分子标记及相关的实验技术

分子标记及相关的实验技术第1页，共51页，2023年，2月20日，星期三1、几种主要分子标记简介1）RFLP标记

RFLP标记基于Southern杂交技术。限制性片段长度多态性。这种多态性是由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变引起的。第2页，共51页，2023年，2月20日，星期三基因组酶切后，产生连续的大小不一的酶切片段，电泳不能直接辨别某一片段大小的变化。利用某一基因组DNA片段或某一cDNA片段克隆为探针，通过Southern杂交进行检测。优点：共显性，重复性和稳定性好。缺点：操作复杂，成本高,需要标记探针。第3页，共51页，2023年，2月20日，星期三2）RAPD标记随机引物PCR标记。模板DNA扩增区段上引物结合位点碱基发生突变或扩增片段之间发生插入突变或缺失突变，因此表现为扩增产物的有无或片段的大小的差异。RAPD通常是显性的——片段的有无。有时为共显性——片段的大小的差异。RAPD所用引物通常为9—10个碱基，因此，PCR要用较低的退火温度（36℃）。第4页，共51页，2023年，2月20日，星期三优点：1)引物已经商品化，覆盖整个基因组，多态性高，

2)DNA量要求少，质量要求不高，操作简单。缺点：

1)通常为显性，无法区分显性纯合体和杂合体。

2)引物较短，PCR结果不稳定。第5页，共51页，2023年，2月20日，星期三3)SSR标记SSR是特异引物的PCR标记。称为微卫星或简单重复序列。重复单元为几个核苷酸，重复次数一般为10-50个。由于基本单元的重复次数不同而形成SSR座位的多态性。根据SSR座位两侧序列设计一对特异引物来扩增SSR序列。经聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较扩增带的迁移距离，就可知某个SSR座位上的多态性。优点：多态性十分丰富，共显性。缺点：引物设计比较困难。第6页，共51页，2023年，2月20日，星期三4）AFLP标记AFLP是基于限制性酶切和PCR的DNA标记。将样品DNA用限制内切酶进行酶切，再对酶切片段进行有选择地扩增，检测其多态性。第7页，共51页，2023年，2月20日，星期三

首先用两种能产生粘性末端的限制性内切酶将基因组DNA切割成分子量大小不等的限制性片段，然后将这些片段和与其末端互补的已知序列的接头连接，所形成的带有接头的特异片段用作随后的PCR反应膜板。

PCR引物5´端与酶切位点序列互补，3´端在酶切位点后增加1-3个选择性碱基，使得一定比例的酶切片段被选择地扩增，PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来分辨。优点：多态性丰富。缺点：引物需要标记。第8页，共51页，2023年，2月20日，星期三5)CAPS标记

特异引物PCR与酶切相结合的一种标记。

根据RAPD标记或RFLP标记，设计特异引物进行PCR扩增（SCAR，STS）。有时扩增片段大小无差异，此时对扩增片段进行酶切，然后再通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。揭示的是特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变异的信息。

第9页，共51页，2023年，2月20日，星期三6）SNP标记基于单核苷酸多态性的DNA标记鉴定SNP最直接的方法是通过设计特异PCR引物扩增某个特定区域的DNA片段，通过测序和遗传特征的比较来鉴定该DNA片段是否可以作为SNP标记。SNP在基因组中广泛存在，数量丰富。第10页，共51页，2023年，2月20日，星期三2、植物核酸的提取基本步骤：磨样——缓冲液浸提——抽提——沉淀核酸——70%酒精洗——溶解核酸1）DNA提取

CTAB法根据试剂不同分为

SDS法

大量制备根据实验目的不同分为小量制备第11页，共51页，2023年，2月20日，星期三1.1CTAB法CTAB是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液中(＞0.7mol/LNaCl)可溶，并且稳定存在。在低盐条件下(＜0.5mol/LNaCl)，

CTAB与核酸的复合物就会沉淀，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。当材料中多糖少时，可不用1%CTAB沉淀缓冲液来沉淀DNA，在经氯仿-异戊醇(24∶1)抽提之后，用异丙醇或乙醇沉淀DNA，使提取过程简化

