临床微生物学实验手册

10临床微生物学试验手册前 言临床微生物学试验须知— 试验规章防止发生试验室感染与火灾、烧伤、触电等意外事故外，必需严格遵守以下规章。进试验室应穿工作服，只带必要的文具和讲义等。试验室内保持安静、干净，制止饮食、吸烟和开玩笑。试验时严峻认真、集中精力完成长头发者诮将头发向后扎紧或戴工作帽，以防头发被污染或烧焦。发生操作事故，工作环境被带菌材料污染，马上报告教师进展处理。试验用过的带菌材料(如吸管、玻片等)必需马上放在指定的消毒缸内，不得放置试验台上。待消毒或废弃物品放在指定地点。试验室内任何物品不得带出室外。试验完毕时，必需整理清洁试验台和试验室，关好水、电、门窗等。离室前应用肥皂和水洗手，并用消毒剂擦手。二 试验课的根本要求试验前必需认真做好预习，教师将检查预习状况。试验时严格遵守试验规章，认真做好每个试验。试验后必需按本人所得试验结果照实写出试验报告，并通过复习有关理论学问，对自己的试验结果作出分析和解释。试验课是本门课程的重要内容，教师将依据试验课表现，试验结果、试验报告及试验考核评定成绩，并作为总成绩的重要组成局部。第一章 第一节 一般光学显微镜显微镜的光学原理、使用方法和保养详见有关教材。其次节 形态学检查技术不染色细菌标本的检查法不染色的细菌标本的镜检，虽可观看细菌的大小、形态，但主要用于观看细菌的动力。〔一〕悬滴法【操作方法】取凹玻片，于凹窝内四周涂凡士林(可浆糊)少许。在盖玻片中心放一接种环细菌的肉汤培育物。将凹玻片反转，使凹窝对准盖玻片中心并盖于其上，然后翻转玻片，以小镊子或接种环林，其中垫以其他物体，然后使盖玻片重叠于玻片之上。将制好的悬滴标本置于显微镜载物台中心，先以低倍镜找到悬滴的边缘以后，将集光器下降缩小光圈，再换高倍镜观看。【结果】有鞭毛的细菌为真正运动，无鞭毛的细菌则为布朗运动。【用途】用以观看的形态及动力。〔二〕悬滴法【操作方法】用接种环取菌液〔或将少许固体培育物悬于一滴生理盐水中〕2-3环。置于载玻片中心。用镊子夹好盖玻片、掩盖开菌液上，在放置时，先将盖玻片一边接触菌液，缓缓放一，以不产生气泡为泡佳。先以低倍镜找好位置，再以高倍镜观看。【结果】与悬滴法一样。【用途】用以观看细菌的形态及运动，本法较悬滴法简洁，但标本简洁枯槁，不易长时间观看。细菌染色的根本步骤涂片于干净无油脂载玻片中心加一滴生理盐水。用经火灭菌的接种环挑取标本少许，放在生理盐水滴内研匀涂成菲薄的菌膜，假设为液体标本，直接挑取少许涂抹即可。假设为多标本而行用一染色时，可事先用蜡笔在玻片上划为数格，并于玻片的反面标明标本编号。但切勿紧靠火焰，以防标本烤枯，不堪检视。及转变菌体对梁料的通透性，通常用加热法，马上涂片快速通过火焰2-3次，以玻片反面触及皮肤，热而不烫为度。染色将涂片置染色架上，滴加染液以掩盖标本为度。媒染主要是增加菌体与染液间的作用力，其方法有用热、金属盐、碘等。脱色目的在于测知染料与被染物之间结合的结实程度，起鉴别鉴别细菌的作用，将脱色剂〔例如酒精和酸等〕滴加于经过染色的标本上，作用确定时间后除去脱色剂。复染目的在于使已脱色的菌体重染色与前染液颜色呈明显比照之颜色。染色标本的保存与卦片法，观看细菌染色标本均用油浸镜。如需要保存标本，可于观看上掩盖一干净载盖片。待其自然枯燥后，保存于玻片盒内，可多年不变色。革兰氏染色法【染色液】结晶紫溶液称取结晶紫100ml20ml10g/L80ml混合即成。2g10ml蒸馏水中，再加碘1g，待碘全部溶解后，加蒸馏水200ml即成。脱色剂(1)95%酒精(95%70ml30ml)。此两种脱色剂均可应用，但混合脱色剂比95%酒精好，易于把握，反响准确。复染液稀释石炭酸复红液：取萋-尼二氏抗酸染色液中的石炭酸复红液(碱性复红酒精饱和液10ml5%90ml混合)10ml90ml即成。沙黄溶液(25g/L的沙黄乙醇溶液10ml加蒸馏水90ml)。【操作方法】将结晶紫染液滴加在已固定的涂片上，染1min后水洗。1min后水洗。95%(依据涂片上之厚薄约需0.5-1min)后水洗30S1min。用水冲洗，待干，镜检。【结果】革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。