育种出发菌的分离筛选课件

第五章育种出发菌的分离筛选向菌种保藏机构索取有关的菌株。菌种来源的途径国内外著名的菌种保藏机构有：CCCCM(中国微生物保藏管理委员会）

ATCC(美国典型菌种保藏中心）NCTC(英国国家典型菌种保藏所)IFO(大阪发酵研究所)2.

从一些发酵制品中分离目的菌株。容易筛选到较理想的菌株。

3.

由自然界采集样品中获得。如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。容易发现新的菌株资源。2023/3/312菌株分离与筛选菌株分离(separation)：是将样品中混杂生长的各种微生物通过分离技术区分开，获得所需微生物的过程。菌株筛选(screening)：在目的菌株分离的基础上，结合常规生产性能测定，选择目的产物合成能力相对高的菌株的过程。2023/3/313第一节含微生物样品的采集第二节含微生物样品的富集培养第三节微生物的分离第四节野生菌株筛选和目的产物鉴定主要内容2023/3/315第一节含微生物样品的采集2023/3/316含微生物样品的采集一、从土壤中采样1根据土壤特点采集①土壤有机质含量和通气状况2023/3/317不同土壤类型2023/3/319③地理条件

南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多。④季节条件

秋季是采样的良好季节②土壤的酸碱度2023/3/31102土壤中采样的方法选点取土装袋标记用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5-25cm处的土样10-25g，记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件2023/3/3111①局部环境条件。如：海洋、肠道、温泉、堆肥②极端环境条件。在绝大多数微生物所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下，也有少数微生物存在，这类微生物被称为极端环境微生物。三、特殊环境下采样2023/3/3113第二节含微生物样品的富集培养2023/3/3114富集(enrichment)培养：是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，并创造有利的生长条件，使目的微生物在合适的环境下迅速生长繁殖，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要菌株的过程。富集培养主要根据微生物的碳源、氮源、pH、温度、需氧情况等生理因素加以控制。2023/3/3115三、抑制不需要的菌类通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，达到富集的目的。如：硫乙醇酸钠－－造成厌氧环境，利于厌氧菌生长。抗生素－－可抑制细菌生长，用于培养霉菌。2023/3/3117被分离的微生物添加物质及其浓度被抑制的微生物放线菌放线菌酮（50），制霉菌素（50），环己亚氨（50），匹马霉素（50），丙酸钠（4mg）霉菌革兰氏阴性菌其他革兰氏阳性菌环己亚氨+多黏菌素+枯草菌素（各20单位），多黏菌素B（5）+青霉素（1）细菌放线菌酮（50-500），制霉菌素（100），优洛杀菌素（30-100）（eu-rocidin）霉菌、酵母菌原虫霉素（5）原生动物革兰氏阳性菌多黏菌素B（5）革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌青霉素（1），月桂酸钠（2mg）革兰氏阳性菌酵母菌氯霉素（100），青霉素（20）+链霉素（40），玫瑰红（50）+放线菌酮（10）细菌放线菌酮霉菌霉菌菌氯霉素（100），青霉素（20）+链霉素（40），玫瑰红（35-67）氯霉素（50）+放线菌酮（10），青霉素（100）细菌细菌、酵母菌2023/3/3118第三节微生物的分离2023/3/31192划线分离法2023/3/31213利用生化反应进行分离饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。利用某种营养缺陷型微生物作为指示菌，若待筛选菌具有将前体物转化成营养物的能力，指示菌就能围绕该菌生长。待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制指示菌生长的物质指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液2023/3/3122变色圈法：2023/3/3123脂酶产生菌的分离：可采用固体平板变色圈法。①甘油三丁酸脂为底物，罗丹明B

为指示剂，观察荧光圈；②制备维多利亚蓝乳脂琼脂培养基(pH7.0)，将样品涂布在平板上培养，阳性反应由粉红色变为蓝色。③改良双层法：平皿底层倒一层营养琼脂，把一片浸有被维多利亚蓝染色的乳脂的圆纸片铺在上面，然后覆盖一薄层含样品营养琼脂，保温培养，阳性反应为蓝色。2023/3/31254组织分离法是从一些罹病组织或特殊组织中分离菌株的方法。①对一般患病组织的分离方法取样无菌水洗涤表面消毒无菌水洗涤表面植入平板，培养镜检，分离纯化2023/3/31265特殊菌类——环保菌的分离在分离某类污染物或废弃物的降解微生物时，通常采用以该物质为唯一碳源或氮源的培养基进行富集培养，经过几个月的富集培养后，通过划线或涂布的方法进行在分离平板上分离、筛选。该法在分离苯胺、DDT、甲基对硫磷（MP）、石油、甲胺磷等污染物降解菌时取得良好效果。注意：环境污染物一般对微生物的生长有抑制作用，需要根据不同情况设计合理的筛选模型。2023/3/3129二、厌气菌的分离⑴加还原剂⑵焦性没食子酸法⑶平皿厌气培养法⑷试管厌气培养法⑸玻璃板隔绝空气培养法⑹生物吸氧法2023/3/3130厌氧培养袋厌氧培养罐厌氧工作站厌氧操作仪器2023/3/3131第四节野生菌株筛选和目的产物鉴定2023/3/3132一、初筛定义：从大量分离到的微生物中将能合成目的产物的微生物筛选出来的过程。筛选的方法有以下两种：1平板筛选用于在分离纯化阶段随机挑选的菌株，用选择性平板进行定性测定。特点：快速，简捷，效率高。2023/3/31332摇瓶发酵筛选用于经过定性筛选的菌种，通过摇瓶发酵进一步测定菌株相互之间产物活性的差异。特点：比较接近发酵罐培养条件。接种发酵制作含指示菌或底物的琼脂平板琼脂平板打孔加发酵液测透明圈2023/3/3134二、复筛将初筛得到的菌株进行发酵罐发酵，然后精确分析（如：电泳、色谱、质谱等精密仪器）测定其确切的产量水平，从而确定用于生产的菌株的过程。复筛的工作：①优化培养基成分；②注意各种培养条件对菌体量