猴源大肠杆菌病的病原分离鉴定

题目名称：猴源大肠杆菌病的病原分离鉴定目录TOC\o"1-4"\h\z\u猴源大肠杆菌病的病原分离鉴定 I摘要及关键词 I1前言 11.1大肠杆菌病病原学 11.1.1大肠杆菌的分类 11.1.2大肠杆菌的理化性质 11.1.3分子生物学 11.1.4流行病学 11.1.5预防诊断及治疗 22材料与方法 22.1材料 22.1.1病料 22.1.2主要试剂 22.1.3主要仪器设备 32.2方法 32.2.1细菌的分离纯化 32.2.2镜检实验 32.2.3生理生化实验 3糖发酵实验 3IMViC实验 32.2.4致病性实验 32.2.516SrDNA检测 4引物的设计与合成 4模板DNA的提取 416SrDNA的PCR扩增 4目的片段纯化回收 416SrDNA的连接 5连接产物的转化 5重组质粒的提取、酶切鉴定 5重组质粒测序 52.2.6药敏试验 53结果与分析 63.1病原的形态学鉴定 63.2糖发酵结果 63.3IMViC实验结果 63.4致病性实验结果 63.516SrDNA检测结果 73.5.116SrDNA序列的PCR扩增 73.5.2重组载体酶切鉴定结果 73.5.316SrRNA的序列分析 83.6药敏试验 84讨论 84.1大肠杆菌的致病性 84.216SrRNA的鉴定方法 94.3防治 9参考文献 10致谢 11PAGE11猴源大肠杆菌病的病原分离鉴定姓名:苏烜专业:生物技术（中外合作办学）指导教师:董浩摘要:从疑似患有大肠杆菌病的已剖检死亡幼猴肝脏内获取样本，革兰氏染色显阴性，将样本接种于鉴别培养基进行分离与鉴定，并进行常规形态观察、生化特性、药敏和致病性研究，以及16SrDNA测序实验等。测序结果与GenBank中E.coli16SrDNA序列比对，结果表明E.coli与检测到的菌株同源性达到95%以上，表明E.coli是导致幼猴死亡的病菌。关键词:大肠杆菌；药敏试验；16SrDNAPathogenIsolationandIdentificationofE.colibacillosisfromMongkeysName:SuXuanMajor:BiotechnologyTutor:DongHaoAbstract:SampleswereobtainedfromtheliverofdeadyoungmonkeyssuspectedtohavebeennecropsywithEscherichiacoli,andtheresultsshowednegativeGramstaining.Thesampleswereinoculatedindifferentialmediumforisolationandidentification,androutinemorphologicalobservation,biochemicalcharacteristics,drugsusceptibilityandpathogenicity,and16SrDNAsequencingexperimentswereconducted.ThesequencingresultswerecomparedwithE.coli16SrDNAsequenceinGenBank,andtheresultsshowedthatE.colihadmorethan95%homologywiththedetectedstrains,indicatingthatE.coliwasthepathogenthatcausedthedeathofyoungmonkeys.Keywords:EscherichiaColi;drugsensitivitytest;16SrDNA1前言1.1大肠杆菌病病原学1885年由Escherich发现的大肠埃希氏杆菌（Escherichiacoli，简写为E.coli）俗称大肠杆菌，属于原核生物，分布极广，存在于自然界的各个角落，它是人类和动物肠道中存在最广且最著名的细菌。