【留意事项】配制的染液应先用的革兰氏阳性菌和阴性菌〔通常用金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的16小时培育物〕进展比照试验。以检查染色液的质量是否适用。结晶紫与草酸铵溶液混合后不能保存太久。如有沉淀消灭，应重配制使用。第三节 高压蒸汽灭菌技术高压蒸汽灭菌法是细菌室对试验室材料进展灭菌的主要手段。主要设备是蒸汽高压锅。有卧式和立式两类。此外还有手提式小型高压锅，使用比较便利。高压灭菌的原理是利用增加锅内蒸汽的压力而提高蒸汽温度1－3－1压 力公斤/CM磅公斤/CM磅0.3551080.70101161.05151211.4020127表1—3—1 压力与温度的关系现在最常用的培育基灭菌条件是15磅151015分钟，或用流淌蒸汽法灭菌。器皿的灭菌可以1520分钟。高压灭菌操作方法如下：欲灭菌物品放入锅内，关闭锅门，拧紧螺丝。确认已经密闭，可进展下一步操作。翻开排气阀。开蒸汽开关，向锅内送蒸汽或电源，使产生蒸汽。观看排气阀的排气状况，待排出的气体由冷空气变为蒸汽，温度为105℃时，可关闭排气阀。1540%105℃。由此可见，假设锅内残留有15121℃，不能杀灭微生物。15磅时，开头记住。15磅后，可调整进气阀，削减进气量。维持压力稳定在15〔1公斤/c㎡〕磅。电加热时，可以断和接通电源、维持压力。持续15分钟，至少不能超过30分钟，否则养分物破坏。不然培育基的颜色回变深。第四节 培育基制备技术传统的制备培育基方法是在试验室内由自己配制是牢靠的。使用枯燥培育基有不少优点，但使用时还有些技术问题应当留意。溶化配制的培育基必需在玻璃器中进展。如用铜、铁器器皿，会影响细菌生长。一般先将需要的蒸馏水按定量参与容器中，然后称取确定量培育基干粉，放入水中，静置10—20分钟。除琼脂外，一般成分均可自然溶解。留意不行先加干粉后加水，这不利于溶解。搅拌或振荡器皿后或延长放置时间以促进溶解。只有不得已〔或需要〕的状况下加热溶解。但加热时间不宜过长。温度不宜过高。因高热对琼脂及某些养分成分有破坏作用。调整pHPHPH为7.2—7.4。高压灭菌前，可用PH计校正。由于高压灭菌可影响PHPH还应在高压PH试纸插入起倾制好的琼脂平板或分装试管的液体培育基中，推断是否符合要求。分装：液体培育基一般在灭菌前分装，分装是应留意每管的分装量不应高于试管的2/3。在灭菌后，还要参与成分的液体培育基及半固体培育基，要在高压灭菌后分装。琼脂平板是在培育基高压灭菌之后制备，应等培育基冷至50—60℃再倾平板，否则水基中。一般倒在玻璃平皿中的琼脂平板在无菌室中放置3—4小时或过夜，平皿内的水蒸汽会自然蒸发。假设用塑料平皿，因密闭较严，须在3530—60分钟。方法是将平板放入卵箱，正面对下。以防细菌落入而污染。卵箱门不要关严。应留一点缝隙，使水蒸气排到箱外。用这种烤法要定时检查。以免烤干。琼脂平板放4℃冰箱保存。质量检查无菌试验：可将制好的培育基在35℃卵育过夜，判定是否灭菌合格。另一种简便的方法是制作的平板在无菌室放置室温〔20℃—30℃〕过夜。一方面可使水蒸气干，另一方面可以推断是否有污染。效果检验：按不同的培育基要求接种相应的菌株。观看细菌的发育、菌落形态、色素溶血等特征，推断培育基是否符合要求。保存：液体培育基如无特别要求可在室温中保存，两周内用完。过于枯燥的地区应缩短保存期。琼脂平板须在4℃保存，一般不超过4天。如用塑料袋密封，保存期可延长，但至多两周。保存的培育基是否能用，须视培育基中水份蒸发程度及有无污染而定。第五节 指示剂的配置技术指示剂一般是加在培育基中，来指示细菌代谢后培育基PH的变化。常用指示剂如见表1—5—1。指示剂PH范围酸色—碱色甲基红4.2—6.2红—黄溴甲酚紫5.2—6.8黄—紫溴麝香草酚兰6.0—7.6黄—兰酚红6.8—8.7黄—红中性红1-5-16.8—8.0常用指示剂的变色性红—黄配置指示剂用的溶剂有两种：乙醇和蒸馏水。两种溶液各有不同用途，使用时应留意。指示剂的乙醇溶液多用于培育基的PH滴定。由于指示剂在乙醇中溶解度较大，所以在影响试验结果的牢靠性。所以，制备生化培育基以水溶液为佳在取液前，必需充分摇匀，以保证取量正确。每种指示剂的具体配制浓度见各有关局部。配制指示剂的一般步骤：称确定量指示剂化学品。放入研钵中，参与少量溶剂研磨。吸取溶解的研磨液，置中。