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文档简介
酵母RNA的分离、组分鉴定及含量测定编辑ppt1、掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。2、了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。3、学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。[实验目的]编辑ppt为何选用酵母为材料提取RNA?酵母核酸中主要是RNA(2.67-10.0%),DNA含量很少,且菌体易收集,RNA易分离。从酵母中提取RNA常用方法稀碱法:利用稀碱使细胞壁溶解,时间短,但RNA易分解。浓盐法:加热条件下,利用高浓度盐改变细胞膜的通透性,使RNA释放出来,产品色泽较好。本实验用0.2%NaOH使酵母裂解,然后用酸中和,除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA。1.核酸分离[原理]编辑ppt酶促水解化学水解:
酸水解:碱基、核糖/脱氧核糖和磷酸
碱水解:RNA存在2′-OH,磷酸二酯键不稳定,得单核苷酸核酸水解方法2.组分鉴定RNA是由核糖、嘌呤/嘧啶碱和磷酸组成,提取得的RNA中加10%硫酸煮沸即可得到这些组分的混合溶液($),分别进行定性鉴定,以证明提取物是否为核酸。[原理]编辑ppt磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀(1mL$+1mL定磷试剂):
(NH4)2MoO4+H3PO4→(NH4)3PO4·12MoO3↓(黄色)Mo6+
SnCL2Mo4+Mo(MoO4)2(兰色)编辑ppt嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物(1mL$+过量氨水+1mL0.1M的AgNO3)。②核糖与地衣酚(orcin)试剂反应呈鲜绿色(1mL$+1mLFeCl3+2mLorcin→水浴加热)编辑ppt3.RNA含量测定核酸(DNA和RNA)碱基的苯环结构在紫外区有较强吸收,吸收高峰在260nm波长处,蛋白质则在280nm波长处。当OD260=1时,dsDNA浓度约为50μg/mlssDNA浓度约为37μg/mlRNA浓度约为40μg/ml纯DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1.6,表明有蛋白质、酚等污染)纯RNA:1.7<OD260/OD280<2.0(<1.7时表明有蛋白质或酚污染,可以增加酚/氯仿抽提)编辑pptOD260/OD280的比值用于估计核酸的纯度,OD260/OD230估计去盐的程度。
对于RNA纯制品,其OD260/OD280≈2.0,OD260/OD230应大于2。OD260/OD230<2说明去盐不充分,可以再次沉淀和70%乙醇洗涤。浓度计算:DNA样品的浓度(μg/μl):OD260×稀释倍数×50/1000RNA样品的浓度(μg/μl):OD260×稀释倍数×40/1000编辑ppt1.提取称取干酵母粉0.4g,放入试管中,加入0.2%NaOH3mL,然后放入沸水浴中提取15min。2.分离用自来水冷却,滴加1-4滴醋酸,调pH至6.0(沉淀蛋白质),装入离心管配平,3000r/min离心3min,(使提取液与菌体残渣分离)。3.抽提收集上清液,加等体积的氯仿,震荡混匀,3500r/min离心5min。4.沉淀RNA收集上清,平均分装入两支离心管中,各加2倍体积无水乙醇,边加边搅拌,配平,3500r/min离心5min,得到RNA沉淀。弃去上清液(弃净),一支离心管加5mL蒸馏水回溶,以备浓度测定;另一支离心管加入5mL10%的H2SO4,然后转入50mL三角瓶中,待用。[操作步骤]注意配平、对称放置离心管编辑ppt编辑ppt编辑ppt①RNA的酸解将装有待测RNA的三角瓶,在电炉上加热,至溶液透明为止,得到RNA的水解液,期间不停晃动,以使受热均匀。[注意]RNA加热酸解时,一定注意观察,本步很容易加热过度,使透明溶液变成黑褐色,而导致实验失败。5.RNA的组分鉴定编辑ppt.检验项目嘌呤核糖磷酸水解液1mL1mL1mL试剂NH3·H2O2mLAgNO31mL苔黑-FeCl31mL定磷试剂1mLSnCl21-2滴反应条件不振动观察现象沸水浴约10min振荡混匀室温放置现象白色絮状沉淀鲜绿色兰色②组分鉴定加蒸馏水将水解液稀释至5mL,然后按下表检验项目所需的量分装三支试管中,进行组分鉴定。编辑ppt待测样品适当稀释(如量取100µLRNA水溶液,加2900µL蒸馏水混匀),用紫外分光光度计分别测定其230nm、260nm和280nm的吸光度值。可根据自己的样品浓度调整稀释倍数。黑体-透射调零蒸馏水-透射调100%吸收调零.6.RNA含量测定注意保护石英比色皿,轻拿轻放!编辑ppt配平:含液离心管与外套铁管在一起两组配平(先选两个外套铁管重量接近)对称放于离心机的铁套中。设置:闭盖,选离心机设置键(“亮点”在转速和时间的选择上:可通过三角符号移位,然后再增减),设置数都完成后再按确认键。启动:使“亮点”回到测定位置,按启动键。转动期间盖子打不开。若声音很大异常。立即按停止键。离心机的使用编辑ppt通过实验现象说明鉴定的结果,由结果进一步说明你的提取物是什么?计算RNA溶液浓度及酵母RNA得率,并判断样品纯度。将组分定性鉴
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