是主要寄生在大肠内的正常菌群。它是一种重要的人畜共患病原体，能动，两端钝圆，无孢子，革兰氏阴性短杆菌，多数无毒且不致病，少数有毒，可引起疾病。对人和动物具有致病性的不同菌株与正常寄生在肠道内的非致病性大肠杆菌在染色反应、培养特性、生化反应和形态特征方面均无差异。然而，最近的研究表明，它们似乎在质粒编码和抗原结构上有一定的差异1.1.1大肠杆菌的分类病原性菌可分为5类据其致病机理，将：enteropathogenic、enteroinvasive、enterotoxigenic、enteroagreganver和enterohemorrhagic粘附素是在ETEC菌株中常见的，如P4、F5、F6(987P)或F41，可导致小禽畜腹泻。ETEC还产生细胞毒素、耐热肠毒素(ST)、p型溶血素、神经毒素和不耐热肠毒素(LT)，这些都参与了ETEC菌株的致病作用在动物肠道外疾病方面，脑膜炎多与K1型有关，而败血症和尿道感染则多由某些特定血清型菌株引起。1.1.2大肠杆菌的理化性质大肠杆菌属于肠杆菌科，多数有周身有鞭毛，会运动。致病性大肠杆菌多数有菌毛如F1、P菌毛等。其代谢类型为异养厌氧型，在含有无机盐、葡萄糖、胺盐的培养基上生长情况良好，最适宜的生长温度为37摄氏度，在42-44摄氏度条件下仍能正常生长，生长温度范围为15-46摄氏度，在液体培养基中呈现均匀浑浊生长模式。可使葡萄糖产酸产气、不产生硫化氢，不利用柠檬酸盐，一般可发酵乳糖产酸，不分解糊精、淀粉、肌醇和尿素。1.1.3分子生物学大肠杆菌的抗原结构复杂，由O抗原、K抗原、H抗原及抗原F组成。截止至目前被发现的抗原至少有（O）173种、（K）1O3种、（H）6O种、F抗原也正逐步被鉴定出来。据大肠杆菌的抗原O、K、H的鉴定结果，可以得出大肠杆菌的抗原结构式，即为血清型。目前来讲菌毛抗原（F）多在血清学鉴定中使用，最常见的血清型K88，K99，分别被称为为F4和F5型。在引发人畜肠道疾病的血清型中，可被分为有肠毒素性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌和肠侵袭性大肠杆菌等等，菌毛抗原在毒素型大肠杆菌中较为常见。对禽有致病性的O型抗原血清型在170种中约占1/2左右，O1、O2、O35、O78四个血清型是最多的。1.1.4流行病学由致病性大肠杆菌引起的多种不同动物的不同疾病或类型被称之为大肠杆菌病，主要表现在动物的局部或全身性大肠杆菌感染、毒血症、腹泻、败血症等。这种病的主要传染源有病畜(禽)和带菌者，其传染方式包括消化道感染、子宫内或脐带感染、呼吸道感染等。1.1.5预防诊断及治疗要预防该病，需加强动物管理与饲养，应对气候剧变采取预防措施，在大型养殖场内，畜(禽)群数量过多、换气通风不及时、饲养用具及环境消毒不及时彻底等都是导致该病的主要原因。本研究通过对送检的幼猴肝脏致病菌进行分离和鉴定、生化实验、致病性实验、药敏试验、16SrRNA测序试验，以期为该种疾病的防控提供技术上的支持，并为东北虎园在幼猴饲养与管理方面提供一些合理性意见。对于送检的幼猴所体现出的临床症状如下：发病幼猴精神不振、四肢无力、食欲减少,体温一般正常,没有力气登上支架,常在地面留滞,严重者拒绝吃东西,2～3天内死亡。剖检死猴时明显的回肠、结肠粘膜淤血、水肿可以被看到，回肠部分则会呈现强烈的弥漫性出血,肠壁变薄,肠内有大量黄色粘液[2]。2材料与方法 2.1材料2.1.1病料一只幼猴病料，来自长春市东北虎园，采自死亡幼猴肝脏。2.1.2主要试剂表1-1试剂及来源Table1-1TheReagentsandSources试剂公司细菌基因组DNA提取试剂盒北京索莱宝科技有限公司质粒小提试剂盒北京索莱宝科技有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒北京索莱宝科技有限公司HAN