参与溶剂，连续研磨。如此反复，至全部指示剂均磨细并成为溶液。加溶剂补足定量。第六节 接种和移种技术接种和移种是细菌试验工作中最根底最常用的操作技术菌传代的成功和防止自然环境的污染，获得纯培育物。左手的操作要点：左手负责持琼脂平板、试管、烧瓶等物品。操作中，左手尽量削减移动，否则，不利于保持物品的无菌状态。要点如下：的细菌进入器皿②、左手所持的试管、平皿、烧瓶应尽量避开使其入口向上。持平皿时，可以让琼脂平板的时，每次取菌完毕应马上扣回盖上。只有需再取菌时，左手才可将平皿持起。完毕，马上塞上塞子。针头开头过火焰，并渐渐移向整个环和针。烧红为止。稍待片刻冷却后，可使用或放回。3次灭菌。如直接将接种环在氧化焰中烧灼，环上细菌或标本可因受高热爆烈四溅。做结核菌试验时，身易爆烈溅出，近年来有电热接种环灭菌。灭菌时细菌不致四溅。、移种或接种的根本步骤右手持接种工具，在火焰上烧灼灭菌。左手持起标本盒或原代培育物的平皿试管等。用工具挑取适量标本或细菌。挑临床标本时，应留意选择真实反映感染状况的饿局部，的，应多取几个菌落。从液体中取菌，只需将环在培育液中蘸取一满环即可。接种到的培育基上。如接种到平板上，可按目的用分区划线或区域涂布的接种法。接穿刺接种时，可垂直刺入高层琼脂中，并沿线取出，须留意不要始终穿刺到管底。接种后，在火焰上烧灼接种用具，放回原处。第七节 分别和纯化技术〔临床标本或不同。做分别时，一般须用一只完整的琼脂平板。划平板多承受分区划线法，在一只平板中可4～5布在平板边缘，然后从今区开头密划线至1/3平板，为第一区，环上的标本应全部涂在此区内。接下来以第一区的一角为起点，密划线至1/3平板为其次区。此区的局部划线须与第一区乃至第五区。分区划线的效果及几个区适宜是以最终消灭单个菌落为依据。另外一种方法与前述的根本一样，用与由混合细菌培育物的分别。用接种环挑取混合培接种环，再划第三区，依此类推，做法如图1-7-1所示。图1-7-1 平板分区划线(左)及培育后菌落示意图而定。一接种针顶部弯一段成约30°角，弯部长约5mm..做纯化操作时，用针在菌落上蘸几下，然后在琼脂平板上划一竖线，使针上的细菌接种在培育基上.接着用接种针的弯部沿划线做垂直方向的密涂，由于用长约5mm一段接种针涂菌，对平板的利用程度高，划线液便利，5—1—36～8株细菌。纯化不应使用选择平板。第八节 细菌血清学试验玻片法凝集试验本法系用免疫备血清(诊断血清)。在玻片上直接与细菌培育物或菌悬液混合，在电【方法】取一干净载玻片，用蜡笔划分二等分。1：51:10免疫血清(市售诊断血清已作稀释，用前不必再稀释)1接种环置于玻1接种环生理盐水(阴性比照用)。用接种环取待鉴定菌培育物，分别于免疫血清及盐水混匀。反复倾倒玻片，约1-3分钟后观看结果。【结果判定】阴性：试验一侧及比照一侧均匀混浊。阳性：试验一侧明显凝集，比照一侧均匀混浊。自凝：试验一侧及比照一侧皆凝集。定。【留意事项】1v1抗原及志贺氏菌属的k抗原等。它能阻抑菌体抗原与免疫血清的凝集。而导致错误的判定。此时应将菌悬液于100℃中煮沸1小时、以破坏其外表抗原，然后再作试验。假设为伤寒沙门氏菌，亦可用抗Vi免疫血清直接检测。2、每作一次鉴定，至少须从一个平板上选择3～5个以上的S型菌落作试验，以免遗漏。3、霍乱弧菌易消灭自凝，故应改用0.3%盐水稀释免疫血清作试验及比照；链球菌不易制成均匀悬液，可改用无盐肉汤及在室温培育以制成均匀细菌悬液。4、试验后的细菌仍有感染性，故在判定后准时放入消毒缸内。伤寒和副伤寒血清学检查〔试管法【原理】用标准伤寒、副伤寒菌液与稀释的待测血清反响，依据凝集效价判定待测血清中有无抗伤寒或抗副伤寒杆菌抗体。与传统肥达氏反响不同，此试验在微量血凝反响板上操作。【试剂】取伤寒OH和副伤寒甲、乙、丙诊断菌液70/m，分别用生理盐水稀释成10亿菌/ml。为便于观看，每10ml此种稀释菌液中参与石炭酸复红〔抗酸染色用染液〕10ul，或加20.0g/L50ul。【操作】125ul9滴于孔内，1滴混匀〔1：10稀释。28×12V型孔血凝反响板上操作，每份待检血清用5排孔，分别标以O、H、甲、乙、丙。每排自其次孔开头每孔注加生理盐水25ul8孔。3、吸取1：10稀释待测血清。分别滴入各排第、2孔中各1滴25u。用稀释棒从第278孔不加血清，留作菌液比照。