用异丙醇或乙醇沉淀核酸，CTAB则溶于乙醇中。CTAB法获得的核酸质量好，完整20-40kb，RNA少。第12页，共51页，2023年，2月20日，星期三例1、CTAB法小量制备植物DNA以小麦为例：

CTAB缓冲液：

1.4M山梨醇10ml1MTris_ClPH8.022ml0.5MEDTAPH8.04.4mlCTAB0.8mlN-LSC1g

加水至100ml(1)取少许小麦叶片,放入1.5ml离心管中,加入液氮冷冻,用带尖的玻璃棒研碎。(2)加入500ul,65℃预热的缓冲液混匀,65℃水浴保温20分钟。（3）加入500ul氯仿-异戊醇（24：1），混匀。第13页，共51页，2023年，2月20日，星期三（4）15000转/分，离心5分钟。（5）吸上清到一新的离心管中，加0.6倍体积异丙醇,混匀,放置2-3分钟,15000转/分离心5分钟.(6)70%的酒精洗涤一次.(8)干燥,加50ulTE缓冲液溶解DNA,也可用水溶解。第14页，共51页，2023年，2月20日，星期三1.2SDS法是阳离子去污剂。用含有高浓度SDS的抽提缓冲液在65℃对植物细胞进行裂解后，用提高盐浓度(KAc)和降低温度(冰上保温)的办法沉淀除去蛋白和多糖，剩下的DNA再进一步纯化。第15页，共51页，2023年，2月20日，星期三例2、SDS法大量制备植物DNA（水稻）SDS-DNA提取缓冲液：

100mMTris-ClpH8.5500mMNaCl50mMEDTAPh8.01.5%SDS(1)取5g左右水稻叶片，剪成2cm左右，放入研钵中，加入液氮冷冻，研磨至细粉状。（2）将粉末导入50ml离心管中，加入10ml65℃预热的缓冲液，在65℃水浴中保温20分钟左右。中间混样2-3次。（3）离心管中加入5ml5MKAC混匀，冰浴20分钟。（4）加入10ml氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀5分钟，4000转/分离心10分钟。第16页，共51页，2023年，2月20日，星期三（5）取上清，加入等体积的异丙醇，混匀，DNA沉淀。（6）挑出DNA团，用70%酒精洗两次。（7）风干。（8）溶解于适量的TE缓冲液中或水中。（9）-20℃保存。第17页，共51页，2023年，2月20日，星期三1.3DNA质量和浓度的检测

外观：好的DNA沉淀为白色，干后透明。如果干后仍呈白色，常因蛋白较多；若呈黄至棕色，则是有多酚类杂质；呈胶冻状则含有多糖。（2）紫外分光光度法：

1)测量260nm处的紫外吸收值，用于定量，每个OD值相当于DNA浓度为50μg/mL。DNA浓度=A260×50μg/mL×稀释倍数

2)A260/A280比值若为1.80左右，则DNA比较纯;

＞1.80，则含有RNA；＜1.80，则含有蛋白质。第18页，共51页，2023年，2月20日，星期三（3）琼脂糖凝胶法

1)琼脂糖电泳后胶孔处有EB(溴化乙锭)吸收，表明有多糖和蛋白。

2)电泳呈弥散状，DNA降解。

3)未降解的DNA，电泳时用标准量的λDNA进行定量。第19页，共51页，2023年，2月20日，星期三1.4植物DNA提取注意事项(1)液氮量要足够,研第一个样时，加入液氮后，先不磨，等液氮挥发一些，研钵冻透，第二次加入液氮，研磨。防止材料融化。（2）研碎，粉面状。影响产量的关键。（3）氯仿-异戊醇（24：1）抽提时，摇晃一定要轻，减少DNA断裂。（4）CTAB法离心时，温度不能低于15℃，否则，CTAB沉淀，损失DNA。（5）溶解DNA时，避免用枪吸上吸下。（6）避免反复冻融。（7）棉花等酚类、多糖物质多的植物DNA提取时，缓冲液和分离步骤应有相应的变化。第20页，共51页，2023年，2月20日，星期三1）去除酚类：含有酚类杂质的DNA其沉淀物多呈黄色至褐色，难以溶解或溶液色深。抽提缓冲液中要加入一定量的A：防止酚类氧化的试剂：如β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、亚硫酸钠、二硫苏糖醇。B：与酚类结合的物质如PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。第21页，共51页，2023年，2月20日，星期三2）去除多糖：如果材料中含有较多多糖，一般提取方法将很难去除。多糖常与DNA共沉淀而使沉淀物呈胶冻状。A：将简易提取法所得DNA溶于TE缓冲液中后(DNA的充分溶解对于有效去除多糖和次生代谢杂质极为重要)，加入适量4mol/LNaCl，使溶液中NaCl的终浓度达到1.0～2.5mol/L，然后再次用-20℃无水乙醇将DNA沉淀出来，经洗涤风干后，溶于TE中。