WEI细菌微量生化反应管杭州微生物试剂有限公司大肠杆菌IMViC生化鉴定盒杭州微生物试剂有限公司药敏片杭州天和试剂公司麦康凯培养基青岛高科园海博生物技术有限公司马丁培养基青岛高科园海博生物技术有限公司伊红美蓝培养基青岛高科园海博生物技术有限公司PCR所需试剂TARAKA生物公司pMD-18T-simple载体TARAKA生物公司DL2000MakerTARAKA生物公司2.1.3主要仪器设备表1-2材料与方法Table1-2MaterialsandMethods材料公司超净工作台上海博讯实业有限公司医疗设电热恒温干热箱（DK-8D）天津市泰斯特仪器有限公司高压灭菌锅（MLS-3780）SANYO离心机（D78532）Germany电子天平（AUY220）SHIMADZU电热恒温水槽（DK-8D）上海精宏实验设备有限公司PCR扩增仪（TC-48/T/Ha）杭州朗基科学仪器有限公司电泳仪（DYY-10C）北京市六一仪器厂凝胶成像仪（LMS-26E）U.S.A微波炉Galanz显微镜GNOEC2.2方法2.2.1细菌的分离纯化取死猴肝脏标本接种固体McConkey培养基、固体Martin培养基和固体伊红美兰培养基。在37摄氏度培养箱中培养二十四小时。第二天，选择菌落接种于液体Martin培养基上，180rpm摇床上进行纯培养。2.2.2镜检实验以无菌操作采取死亡幼猴肝脏内样品制取涂片，革兰氏染色后镜检。2.2.3生理生化实验糖发酵实验用接种针挑取新鲜纯培养的菌落分别接种于微量生化反应管，接种的生化反应管内分别为Glucose,lactose,mannitol,maltose,sucrose，其中sucrose生化反应管需密封处理，随后将接种好的生化管捆绑好，并置于三十五摄氏度恒温箱孵育二十四小时，观察并记录结果。IMViC实验（1）打开西林瓶前，用75%酒精棉在西林瓶表面消毒，在无菌条件下，按照铝盖上的箭头方向打开铝盖，随后开启西林瓶胶塞。（2）在产气EC汤管中接种伊红美蓝平板，37摄氏度培养24小时，在平板上挑取有可能的菌苔接种在营养琼脂斜面,37摄氏度培养24小时。将斜面培养物移到每种微量生化管内，将已接种完毕的西林瓶套上胶塞，用全塞，放置于适宜的瓶架中，放37摄氏度培养箱中培养。2.2.4致病性实验取0.2ml12h液体培养后腹腔注射3只小鼠。同时以3只小鼠为空白对照，腹腔注射马丁液体培养基，观察死亡及发病率[11]。2.2.516SrDNA检测引物的设计与合成参考GenBank收录的大肠杆菌16SrRNA基因序列,借助DNAStar软件找出保守序列[1,5]，利用Premier5.0软件设计1对引物,由上海生工生物公司合成。引物序列如下:上游引物GPV-VP-PCR-1F5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；下游引物GPV-VP-PCR-1R5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。扩增片段长度约为1700bp左右。模板DNA的提取取细菌培养液1毫升，12000rpm离心1分钟，弃上清。向菌体中加入200微升溶液A，用移液器吹打或轻微摇晃震荡使菌体充分悬浮向悬浮液中加入20微升的RNaseA（10mg/mL）,充分颠倒混匀，室温放一刻钟至半小时。向管中加入20微升的蛋白酶K（10mg/mL），充分混匀，55摄氏度60分钟，消化期间颠倒离心管混匀数次，至样品消化完全，此时菌液呈透明浆糊状。向管中加入200微升溶液B，翻转，出现白色沉淀，75摄氏度放置30分钟。向管中加入200微升无水乙醇，充分混匀，出现絮状沉淀，将所有产物都加入到吸附柱中，静放2分钟。