每批试验可用伤寒、副伤寒诊断血清作阳性比照，同法稀释。4、各排分别滴入相应的染色菌液，每孔1滴25u。此时各孔液体总量为50u1~71：20~1：1280。51分钟，血凝反响板加盖，37℃6小时后观看结果。【结果推断】阳性结果表现为液体澄清，有红色或蓝色细颗粒，均匀平摊于整个孔底。阴性表现为蓝或红色菌体集中一点，沉积于孔底，与菌液比照一样。以消灭50%〔2+〕凝集的血清最大稀释倍数的倒数为待检血清滴度。【参考值】与传统肥达氏反响一样，即O凝集价>80，H凝集价＞160才有诊断价值。如双份血清4倍以上增长更有意义。链球菌感染的血清学检查Ａ族溶血性链球菌〔Ａ链〕在生长过程中可产生多种毒素和酶；如链球菌溶血素〔ＳＬＯ〔ＡＳＯ〕odd氏溶血法已沿用多年，但操作较繁琐。此处介绍较简便的胶乳凝集法【原理】被测血清中如有ASO胶乳试剂反响时，可引起后者凝集。如预先用25结合单位/ml溶血素中和，不消灭凝集者说明血清中的ASO<250单位。仍消灭凝集者，说ASO>250单位。【试剂】1、ASOSLO用炭化而亚胺交联。离心洗涤后，用PH.7.61%1.0g/LNaN3防腐.此试剂有商品供给.2、2.5结合单位/mlSLOSLO2.5结合单位/ml〔标定方法按常用Todd2501：502.5结合单位/mlSLO混合，其ASO恰被中和。【操作】11：5056℃30分钟灭活。212.5结合单位/mlSLO1滴，2～3分钟，使血清与SLO充分混匀。3、滴加ASO18分钟。【结果推断】无凝集者为阴性；有明显凝集者为阳性。阳性血清应复试，将中和用的溶血素O改为5.0结合单位/ml，再按上法检测，如结果仍为阳性则报告为强阳性。其次章 细菌鉴定工作必需遵循的原则从事细菌鉴定的工作者应当把握并准时更细菌学分类学问菌的主要特征，通过较简洁的试验步骤到达正确鉴定目的。细菌鉴定工作的根本原则核方法根本原则〔一〕炎克雷伯氏菌混合，IMViC的结果可均呈阳性，而实际上存在这样的生物种模式。用纯培育物做鉴定，在使用编码鉴定系列时更为重要。个菌落得到大量培育物。〔二题。选择有价值的试验：鉴别两种细菌选择的试验应当其一为阳性，另一为阴性，且阳性和90%。否则，试验无鉴别价值。选择快速简便的试验。由于是常规试验室，选择的方法应快速便利，如鞭毛染色、氧化酶、凝固酶等应为首选方法。鉴定一个细菌假设有几种特异的方法，选其中一或两种便可，多项选择无价值。如鉴定B群链球菌有CAMP、黄色素、马尿酸钠三个试验，一般用CAMP就可以了。常规试验选用复合培育基很便利，如三糖铁、MIU等，一个试验可观看几种试验结果，节约人力物力。会导致错误的鉴定。如H2S试验、醋酸铅试纸法最灵敏。此法阳性的菌株，三糖铁上不愿定肠杆菌科用Ewing的方法，非发酵菌用Hugh-Leifson的方法，葡萄球菌用Jame的方法，而2%，假设各种菌混合用同一配方，鉴定结果将消灭错误。分析方法鉴定是将一个未知菌株按其生物学特征，经过与全部的菌种进展比较后划归到一纲、目、科、属、种的次序。临床细菌鉴定是从科开头的，以下按属、种做鉴定。为了使(群)水平的双歧索引以供参考。+球菌 触酶

革兰氏染色－球菌 杆菌DNA酶 发酵+ － + － +卡葡 链 李 棒他萄 斯 状布球 球 特 菌兰菌 菌 属汉科 菌 属 等菌

－ + －氧化酶奈 + － 非瑟 发肠氏 弧 酵杆菌 菌 菌菌属 科 群科临床常见菌的初步分群临床上常见细菌用革兰氏染色、镜下观看、OF试验、触酶和氧化酶试验就可以初步分科，经过这样的区分后，再按科内各个属和种的鉴别方法鉴定到种。第三章 葡萄球菌属常规鉴定第一节 鉴定过程作属内的鉴定。〔一〕 与其它革兰氏阳性球菌鉴别临床标本中可以见到的革兰氏阳性球菌，除葡萄球菌属外，还有链球菌属和微球菌属。所以，在菌属内菌种鉴定之前，首先与这两属细菌鉴别。1、与链球菌鉴别：葡萄球菌与链球菌的区分，可通过镜下形态触酶试验。在镜下，葡萄球菌以单、双、葡萄状排列。菌体呈圆形。而链球菌以成单、双、链状排列，菌体形态为椭圆形。两个菌属的主要区分是葡萄球菌触酶试验阳性，链球菌则阴性。23个属：葡萄球菌属、微球菌属、动球菌属。动球菌属与人类关系不大，勿需与此鉴别。主要应与微球菌鉴别，两者的区分详见表3-1。试验室常微球菌以四联排列为主，且菌体较大，葡萄球菌发酵葡萄糖产酸试验阳性，微球菌阴性。