B：使DNA提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入0.35倍体积的无水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀。C：沉淀DNA时，使多糖保留在溶液中。

a)高盐法：如用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5mol/LNaCl，或加NH4Ac使终浓度为10mmol/L。

b)PEG(聚乙二醇，WT8000)代替乙醇沉淀DNA：D：选择幼嫩组织。

第22页，共51页，2023年，2月20日，星期三附1：棉花DNA提取ＤＮＡ研磨缓冲液:0.1ｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ5ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ0.35ｍｏｌ/Ｌ葡萄糖2%ＰＶＰ400（聚乙烯吡咯烷酮）1%ＤＩＥＣＡ0.1%Ｖｃ0.2%β-巯基乙醇ｄｄＨ2Ｏ细胞核裂解缓冲液:2%ＣＴＡＢ;1ｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣ;ｌ0ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ;4ｍｏｌ/ＬＮａＣ;ｌ%ＰＶＰ40;1%ＤＩＥＣＡ;1%Ｖｃ;2%β-巯基乙醇;ｄＨ2Ｏ第23页，共51页，2023年，2月20日，星期三取2ｇ新鲜幼嫩的叶片放入研钵中,加入液氮后快速、充分研磨,待成极细的粉末状时迅速转入到50ｍｌ离心管中。在50ｍｌ离心管中加入10ｍｌ冰预冷的研磨缓冲液,在涡悬振荡器上充分混匀。于4℃,2700×ｇ离心20分钟,倒去上清液。在沉淀中加入5ｍｌ裂解缓冲液,在涡旋振荡器上充分混匀。于65℃水浴锅中温育30ｍｉｎ。加入5ｍｌ氯仿/异戊醇(24/1),并上下翻转以充分混合。于4℃,2700×ｇ离心5分钟。转移上层水相至一新的50ｍｌ离心管中。重复步骤7-9一次。第24页，共51页，2023年，2月20日，星期三(10)加入2/3体积的冰预冷的异丙醇,并上下翻转以充分混合,至-20℃2ｈ。(11)于4℃,1200×ｇ离心10ｍｉｎ。(12)在一新管中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液,用玻棒将ＤＮＡ转入该管(如不能直接用玻棒缠出,可离心后倒出上清,再在其中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液),放置20ｍｉｎ后稍许离心,移走上清并吸出残存乙醇,室温干(13)加入10ｍｌＴＥ(10ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌＰＨ=80,1ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ)并加入终浓度为20(ｇ/Ｌ的ＲＮａｓｅＡ,过夜。(14)风干,用50μｌＴＥ缓冲液溶解,存于-20℃备用。第25页，共51页，2023年，2月20日，星期三2)RNA提取与DNA提取相比，RNA提取的最大特点是由于细胞中RNase非常稳定，能降解RNA，必须采取措施，抑制RNase活性。第26页，共51页，2023年，2月20日，星期三2.1提取RNA主要步骤：（1）所有的玻璃器皿，都在160℃烘8小时；塑料器皿和所有用到的水都用0.5%的DEPC处理，37℃，保温2天，然后高压灭菌。（2）操作时戴一次性手套，并勤换，戴口罩。（3）取植物样品时，迅速用液氮冷冻，放-70℃保存。（4）将植物组织彻底磨碎。（5）使蛋白变性，以便使蛋白和核酸分离开来，所用试剂既能抑制Rnase活性，又能使蛋白变性。（6）将RNA与DNA和蛋白质分离出来。第27页，共51页，2023年，2月20日，星期三例1：酸性异硫氰酸胍－苯酚－氯仿抽提法