12000rpm离心2分钟，丢弃无用液体，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600微升加过无水乙醇的漂洗液，12000rpm离心1分钟，丢掉无用液体，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600微升漂洗液，12000rpm离心1分钟，丢掉无用液体，将吸附柱放入收集管中。12000rpm空离2分钟，将吸附柱敞口置于室温或50摄氏度温箱中放置几分钟。将吸附柱放于干净离心管中，向吸附膜中央悬滴100微升经65摄氏度水预热的洗脱液，室温放置五分钟，12000rpm离心一分钟。离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置二分钟，12000rpm离心二分钟，得到高质量的细菌基因组DNA。【22】16SrDNA的PCR扩增PCR反应体系为二十五微升，其中上游引物0.5微升,10×PCRBuffer2.5微升，下游引物0.5微升，DNA模板占2微升，,Taq酶0.5微升4×dNTPs2微升,ddH2O11微升。PCR反应扩增条件[8]：九十五摄氏度预变性5分钟，九十四摄氏度变性1分钟，五十五摄氏度退火1分钟，七十二摄氏度延伸1.5分钟，三十五个循环，再七十二摄氏度延伸十分钟，4摄氏度结束反应。同时设参考菌株阳性、无模板对照[13]。目的片段纯化回收取PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。将单一DNA条带从琼脂糖凝胶中取用，放入干净的离心管中，称重。向胶块中加入3倍单位体积溶胶液，放十分钟在五十五摄氏度水浴。将得到的溶液注进一个吸附柱中，13000rpm离心六十秒，倒掉收集管中的无用液体，将吸附柱重新放入收集管中。向吸附柱中加入700微升漂洗液,13000rpm离心六十秒，丢掉无用液体，将吸附柱重新放入收集管中。向吸附柱中加入五百微升漂洗液，13000rpm离心60秒倒掉废液。将离心后的吸附柱放回收集管中，13000rpm离心2分钟。将吸附柱方到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65℃预热的洗脱液，室温放置2分钟，13000rpm离心2分钟后收集DNA溶液。【23】16SrDNA的连接取胶回收纯化的目的片段DNA4.5微升，pMD18-T-sample载体半微升，solution连接液五微升，十六摄氏度连接过夜，即可获得目的产物。连接产物的转化取DH5α感受态细菌冰上溶解三十分钟。加入五微升连接产物至感受态细菌，混匀，冰上放置三十分钟。四十二摄氏度热激九十秒,置冰上二分钟。加入八百微升LB（感受态每管200微升），混匀，三十七摄氏度180rpm复状一个小时。取二百微升涂布在含抗生素的LB平板上三十七摄氏度培养过夜。次日挑取菌落。重组质粒的提取、酶切鉴定提取重组质粒：取4毫升细菌培养物12000rpm离心一分钟，最大限度去除上清。在有菌体沉淀的离心管中注入250微升溶液I，利用移液管或旋涡振荡器去除悬浮细菌细胞沉淀。向离心管中注入250微升溶液II，轻柔地上下旋转八次，使菌体可以充分破裂分解。向离心管中加入350微升溶液III，立刻轻柔的上下翻转八次，充分混合均匀，此刻会有白色絮状沉淀出现，12000rpm离心十分钟。将得到的上清液加入吸附柱中，室温放置二分钟，12000rpm离心一分钟，倒掉管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中注入700微升已加入无水乙醇的漂洗液，12000rpm离心一分钟后弃掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。随后向吸附柱中加入500微升漂洗液12000rpm离心一分钟，弃掉废液，将吸附柱放入收集管中。