实验十一蛋白质含量的测定

实验十一蛋白质含量的测定第1页/共16页实验十一蛋白质含量的测定

第2页/共16页一、目的要求1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理2.掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度的操作技术

二、原理第3页/共16页微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。第4页/共16页Folin—酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度

蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。第5页/共16页紫外分光光度法测定蛋白质浓度

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。第6页/共16页总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninicacid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/ml；MicroBCA试剂测定范围是0.5-20μg/ml快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝第7页/共16页

基本原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。第8页/共16页BCA蛋白质检测流程：

第9页/共16页考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度

考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。第10页/共16页CoomassieDye-Based蛋白质定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassieG-250Protein-DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+第11页/共16页三、操作方法

1.标准曲线制作取14支试管，分两组按下表平行操作。试管编号0123456标准蛋白含量(g)0102030405060标准蛋白溶液(mL)00.010.020.030.040.050.06待测蛋白质溶液(mL)蒸馏水(mL)0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂(mL)2.5mL摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色OD595nm以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

第12页/共16页2.未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的OD595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。第13页/共16页四.注意事项（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