分子生物学研原核生物的基因转录及表达调控

分子生物学研原核生物的基因转录及表达调控第1页，共65页，2023年，2月20日，星期四转录(transcription)

：指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了T→U之外）的RNA单链的过程（即从DNA到RNA的过程），基因表达的核心步骤。第2页，共65页，2023年，2月20日，星期四第3页，共65页，2023年，2月20日，星期四基因表达盒结构组成

第4页，共65页，2023年，2月20日，星期四RNApolymeraeseRNA聚合酶（RNApolymerase);

启动子(Promoter);

转录起始点(startpoint);

终止子(Terminator);

上游(Upstream);

下游（Downstream);

近端(proximal);

远端(distal)第5页，共65页，2023年，2月20日，星期四第6页，共65页，2023年，2月20日，星期四三、原核生物的基因转录及表达调控1.转录机器（装置）（transcriptionapparatus）（1）RNA聚合酶（RNApolymerase）（40kD）（155kD），‘（160kD）（70kD）：specificityfactor核心酶（coreenzyme）：，‘，2全酶（holoenzyme）：，‘，2，第7页，共65页，2023年，2月20日，星期四RNApolymerase（holoenzyme）第8页，共65页，2023年，2月20日，星期四Functions第9页，共65页，2023年，2月20日，星期四原核生物RNA聚合酶的形成过程

α2+β→α2βα2β+β`→α2ββ`(coreenzyme)α2ββ`+σ→α2ββ`σ(Holoenzyme)

大肠杆菌RNA聚合酶的核心酶除含有4个多肽亚基外，还含有2个Zn原子第10页，共65页，2023年，2月20日，星期四第11页，共65页，2023年，2月20日，星期四原核生物RNA聚合酶的三维结构

第12页，共65页，2023年，2月20日，星期四全酶（Holoenzyme）

•用于转录的起始

•依靠空间结构与DNA模板结合(σ与核心酶结合后引起的构象变化)

•专一性地与DNA序列(启动子)结合

•转录效率低，速度缓慢（σ的结合

）第13页，共65页，2023年，2月20日，星期四

核心酶（CoreEnzyme）

•作用于转录的延伸过程（终止）

•依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之间）

•非专一性的结合（与DNA的序列无关）

第14页，共65页，2023年，2月20日，星期四原核生物RNA聚合酶各亚基的特点和功能

（1）σ

因子

•

负责模板链的选择和转录的起始

•

σ因子可重复使用

•

修饰RNApol构型

•

使HoloEnzyme识别启动子的SextamaBox(-35区),并通过σ与模板链结合第15页，共65页，2023年，2月20日，星期四

•不同的σ因子识别不同的启动子

E.coli中有四种σ因子（σ70、σ32、σ54、σ28）枯草杆菌中有11种σ因子

（2）α因子•核心酶的组装因子，识别启动子

•促使RNApol与DNA模板链结合α＋α2α＋β

α2β＋β′•前端α因子－－使模板DNA双链解链为单链

•尾端α因子－－使解链的单链DNA重新聚合为双链第16页，共65页，2023年，2月20日，星期四

（3）β因子•促进RNApol＋NTPRNAelongation•完成NMP之间的磷酸酯键的连接

•Editing功能（排斥与模板链不互补的碱基）

•与Rho（ρ）因子竞争RNA3’－end第17页，共65页，2023年，2月20日，星期四

Esite（elongationsiteRifR）:对NTP非专一性地结合（催化作用和Editing功能）

（4）β′因子

•参与RNA非模板链（sensestrand）的结合（充当SSB）•构成Holoenzyme后，β因子含有两个位点

Isite（initiationsite.Rifs）:该位点专一性地结合

ATP或者GTP（需要高浓度的ATP或GTP）第18页，共65页，2023年，2月20日，星期四由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点