12000rpm离心二分钟，将吸附柱打开开口放于常温。将吸附柱放入一个干净的离心管中，在吸附膜中央悬空滴加50微升经65摄氏度水浴预热的洗脱液，室温放置一分钟，12000rpm离心一分钟。将得到的洗脱液重新加入吸附柱中室温放置一分钟，12000rpm离心一分钟。【24】酶切鉴定：取十微升上述质粒，用酶BamHI、HindIII在三十七摄氏度的条件下进行双酶切二个小时，然后跑电泳得到结果后做分析。重组质粒测序上海生工生物公司测序20微升的重组质粒送去。将测序得到的16SrRNA基因序列通过NCBI检索系统http//Blast进行同源性分析,使用ClustalW软件与从GenBank数据库中获得的相似菌株[1]。2.2.6药敏试验按K-B纸片扩散法将被检细菌仔细涂于琼脂平板上，室温放置10分钟后，每隔一定距离贴上药敏片，次日观察结果，测量抑菌圈大小，记录实验数据。所选用抗生素包括：卡那霉素，阿莫西林，头孢拉啶，头孢噻吩，头孢唑林，头孢曲松钠，利福平，头孢噻肟，复方新诺明，环丙沙星，庆大霉素诺氟沙星，氨苄西林，四环素。结果判断依据《纸片法抗菌药物敏感试验操作标准(第四版)》进行[10]。3结果与分析 3.1病原的形态学鉴定McConkey琼脂平板[1]上形成中等大小、圆形、光滑、边缘湿润、有序的红色菌落。在伊红美兰培养基上，观察到带有紫黑色金属光泽的圆形菌落[4]。在坚硬的马丁培养基上，有整齐、光滑、湿润、透明的圆形菌落。革兰氏染色后镜检示革兰氏阴性，短杆状，两端略圆，多为单一，也有成对或聚集。从形态学染色和培养特性来看，与大肠杆菌[1]的特性一致。3.2糖发酵结果表2-1糖发酵结果Table2-1TheResultsofSugarFermentation项目葡萄糖乳糖麦芽糖甘露糖蔗糖现象产酸产气产酸产气产酸产气产酸产气未发酵结果＋＋＋＋－注：“+”为阳性，“-”为阴性。Note：“+”PresentsPositive，“-”PresentsNegative根据上表结果分析，与E.coli生理生化特性相符。3.3IMViC实验结果表2-2IMViC实验结果[12]Table2-2TheResultsofIMViC项目吲哚试验M.R试验V-P试验枸橼酸盐试验现象玫瑰红红色无色黄色结果++--注：“+”为阳性，“-”为阴性。Note：“+”PresentsPositive，“-”PresentsNegative3.4致病性实验结果腹腔注射菌液16小时后，小白鼠全部死亡；作为对照组的小白鼠观察10天仍存活[11]。从死鼠心脏、肝脏和腹水中分离细菌，观察细菌的形态、大小和革兰氏染色。结果与从猴肝中分离到的细菌结果一致，但在正常对照小鼠中未见相应的细菌生长。解剖尸体可见肠出血，肝肿大，周围梗死，针状大小的出血点和表面坏死点，脾脏暗黑色，肠严重肿胀，内容物薄，心包充血，肺出血，脾肿大，肾肿大，尿酸沉积，解剖后观察十二指肠出血性肠炎。[25]3.516SrDNA检测结果3.5.116SrDNA序列的PCR扩增对致幼猴死亡的大肠杆菌用特异性引物进行PCR扩增，得到16SrRNA序列，扩增所得片段大小约为1.7kb，条带单一、无明显非特异性扩增现象，在1700bp左右有一条特异性条带，与目的条带大小一致[1]，见图1。图1:PCR扩增结果。注：1为16SrDNA基因条带，2为DL2000MarkerFig.1:TheResultsofPCR.Note：1Presents16SrDNAGeneBand,2PresentsDL2000Marker3.5.2重组载体酶切鉴定结果PCR产物连接转化后获得阳性重组质粒，经酶HindIII、BamHI酶切得到两条条带，分别与pMD18-T-sample载体和目的基因的大小相符，证明载体构建无误，见图2。图2:PCR扩增结果。