基因工程-实验技术篇

基因工程实验技术篇二、表达篇据受体细胞的不同可分为：1．原核表达系统：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2．真核表达系统：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。二．原核生物基因结构和表达特点三．外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：删除内含子和5’非编码区外源基因置于强启动子和SD顺序控制下维持正确开放阅读框架（ORF）mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解

四．影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：常见原核强启动子：Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。Ptac:Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。T7和T5启动子：核糖体结合位点：SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。AUG—SD间距离。AUG后的核苷酸

类型：融合型表达载体：----融合蛋白非融合型表达载体：---天然完整蛋白分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙

（一）非融合型表达载体

PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合基因主要元件：强启动子，SD，ATG：第一个密码子ATGPSDTAAMCS非融合型表达载体----pPL-LamdaPL启动子---温度诱导插入位点--HpaI（二）融合型表达载体

PSDForeignDNA融合型表达载体 C端融合基因ATGTAA N端融合基因ATGTAA位相载体----含有3种读码框的系列载体Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白—直接纯化产物切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---X因子位相载体（1）融合型载体----pGEX系列1.小分子量或易降解，或对宿主有毒的目的蛋白的表达2.GST标签纯化树脂GSTResin纯化（2）融合型载体----His融合1.His-Tag分子量小，无抗原性2.Ni-NTAResin

(His标签纯化树脂)亲和纯化

pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。

该质粒在PRPL启动子下游插入proteinG的IgGFc结合区基因片段180个碱基对，1.可用亲和层析(SPA)。简化下游工艺。2.溴化氰裂解，不用酶（3）融合型载体----IgG融合融合表达质粒pBG-2的结构（4）融合型载体----Trx融合硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx）

易于可溶性表达（三）分泌型表达载体1、主要元件：启动子和SD序列信号肽序列：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜2、优点：分泌表达，避免降解。

分泌型表达载体----pINIII-ompA1分泌型融合表达载体----pEZZ18(二）真核表达系统组成：真核表达载体受体细胞基因转移方式据受体细胞及表达载体的不同分为3种：酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统昆虫细胞表达系统1.酵母表达系统最常用的是巴斯德毕赤酵母（pichia

Pastoris)其优点为：高表达量：高稳定性翻译后修饰功能分泌表达启动子：醇氧化酶-1（AOX1）基因的启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一，用甲醇可严格地调控外源基因的表达常见的表达载体有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等，均为整合型载体2.昆虫细胞表达系统杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒(AcNPV)作为表达载体。昆虫细胞表达系统的优点：可表达较大的外源基因可表达不同生物来源的外源基因与高等生物相似的转录后加工、修饰杆状病毒具有高度宿主专一性昆虫细胞表达系统，特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全，表达量高，目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域中。

3.哺乳动物细胞表达系统由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。但利用哺乳动物细胞表达系统表达外源蛋白，其产量还不高，难以满足大规模的实际