有义DNA链结合位点（β′亚基提供）

DNA/RNA杂交链结合位点（β亚基提供）双链DNA解链位点（前端α亚基提供）

单链DNA重旋位点（后端α亚基提供）

σ因子作用位点第19页，共65页，2023年，2月20日，星期四E.coliRNApolymerase用于起始和延伸只用于起始36.5KD36.5KD151KD155KD11KD70KD第20页，共65页，2023年，2月20日，星期四三、原核生物的基因转录及表达调控1.转录机器（装置）（transcriptionapparatus）（2）启动子（promoter）聚合酶的结合位点（bindingsite），位于转录起始位点上游RNA聚合酶与启动子的结合（RNApolymerase/promoterbinding）

ClosedpromotercomplexOpenpromotercomplex，转录才能开始第21页，共65页，2023年，2月20日，星期四RNApolymerase/promoterbinding第22页，共65页，2023年，2月20日，星期四（2）启动子（promoter）Promoterstructure

共同序列（consensussequence）Pribnowbox(-10box,DavidPribnow发现)-35box

（-10box与-35box的最佳距离为171bp）第23页，共65页，2023年，2月20日，星期四第24页，共65页，2023年，2月20日，星期四Promoterstructure下调突变（downmutation）上调突变（upmutation）第25页，共65页，2023年，2月20日，星期四启动子突变如果把Pribnow区从TATAAT变成AATAAT就会使该启动子发生下降突变（downmutation）,此突变会大大降低转录水平；如果增加Pribnow区的共同序列，如将乳糖操纵子的启动子中的TATGTT变成TATATT，就会提高启动子的效率，称为上升突变（upmutation）。第26页，共65页，2023年，2月20日，星期四第27页，共65页，2023年，2月20日，星期四（2）启动子（promoter）Promoterstructure

强启动子还有一些额外的元件，如E.coli编码rRNA的rrngene中的UPelement（上游元件），可提高表达数十倍第28页，共65页，2023年，2月20日，星期四Promoterstructure第29页，共65页，2023年，2月20日，星期四（3）转录起始（transcriptioninitiation）Foursteps:FormationofaclosedpromotercomplexConversionoftheclosedpromotercomplextoanopenpromotercomplexPolymerizingthefirstfewnucleotides(upto10)whilethepolymeraseremainatthepromoterPromoterclearance第30页，共65页，2023年，2月20日，星期四Stagesoftranscriptioninitiation第31页，共65页，2023年，2月20日，星期四Thecycle第32页，共65页，2023年，2月20日，星期四第33页，共65页，2023年，2月20日，星期四转录的起始过程σ核心酶12～17bp第34页，共65页，2023年，2月20日，星期四（β亚基）第35页，共65页，2023年，2月20日，星期四模板识别（Templaterecognition）转录起始前，启动子附近的DNA双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。第36页，共65页，2023年，2月20日，星期四RNA在转录泡(transcriptionbubble)中起始合成RNAsynthesisoccursinthetranscriptionbubble第37页，共65页，2023年，2月20日，星期四随着转录泡的迁移，RNA不断被合成。其后的DNA双链体重新形成双螺旋，取代单链的RNA和DNA单链的配对，到达转录终止位点，转录复合体解体。第38页，共65页，2023年，2月20日，星期四（4）延伸（elongation）核心酶起极其重要的作用，亚基参与转录出的RNA的磷酸二酯键的形成第39页，共65页，2023年，2月20日，星期四Elongation第40页，共65页，2023年，2月20日，星期四第41页，共65页，2023年，2月20日，星期四第42页，共65页，2023年，2月20日，星期四（4）延伸（elongation）转录的拓扑学：两种假说RNApolymerase及新合成的RNA都围绕DNA旋转RNApolymerase前后的DNA反向旋转第二种假说有较多的依据：拓扑异构酶（topoisomerase）的存在第43页，共65页，2023年，2月20日，星期四Elongation第44页，共65页，2023年，2月20日，星期四（5）转录终止