(Wadsworthetal.,1988)（1）取一定量植物材料于液氮中研碎，（2）置于3ml异硫氰酸胍提取液

(4M异硫氰酸胍，0.1M巯基乙醇,0.5%十二烷基肌氨酸钠,25mM柠檬酸钠PH7.0)中，混匀。（3）依次加入0.3ml2MNaAc（PH4.0)、3ml酸性苯酚和1ml氯仿/异戊醇,混匀。（4）4

℃，12000转/分，离心20分。（5）用苯酚/氯仿/异戊醇再抽提一次。（6）上清用等体积的异丙醇沉淀。（7）将沉淀用70%乙醇洗涤一次。稍晾干。（8）总RNA溶于无核酸酶的水中，于-70C保存。

第28页，共51页，2023年，2月20日，星期三2.2RNA电泳检测电泳检测RNA的完整性可采用变性胶或非变性胶检测.非变性胶浓度要高1.2-1.4%，电压适当增加,快速结束,可检测RNA的降解程度。变性胶中RNA分子量才与泳动速度成正比，因此，变性胶既能检测RNA的降解程度，又可检测大小。例2RNA变性胶电泳（1）试剂的配制5×甲醛凝胶电泳缓冲液：

MOPS（玛琳代丙烷磺酸）PH7.00.2MNaAc0.1MEDTA10mM第29页，共51页，2023年，2月20日，星期三上样染料:

甘油50%EDTA1mM

溴酚蓝0.4%

二甲苯蓝0.4%(2)制胶:加入0.5g琼脂糖和35ml水熔化,在通风橱中加入10ml甲醛和11ml5×甲醛凝胶电泳缓冲液,混匀,灌制变性胶.(3)向一管中加入:5×甲醛凝胶电泳缓冲液2ul

甲醛3.5ul

甲酰胺10ulRNA样品4.5ul混合后,于65℃保温10分钟,取出冰浴。（4）加入3ul上样染料，混合后点样。（5）电泳后在紫外灯下观察。第30页，共51页，2023年，2月20日，星期三（6）RNA电泳结果分析28srRNA18srRNA在变性胶上，泳动位置分别大致相当于5.1kb和2.0kb.既可作为判断分子量的大致标志;又可判断RNA完整性：当28srRNA条带亮度大约为18srRNA的两倍时,RNA很少降解;反过来，说明有一部分降解;如果没有两条带则几乎全部降解,不能用。第31页，共51页，2023年，2月20日，星期三3、PCR技术1）原理：人为地在要扩增的目的片段的两端的已知序列各设计一条引物，在含有引物、DNA合成底物（模板）、脱氧核糖核苷酸dNTP（dATP,dCTP,dGTP,dTTP）的条件下，通过高温，双链DNA变成单链DNA——变性；通过降低温度，使引物和摸板配对——退火;利用耐热DNA聚合酶,合成产物DNA——延伸。变性温度：93-94℃，30-60秒退火温度：36-60℃,30-60秒延伸温度：72℃,1.5-2分循环30-40次;最后72℃补齐10分钟。第32页，共51页，2023年，2月20日，星期三2）实验步骤例1：NPTII基因扩增（1）将模板DNA稀释100×取一0.5ul离心管,加入200ul水,加入2ul模板DNA,混匀,离心机甩一下。（2）计算n个样品所需各试剂的用量，并依次加入同一管中。水18.5ul×n10×buffer2.5ul×n10mMdNTP2ul×n10uM引物10.5ul×n10uM引物10.5ul×nTaq酶0.1-0.2ul×n

总体积:24ul×n第33页，共51页，2023年，2月20日，星期三（3）将24

×nul溶液混匀,分装成n个小管,每管24ul。（4）向每管中加入1ul模板DNA，留一管不加,做对照。（5）混匀，离心机甩一下。（6）加20ul矿物油。（7）放在PCR仪上进行扩增。扩增程序：