工程葡萄球菌微球菌形态以葡萄状为主以四联排列为主发酵葡萄糖产酸+－溶葡萄球菌素+－分解甘油(0.4ug/ml分解甘油(0.4ug/ml的红霉素)+－(二) 葡萄球菌三个种的鉴别虽然目前葡萄球菌的种不少，但现今临床鉴定一般要求鉴定到3个种：金黄色葡萄球步定为腐生葡萄球菌。也可用其他的特性来区分三者。详见表3-2。试验金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌血浆凝固酶+－－甘露醇发酵+－－生霉素敏感性SS－A蛋白+－R3-2葡萄球菌三个种的鉴别

葡萄球菌常规鉴定流程革兰氏阳性球菌触酶+ －微球菌科 链球菌属葡萄糖发酵+ －葡萄球菌属 微球菌属凝固酶玻片法+ －金黄色葡萄球菌 凝固酶试管法＋ －金黄色葡萄球菌 生霉素敏感试验S R表皮葡萄球菌 腐生葡萄球菌其次节 试验方法(一) 过氧化氢酶(触酶)试验主要用于细菌属间的鉴别：微球菌和葡萄球菌属(＋)，而链球菌属(－)。2H2O2 过氧化氢酶 2H2O2＋O2【试剂】3%H2O24℃阴暗处保存。用接种针挑取孵育18-24加一滴3%2H2O21毒剂中处理。阳性比照：金黄色葡萄球菌阴性比照：链球菌从血平板上挑取菌落做试验时，不能将血琼脂带到玻片上，因红细胞含有过氧化氢酶会引起假阳性。操作挨次(先菌后H2O2)不能颠倒，否则会消灭假阳性。浓H2O2(30%)是一种强腐蚀性溶液，万一沾到皮肤上，要马上用70%乙醇(不能用水)冲洗以中和它的作用。(二) 葡萄球菌氧化发酵试验〔S－OF〕S—OF培育基按葡萄球菌和微球菌分类小组所推举的方法制备，用于检测过氧化氢酶阳性球菌发酵葡萄糖的力气。S－OF用于鉴别葡萄球菌与微球菌。S－OF培育基是为了抑制承受Hugh和Lelfsson OF试验培育基检测葡萄球菌发酵葡萄糖所遇到的问题而设计的。与OF培育基比较，S－OF培育基养分更高，并且承受不同的PH指示剂因而增加了某些种的葡萄球菌产生略微PH变化的检出力气在S－OF培育基，葡萄球菌发酵葡萄糖，而微球菌或氧化或不分解葡萄糖。1、1.6%800mg，0.01M14.8ml50ml。2、培育基的成分及制备胰蛋白胨酵母膏10g1g1.6%2.5ml琼脂3.5g蒸馏水980mlPH7.0121155050%20ml2－3ml备用。用接种针挑取局部菌落于S－OF41cm，每种待检菌接种两管，接种后一管加液体石蜡约1cm高，1管不加。35℃培育。每天观看是否4天，然后在第七天作出最终推断。发酵：两管均变黄氧化：开放管变黄，石蜡封闭管仍为紫色不分解：两管均为紫色金黄色葡萄球菌——发酵藤黄微球菌——不分解〔三〕血浆凝固酶试验【目的】用于鉴别金黄色葡萄球菌于其它葡萄球菌。【原理】〔CRF〕性或可疑〔缓慢〕阳性或自凝时，应用试管法进一步确定。【试剂】EDTA0.5ml，冻存备用。1、玻片法液，假设消灭自凝现象则承受试管法。假设无自凝发生，则加一环血浆混入，马上观看结果，消灭明显凝块的为阳性，否则为阴性。阴性或缓慢反响〔20～30秒〕应以试管法加以证明。2、试管法1：40.5ML3-5个菌落于稀释血浆中，制成浓37℃水浴，在最初430分钟观看一次。凝固者为阳性，阴性结果则于室温孵育过夜，以便检出缓慢产生或量少的凝固酶。【质控】金黄色葡萄球菌——阳性表皮葡萄球菌——阴性【留意事项】1、试管法检查凝块形成时，不要振动或摇动试管，由于凝固初期的凝块易破坏，即使连续孵育亦不再形成凝块。这可引起可疑或假阴性结果。2、不能使用含盐的抑制培育基上的生长物做试验。例如甘露醇含盐琼脂培育基。〔四〕生霉素敏感试验【目的】用于腐生葡萄球菌与凝固酶阴性的其它葡萄球菌的推想性鉴别。【原理】腐生葡萄球菌能在含有生霉素的培育基上生长，经过适当的接种和培育后，在含5ug的生霉素纸片四周形成的抑菌圈在15mm或以下，表现为耐药，据此将试验菌鉴定为腐球菌也对生霉素耐药，但这些菌种很少自尿液中分别出。【试剂】生霉素纸片〔商品供给，每片含药5u。【方法】5ug/片的生霉素纸片。3513-24小时后，依据抑菌圈大小作出推断。耐药——抑菌圈≤15mm，敏感——13mm.【质控】应用以下菌种检查每批纸片，是否符合预期结果。