（terminationoftranscription）聚合酶到达终止子（terminator）就会从模板上脱落终止子有两种（终止方式也有两种）：intrinsic(-independent)terminator(termination)-dependentterminator(termination)第45页，共65页，2023年，2月20日，星期四（5）转录终止-independenttermination

较为简单，一段反向重复序列（invertedrepeat）与一富含T的区域（T-richregioninthenontemplatestrand）即为终止信号第46页，共65页，2023年，2月20日，星期四-independenttermination第47页，共65页，2023年，2月20日，星期四（5）转录终止-dependenttermination终止子只有一段反向重复序列（能形成hairpin结构）是一种蛋白质（6聚体），可使RNA聚合酶的转录能力大大下降（具RNA-DNA解螺旋酶的作用，能解开转录复合体中RNA-DNA双链）第48页，共65页，2023年，2月20日，星期四-dependenttermination第49页，共65页，2023年，2月20日，星期四Atypicaltranscriptionunitsensestrand（有义链）=nontemplatestrandantisensestrand（反义链）=templatestrand第50页，共65页，2023年，2月20日，星期四三、原核生物的基因转录及表达调控2.基因表达调控原核生物基因表达的调控主要以操纵子（operon）的方式进行

Operon:

Agroupofcontiguous,coordinatelycontrolledgenes第51页，共65页，2023年，2月20日，星期四三、原核生物的基因转录及表达调控2.基因表达调控（1）乳糖操纵子（thelacoperon）lacZ:-半乳糖苷酶（-galactosidase）基因lacY:半乳糖苷透过酶（galactosidepermease）基因lacA:半乳糖苷乙酰基转移酶（galactosidetransacetylase）基因lacI:调节基因（regulatorygene）Operator:操纵区Repressor:阻遏子（阻遏物）Inducer:诱导物（异构乳糖，allolactose）第52页，共65页，2023年，2月20日，星期四negativecontrol第53页，共65页，2023年，2月20日，星期四三、原核生物的基因转录及表达调控2.基因表达调控（2）操纵子的发现操纵子概念的提出者FrançoisJacobJacquesMonod第54页，共65页，2023年，2月20日，星期四FrançoisJacob,JacquesMonod,etAndréLwoff,

PrixNobel1965

第55页，共65页，2023年，2月20日，星期四三、原核生物的基因转录及表达调控2.基因表达调控（2）操纵子的发现发现过程-半乳糖苷酶可被诱导（Monod,1940s）半乳糖苷透过酶与-半乳糖苷酶一起被诱导出来（发现一种不能产生半乳糖苷透过酶的突变体）发现半乳糖苷乙酰基转移酶也是同时被诱导出来发现一种组成型突变体（constitutivemutants）构建局部（部分）二倍体（merodiploid，带有野生型与组成型突变的等位基因），进行“PaJaMo”系列实验（ArthurPardee,Jacob,Monod），发现乳糖代谢基本调控规律第56页，共65页，2023年，2月20日，星期四三、原核生物的基因转录及表达调控2.基因表达调控（2）操纵子的发现研究局部（部分）二倍体所得出的发现野生型（可被诱导型）等位基因是显性的，说明野生型等位基因能产生某种物质，使得与乳糖代谢有关的基因处于关闭状态，而在被诱导后才表达推测有一种可称为阻遏物（repressor）的物质存在；组成型突变体则是产生阻遏物的基因有缺陷既然有repressor，就应该有与repressor结合的DNA序列（operator）；若operator有突变，不能与repressor结合，则是一种显性的组成型突变体第57页，共65页，2023年，2月20日，星期四WMWM隐性顺式显性第58页，共65页，2023年，2月20日，星期四WM顺式及反式显性WM显性负突变体第59页，共65页，2023年，2月20日，星期四三、原核生物的基因转录及表达调控2.基因表达调控（2）操纵子的发现结论通过阻遏基因（阻遏物）与操纵区，lacZ、lacY、lacA这3个结构基因是一起被调控的，它们组成了一