Ter-Tue复合物使DnaB不再将DNA解链，阻止复制叉迁移。相反方向的复制叉到达后停止复制其间少量未复制序列由修复方式填补拓扑异构酶IV作用下复制叉解体，释放子链。第34页，共66页，2023年，2月20日，星期三真核生物复制的特点真核生物的每条染色体上有多个复制起始点，如酵母17号染色体有400多个起始点，真核生物的染色体在完成复制之前各个起始点的复制不能再开始真核生物复制的起始需要起始原点识别复合物第35页，共66页，2023年，2月20日，星期三真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

引物合成在前导链延长中起主要作用DNA损伤修复中起作用在后随链复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用在线粒体DNA复制中起催化作用DNA-pol

DNA-polDNA-pol

DNA-pol第36页，共66页，2023年，2月20日，星期三DNA的半不连续复制

拓扑异构酶DNA解链酶单链DNA结合酶引发酶DNA聚合酶RnaseH降解酶DNA连接酶第37页，共66页，2023年，2月20日，星期三DAN复制为半保留复制DAN复制为半不连续复制DAN复制在特定的起始位点起始，多为双向等速进行复制1.首先拓扑异构酶解开超螺旋2.DNA解链酶解开DNA双链3.单链结合蛋白与DNA单链结合4.引物酶合成引物提供3-OH5.DNA聚合酶合成新链，一条链为前导链，另一条链形成冈崎片段6.RNA酶将RNA引物水解，DNA聚合酶将却空缺按互补配对原则合成DNA,DNA连接酶将DNA连接，形成连续的新链第38页，共66页，2023年，2月20日，星期三解链、解旋酶类

解链酶（helicase

)

——

利用

ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。

单链DNA结合蛋白（SSB）

SSBDnaBDnaC解链方向第39页，共66页，2023年，2月20日，星期三DNA拓扑异构酶（DNAtopoiSOmerase）108局部解链后第40页，共66页，2023年，2月20日，星期三引物酶和引发体引物酶(

primase

)

在模板的复制起始部位催化NTP的聚合,

形成短片段的RNA,这一小段RNA作为复制的引物（primer），提供3-OH末端,使DNA-pol能够催化dNTP聚合。依赖DNA的RNA聚合酶引物酶与其他和复制有关的蛋白质形成的复合物。

引发体（primosome）第41页，共66页，2023年，2月20日，星期三DNA复制的特点：1.DNA半保留复制2.半不连续复制3.需要引物4.双向复制5.有一定的复制起始点6.DNA复制的保真性第42页，共66页，2023年，2月20日，星期三与DNA复制有关的物质1.四种脱氧核苷三磷酸2.模板亲代DNA解链后分别作为模板进行复制3.引物合成酶4.DNA聚合酶5.DNA连接酶6.DNA解旋酶7.单链结合蛋白第43页，共66页，2023年，2月20日，星期三2.DNA复制的几种方式(1).线性DNA复制的方式多数为双向复制，多个起始位点，复制叉处有眼状结构，称为复制眼。第44页，共66页，2023年，2月20日，星期三(2).环状DNA复制方式A.θ复制第45页，共66页，2023年，2月20日，星期三B.D-环复制单向复制线粒体，叶绿体第46页，共66页，2023年，2月20日，星期三C.滚环复制也叫σ复制

第47页，共66页，2023年，2月20日，星期三DNA复制的调控原核生物的调控，DNA链的延伸速度恒定，复制叉的数量决定细胞生长和增值速度。

ColEI质粒DNA的复制调控DNA编码两个负调控因子，Rop蛋白和反义RNADNA复制方向起始点RNA前体100200300400500600-500-400-300-200-100RNA1Rop基因Rop蛋白63个aaRnaseH第48页，共66页，2023年，2月20日，星期三真核细胞DNA的复制调控真核细胞的生活周期分为4个时期G1复制预备期S、复制期G2、有丝分裂准备期、M有丝分裂期真核生物复制有3个水平的调控细胞生活周期水平调控，决定细胞停留在G1期还是进入S期染色体水平，决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序起始复制复制子水平调控，决定复制的起始与否第49页，共66页，2023年，2月20日，星期三真核细胞DNA的复制调控真核细胞的生活周期分为4个时期G1复制预备期、S复制期、G2有丝分裂准备期、M有丝分裂期真核生物复制有3个水平的调控细胞生活周期水平调控，决定细胞停留在G1期还是进入S期染色体水平，决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序起始复制复制子水平调控，决定复制的起始与否MG1G2S第50页，共66页，2023年，2月20日，星期三聚合酶链式反应PCR聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术典型的PCR由（1）高温变性（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸

PCR能在（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建。第51页，共66页，2023年，2月20日，星期三课后复习题：DNA半保留复制DNA的半不连续复制复制子复制叉如果细菌环状染色体的复制是双向的，并且从固定的复制起点开始，每个复制差以16um/min的速度移动，细菌染色体长1280um,完成整个染色体复制需要多少时间？当细菌在营养丰富的培养基每20min分裂一次，也就是说第一轮复制尚未完成就开始第二轮复制，此时染色体有几个复制叉？第52页，共66页，2023年，2月20日，星期三课后复习题：DNA半保留复制DNA的半不连续复制复制子复制叉如果细菌环状染色体的复制是双向的，并且从固定的复制起点开始，每个复制叉以16um/min的速度移动，细菌染色体长1280um,完成整个染色体复制需要多少时间？当细菌在营养丰富的培养基每20min分裂一次，也就是说第一轮复制尚未完成就开始第二轮复制，此时染色体有几个复制叉？第53页，共66页，2023年，2月20日，星期三DNA损伤的原因及后果电离辐射可见光氧自由基H+烷化剂8-oxoGP/P复制错误核苷类似物mCU第