注：1-3为阳性质粒，4为DL2000MarkerFig.2：TheResultsofPCR.Note:1-3PresentsPositivePlasmid,4PresentsDL2000Marker3.5.316SrDNA的序列分析根据生物公司测定序列，实验得到的16SrDNA片段长度为1716bp,本次分离的猴源大肠杆菌与GenBank中部分菌株序列的同源性高达95%以上。3.6药敏试验经过观察与测量，药敏试验结果见表2。由对比分析可得如下结论：在使用药物治疗大肠杆菌病时，氨苄西林、阿莫西林、头孢噻吩、头孢唑林、卡那霉素、四环素、利福平、复方新诺明均有不同程度的抗药性。所以，应选择敏感性药物，轮换使用头孢拉啶、头孢曲松钠、庆大霉素、头孢噻肟和氟苯尼考对该病进行按疗程用药治疗，临床试验效果显著。表3药敏试验结果[5～7]Table3TheResultsofDrugSensitivityTest抗菌药物名称代号抑菌圈直径结果氨苄西林AMP7耐药阿莫西林AMX8耐药头孢拉啶CED20极度敏感头孢噻吩CF10耐药头孢唑林CZ8耐药卡那霉素K9耐药头孢曲松钠CFX21极度敏感头孢噻肟CTX23极度敏感环丙沙星CIP14中度敏感庆大霉素GEN22极度敏感氟苯尼考FF16高度敏感诺氟沙星NOR12中度敏感四环素TBT6耐药利福平R9耐药复方新诺明SXT10耐药4讨论4.1大肠杆菌的致病性此次从幼猴肝脏中分离出的大肠杆菌，具有一定的致病性，与多方面的研究进行对比分析，发现大肠埃希氏菌是猴肝脏中的正常菌群。由于外界环境及各方面条件（如喂养等）的改变，破坏了菌群生长状态的平衡，致使小猴发病，出现肠管鼓气、肠壁变薄、回肠、结肠粘膜淤血、水肿、回肠弥漫性出血等现象，最终引起幼猴突然死亡。4.216SrRNA的鉴定方法有“细菌化石”之称的0细菌16SrRNA基因[1]，它是原核生物核糖体中30S亚基的组成部分，具有与原核生物核糖体大亚基中的23SrRNA相似的结构决定功能，可作为核糖体蛋白质结合的架构，同时16SrRNA能通过氢键与23SrRNA结合，增强原核生物70S核糖体一大一小两个亚基（50S亚基与30S亚基）结合时的稳定性。由于不同种的真细菌与古细菌间的16SrRNA基因（16SrDNA）是高度保守的，16SrDNA也常被用于对各种生物进行的系统发育学方面的研究。长期以来，对病原菌的分离鉴定都采用传统方式，而传统方式的分离鉴定特异性和灵敏性都比较差，影响实验的准确性，自PCR技术的问世，在很大程度上解决了这一问题。PCR技术能够对体外的DNA片段进行分析，对细菌进行遗传进化的角度和分子水平角度的鉴别，而通过对其相应的DNA序列进行测定，通过同源性比对，可确定其所属种群及与不同菌属之间的差异，根据PCR扩增16SrRNA基因，可探知幼猴的致病因子，从遗传进化的关系来看，该菌有可能是猴致死的潜在病原菌。4.3防治药敏实验证实在治疗该大肠杆菌病时，建议交替使用敏感性药物头孢拉啶、头孢曲松钠、头孢噻肟、庆大霉素、和氟苯尼考，同时对该保护区内的猴子加强管理[2]，注意饲养，一旦出现类似病情，需尽早处理。因此，本研究为该保护区其他猴的健康生长提供预防保障有重要意义。参考文献[1]贺思利.新疆哈萨克族高血压病患者外周血T淋巴细胞NFAT信号通路相关[D].新疆医科大学,2016.[2]张文波冷闯邓舜洲蒋新华余根莲何后军.致病性产H_2S大肠杆菌和产气肠杆菌的分离与鉴定[D].黑龙江畜牧兽医,2013.[3]杨慧芳.山西省非综合征型耳聋患者耳聋基因的检测分析[D].山西医科大学,2015.[4]刘小立.HCN离子通道起搏功能的分子基础[D].山东师范大学,2008.[5]胡婧.RepPCR对牛舍环境中产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌溯源的研究[D].黑龙江八一农垦大学,2013.[6]杨亮.基因激活基质诱导脂肪干细胞向软