95℃变性3分钟；进入循环：

94℃30秒

60℃40秒

72℃1分30秒

72℃补齐10分钟。（8）扩增后，走1.2%琼脂糖凝胶电泳。第34页，共51页，2023年，2月20日，星期三3）引物设计（1）C+G含量40%-60%。（2）引物长度：15-25个碱基，上下游引物长度相差不能超过3bp。（3）引物自身配对形成茎环结构，茎的大小要小于3bp。（4）上下游引物连续互补碱基数，不能超过5，否则形成引物二聚体。（5）解链温度Tm值高于55℃。（6）3´端碱基应为G或C，但避免GC同时存在。第35页，共51页，2023年，2月20日，星期三4）严格防止污染（1）专门划分一个PCR操作区，至少在超净台中进行。（2）带手套，并勤换。（3）建立自己的一套试剂和用品。（4）模板DNA和阳性对照DNA不要在PCR区进行操作，稀释完后，离心机甩一下，以免管口溶液污染手套。（5）提取植物DNA时，尽量减少步骤，小量制备，在管中直接研磨，研磨的玻璃棒应在火上烧一下，再研另一样品。（6）严格设好对照设两个对照：一个是不加模板DNA——水一个是阴性对照——不含扩增片段的DNA第36页，共51页，2023年，2月20日，星期三5)影响PCR扩增的特异性及效率5.1)非特异扩增产物的出现(1)退火温度太低,提高退火温度高出Tm值几度。(2)过量的Taq酶、引物、dNTP、和模板DNA，适当降低这些试剂的浓度。（3）背景DNA有与引物同源的其他位点。采用槽式PCR：在两引物内侧再设计一对引物，对第一次PCR产物再进行一次PCR扩增。第37页，共51页，2023年，2月20日，星期三5.2)PCR产物扩不出带或带很浅(1)Taq酶活性不够,适当多加。(2)适当提高Mg++浓度，1.5-5mM。(3)dNTP浓度要适宜,20-200uM。(4)模板浓度:质粒DNA：10pg—几纳克，植物DNA：几纳克—几十纳克(5)适当增加变性时间或提高变性温度。(6)引物合成有问题。第38页，共51页，2023年，2月20日，星期三

第39页，共51页，2023年，2月20日，星期三4、Southern杂交技术通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成，出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。使单链聚合双链的过程称为退火或复性。将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交，通过杂交信号分析,可对DNA进行定性或定量分析。第40页，共51页，2023年，2月20日，星期三1）Southern杂交的基本步骤（1）酶解：植物总DNA酶切后，产生大小不同的连续的片段。（2）电泳：将大小不同的片段在凝胶上由大到小分开。（3）转膜：将分开后的大小片段转到杂交膜上。（4）预杂交：用非特异的DNA或蛋白质进行杂交，封闭膜，以降低探针非特异结合带来的背景。（5）探针标记：用同位素或非放射性标记对作为探针的DNA片段进行标记。第41页，共51页，2023年，2月20日，星期三探针制备：（1）缺口平移法：首先用DNAaseI在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNApolI的5`→3`外切酶活性，切去带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。（2）随机引物标记法：用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`-OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。第42页，共51页，2023年，2月20日，星期三（6）杂交：通过探针同源序列对基因组DNA中的目的片段进行检测。第43页，共51页，2023年，2月20日，星期三2）Southern杂交的具体步骤例：Southern杂交过程（水稻为例）酶切：（1）以适量的内切酶3-6u/ug和缓冲液，酶切5ug左右DNA，酶切体积40ul，37℃水浴过夜。（2）取2-3ul走电泳检查酶切效果。电泳：（3）将全部酶切产物走0.8%的琼脂糖电泳,过夜。转膜：（4）电泳后，切去周围无用的部分，切去一个小角作为标记。（5）脱嘌呤：将胶放到0.25NHCl中，大约10分钟左右，溴酚蓝变黄绿色即可，取出，用2×SSC冲洗一下。脱嘌呤目的是将大片段DNA打断，易于转移，但如果要检测的片段小于20kb，不用也可。第44页，共51页，2023年，2月20日，星期三转膜：第45页，共51页，2023年，2月20日，星期三（6）准备一个白磁盘，装入变性液（0.4NNaOH,1MNaCl）上面放一玻璃板