腐生葡萄球菌——耐药表皮葡萄球菌——敏感第四章 链球菌属常规鉴定第一节 鉴定过程链球菌属的鉴定分两个主要步骤，首先与其它革兰氏阳性球菌鉴别，然后再作菌属内鉴定。〔一〕与其它革兰氏阳性球菌鉴别类菌的鉴别可依据其形态的特点和触酶反响。链球菌再镜下其形态排列以成双或成链状为圆形、而成双的链球菌是椭圆的或是杆菌样的。(二) 链球菌的属内鉴定1、初步分群：虽然本属内包括的菌种数量很多，假设以几个主要的生物学特征先分成几群，然后在群内再进一步区分，鉴定到种使会简化鉴定过程。最简便的方法是依据溶血性及胆汁七叶甘试验把链球菌初步初为三群。群乙型溶血链球菌群，再血平板上呈溶血群胆汁七叶甘试验阳性菌群。群 其它草绿色链球菌，血平板上溶血或不溶血，胆汁七叶甘试验阴性。2、乙型溶血链球菌的鉴定：溶血链球菌可用血清学反响结合生理生化反响进展鉴定，也可初步鉴定，因此是目前大多数常规试验室承受的方法。这一类菌以A、B、C、F、G群与临床有关，应予鉴定。表4-1 A、B、G、D群链球菌的鉴别试验 A群 B群G群D群表4-1 A、B、G、D群链球菌的鉴别试验 A群 B群G群D群杆菌肽 ＋ －－－CAMP － ＋－－七叶甘 － －＋＋胆汁七叶甘 － －－＋黄色素 － ＋－－SXT － －＋－F、C群的鉴定目前除了血清学以外，尚无抱负的生化方法。3、胆汁七叶甘阳性链球菌的鉴定：本群所包括的菌种除鸟链球菌抗原属Q群外，其它均为D群，共有五种。胆汁七叶甘试验是将这五种细菌与其它草绿色链球菌区分的最好肠球菌不同，肠球菌是耐药的，非肠球菌是敏感的，故D群链球菌引起的心内膜炎的治疗用药就有所不同，应予以区分。临床试验室可依据状况将D群链球菌鉴定到种或只鉴定到亚群。6.5%NACL试验是鉴别肠球菌和非肠球菌较好的试验。4、其它草绿色链球菌的鉴定：一般说来非溶血链球菌都属这一类，如肺炎链球菌、血链球菌、唾液链球菌等肺炎链球菌与其它草绿色链球菌的鉴别Optochin敏感试验以及胆汁溶菌试验.(三) 链球菌属常规鉴定流程其次节 试验方法〔一〕溶血性检查：溶血性检查是链球菌鉴定过程中格外重要的一步。【培育基】羊血平板。【方法】35℃培育过夜。【结果推断】α四周的培育基带绿色或褐色。β－溶血：在血平板上，菌落四周红细胞完全溶解，呈现一个无色透亮环。不溶血—溶血：菌落四周无明显红细胞溶解，因而无溶血环。【留意事项】1、血琼脂根底应承受胰化大豆肉汤，心浸液，Todd—Hewitt肉汤或示蛋白胨。上述培育基不但供给了链球菌必需的养分成分，而且不含可发酵的糖类〔这些糖可影响β－溶血性链球菌的溶血性。2、血液的种类与浓度对溶血性亦有影响。肠球菌在马、兔或人血琼脂上可产生β—溶血；而在绵羊血琼脂上则为α5%4mm为宜。3、气体条件可影响溶血性。Aβ—溶血性链球菌可以产生两种溶血素。溶血素O对氧敏感，溶血素S对氧稳定。大多数Aβ—S。胆少数分别株仅产生溶血素O。因此在有氧条件下就不表现β—溶血。厌氧培育，倾注培育，或在初次分别平板接种后进展穿刺。这些方法均可降低氧分压有利于检出仅产生溶血素S的菌株〔二〕杆菌肽敏感试验【目的】该试验用于Aβ—溶血性链球菌的推想鉴定。【原理】杆菌肽是一种革兰氏阳性菌所产生的一种抗生素。β—溶血性链球菌对该药物的敏感性不同，A群敏感，而其它群溶血性链球菌为耐药。【试剂】0.04u杆菌肽纸片、羊血平板【方法】将β－溶血性链球菌的纯培育物接种于半块羊血平板，然后在接种区贴上含0.04u的杆菌肽纸片。3518-24小时，在纸片四周有抑菌圈〔不管大小〕即解释为该菌敏感。【质控】Aβ—溶血性链球菌——敏感B群β—溶血性链球菌——耐药【留意事项】1、该试验只适用于β—溶血性链球菌。由于许α—溶血性链球菌也对杆菌肽敏感。20.04U，而不应承受抗生素敏感试验的纸片。〔三〕CAMP 试验【目的】CAMP试验用于B群链球菌的推想鉴定。【原理】CAMPB群链球菌所产生的一种可集中的、热稳定的胞外蛋白质。CAMP因子与葡萄球菌产生的β—溶血素协同作用，使绵羊〔或牛〕的红细胞快速溶血。但对人、马或兔红细胞则无此作用。【材料】1β溶血素的金黄色葡萄球菌。2【方法】将产生β2-33㎝。35℃孵育过夜。【结果判定】CAMP试验阳性。【质控】B群链球菌——阳性A群链球菌——阴性【留意事项】12β—溶血素。34A群链球菌株在烛缸培育可表现CAMP阳性。假设做厌氧培育。则有更多的A链表现为CAMP阳性。5、经适当的孵育后应马上观看并记录结果。置室温时经过B—溶血素作用的绵羊红细胞会发生冷热溶血，就难推断CAMP试验结果。〔四〕黄色素产生试验【目的】用于B群链球菌的推想性鉴定。【原理】在含淀粉和血清的培育基上，BB群链球菌数个推想性鉴定试验中特异性最好的。【培育基】1胶蛋白胨 2.0g酵母膏粉1.0g淀粉2.0gNACL0.2gNAHCO30.2gNAHPO4·12H2O0.1g蒸馏水100ml2、制备：2.0g50ml加热溶解。50ml蒸馏水中。①＋②调pH7.40.2g琼脂，11520501%血清〔牛、羊、马血清均可〕制成半固体。【方法】35℃孵育24-48小时。穿刺线消灭黄色为阳性，否则为阴性。【质控】B群链球菌——穿刺线呈现黄色〔阳性〕A群链球菌——穿刺线不呈现黄色〔阴性〕〔五〕胆汁七叶甘试验【目的】胆汁七叶灵琼脂用于鉴定D群链球菌。D40%的胆汁〔4%的胆盐〕并且能将七叶灵水解成七叶素和葡萄糖。【原理】该培育基具有选择性，只有耐受40%胆汁的那些细菌能够生长，大多数革兰氏阴性杆DD群链球菌水解七叶灵，所产生七叶素与枸橼酸铁形成褐黑色的产物。据此可将D群链球菌和其它链球菌区分。【培育基】1蛋白胨5g牛肉膏3g七叶甘1g枸橼酸铁1.5g胆盐40g琼脂15g蒸馏水1000ml2①先将柠檬酸铁在适量蒸馏水中加热溶解。②溶解胆盐以外的其它成分。③将①和②混合，调pH7.0，参与胆盐、琼脂粉、加热溶解。分装试管。121℃15分钟灭菌。斜置凝固成斜面。【方法】24小时Todd－Hewitt2滴接种于斜面上。35℃培育。可以定时检查，假设阳性可报告结果；阴性者需孵育72小时后最终判定结果。【结果判定】1、阳性：斜面的一半或大局部变为暗棕色到黑色。272小时斜面变黑不到一半〔＋/－反响。有生长物时，并不表示七叶甘水解。仅表示胆汁浓度不能抑制除D群链球菌以外的细菌生长。【质控】肠球菌——生长，培育基变黑〔阳性〕草绿色链球菌——不生长〔阴性〕〔六〕6.5%NaCl生长试验【目的】用于鉴别肠球菌和D群肠球菌。【原理】6.5%Nacl肉汤含有大量蛋白胨和Nacl6.5%Nacl肉汤生长是肠球菌的一个重要不含盐的培育基生长良好，则为阴性结果。【培育基】蛋白胨牛肉膏粉葡萄糖20g10g2gNAHCO32gNACL2gNa2HPO4·12H2O1g蒸馏水1000ml溶解调pH7.8500ml6.3%NaCl分装试管，115℃20分钟灭菌，备用。【方法】将试验菌接种于两管培育基，一管为含6.5%NaCl，另一管不含所加的盐，35℃孵育24-72小时，观看生长状况。【质控】肠球菌——阳性草绿色链球菌——阴性〔七〕Optochin敏感试验【目的】该试验用于肺炎链球菌的推想鉴定。【原理】对Optochin〔奥普托辛为乙基氢化羟基奎林的商品名〕敏感性被用于α-溶血性链球菌和肺炎链球菌的鉴别。肺炎链球菌对Optochin敏感而绝大多数其它α-溶血性链球菌对该药耐药。【试剂】1、Optochin5.0ug/L(有商品供给)2、羊血平板【方法】从分别的α-溶血性菌落取接种物。致密划线接种于半块血平板，用灭菌镊子夹取一张Optochin5%CO23518-24h。测量抑菌圈大小。【结果判定】6mm纸片 10mm纸片敏感〔S〕——抑菌圈直径≥14mm ≥16mm耐药〔R〕——抑菌圈直径＜14mm ＜16mm【质控】敏感〔S〕——肺炎链球菌耐药〔R〕——肠球菌〔八〕胆汁溶解试验【目的】用于肺炎链球菌的推想性鉴定。【原理】pH6.5pH6..5或更低时，则形成沉淀。【试剂】1、2%10%的脱氧胆酸钠2、酚红 pH指示剂3、0.1NNaOH4、无菌生理盐水【方法】118-24h5%绵羊血琼脂平板上选疑似肺炎链球菌单个菌落〔在平板反面作好记号，便于试验后的菌落定位。直接在菌落上加一接种环2%脱氧胆酸钠，置35℃孵育30分钟〔平板不要倒放。①胆汁溶解：菌落消逝，在原菌落位留有一个a—溶血区，②胆汁不溶解：菌落保持完整。22—3个可疑菌落于Todd—Hewitt5%CO23518—24小时，离心，弃去上清液。以1.0ml生理盐水〔PH7.0〕混悬沉淀物。分装两支试管。各0.5ml。一支0.5ml10%0.5ml无菌生理盐水于比照管中。摇匀。置37℃水浴3管保持浑浊；②胆汁不溶解：两管溶液均保持浑浊。[质控]：肺炎链球菌——胆汁溶解肠球菌——胆汁不溶解[留意事项]1、在胆汁溶解试验的结果判定中，必需使用“溶解”或“不溶解”这两个名词，而不能用阳性〔+〕或阴性〔—〕来记录结果。2、所用试剂稳定性差，应放冰箱保存，并定期作质量检查。第五章 革兰氏阴性球菌鉴定第一节奈瑟氏菌属常规— 鉴定过程属的可能性之后，再做种鉴定。〔一〕与其它菌属鉴定：1、与布兰汉氏菌属区分：后者的菌体略大。DNA酶试验阳性，这是一个很特异试验。2、与摩拉氏菌属区分：后者为球杆菌，且不分解糖类。3、与不动杆菌属区分：后者为氧化酶试验阴性。5—1表5—1 奈瑟氏菌与形态类似菌属的区分特性奈氏瑟菌布兰汉氏菌摩氏拉菌不杆动菌形态球球球杆球杆氧化酶+++－DNase－+－－萄糖产酸＋/－－－－/－〔二〕属内菌种鉴定4基中不生长。进一步可做葡萄糖、表芽糖、蔗糖、乳糖及血清凝集试验作出证明鉴定。5无菌的部位分别到这类细菌，应当具体鉴定。外，硝酸盐试验有鉴别价值〔见方法。(三)鉴定流程革兰氏阴性球菌、氧化酶阳性养分琼脂生长＋ －布兰汉氏菌属 ＋葡萄糖＋其它奈瑟氏菌 ＋麦芽糖－蔗糖－乳糖－脑膜炎奈瑟氏菌 淋病奈瑟氏菌二 试验方法〔一〕氧化酶试验1、奈瑟氏菌属的鉴定，该属氧化酶均阳性。2定错误。氧化酶反响是由于细菌存在细胞色素氧化酶系统。该系统将通常为无色的四甲基一对苯二胺〔或二甲基对苯二胺〕氧化，使其呈现紫色或兰黑色。【方法】常用的方法有滤纸法、菌落法和纸片法。纸片法最便利，试剂易保存。纸片制作法：将直径为6㎜华定性滤纸片于1%盐酸四甲基对苯二胺水溶液中浸泡约535℃温箱烘干。防潮保存。用法：用灭菌牙签沾取菌落。置于纸片上在10秒内消灭紫色即为阳性。【留意事项】1用导致假阳性结果。2酶的活性，而有导致假阴性的可能性。3〔或胰化大豆琼脂等平板上生长的菌落进展。以保证结果有效：而不能在EMB、MAC琼脂平板上生长的菌落进展。〔二〕糖分解试验【目的】白胨、缓冲液、PH指示剂酚红和糖。在斜面上大量的接种物供给大量预先存在的酶。且充基酸化，就能显示变黄的阳性结果。【成分和制备】蛋白胨2.0g1%酚红水溶液1.0mlNacl5.0g琼脂15gK2HPO43.0gH2O900mlPH7.3溶解以上成分，121℃分钟灭菌。冷却50~55℃时，参与已滤过除菌的20%的糖溶液，2%。分装试管，制成斜面。【方法】18-24354小【留意事项】1、取接种物时应轻松，避开将培育基中的成分带到糖利用试验培育基，以保证结果有效。2支试验管，而影响试验结果。3、含麦芽糖的培育基经孵育后有时变为桔黄色，应视为阴性结果。〔三〕硝酸盐试验奈瑟氏菌的硝酸盐浓度应略低，为0.05%，除此而外，为了使细菌生长好，还应参与培育10%的血清。血清可在接种细菌前加。培育基：酪蛋白酶解物 10g酵母膏 3g硝酸钾 0.5g蒸流水 1000mlpH 7.1120℃15分钟。细菌接种前，培育基参与无菌血清，35℃培育过夜。参与A液和B液，红色为阳性。亚硝酸盐复原试验的方法同上。只需将配方中的硝酸钾改为亚硝酸钾。其次节 布兰汗菌属常规鉴定本菌为革兰氏阴性球菌，直径为0。6～10ul，成单或成双存在。成双时，两菌体相对成肾形。需氧，菌落无色素，氧化酶阳性。触酶通常为阳性，碳水化合物不产酸，DNA酶阳性。本菌生长不需要特别养分条件，一般在血平板、巧克力平板上能生长。在5～10%CO2环境中，35℃培育过夜，可形成直径1～3mm的菌落。菌落无色，但接种环刮取的菌落可呈现淡奶色。有些菌株在初分别时，菌落可微微凹陷在琼脂中。鉴定过程卡他布兰汗氏菌鉴定格外简洁，主要是与其他类似的细菌相区分。〔一〕卡他布兰汗氏菌须与摩拉氏菌和奈瑟氏菌相区分。卡他布兰汗氏菌为球菌，成双排列时呈肾形。摩拉氏菌为球杆菌，两者借菌体形态就可相互区分开。卡他布兰汗氏菌的菌体比一般的奈瑟菌大，这是相互区分的一共性质。此外，还应用生化反响，依据特性表中的数据来鉴别。1、 DNA酶试验：布兰汗氏菌阳性，奈瑟菌阴性。2、 硝酸盐复原试验：在没有DNA酶的状况下，也可用这项试验，特异也较好。布兰汗氏菌和粘膜奈瑟氏菌为阳性，其他奈瑟氏菌阴性。3、 葡萄糖产酸：用这项试验来区分布兰汗氏菌和粘膜奈瑟氏菌。〔二〕 当排解了摩拉氏菌和奈瑟氏菌后，可确认是卡他布兰氏菌。5、2、2试验方法1、 DNA酶试验培育基：DNA 2g胰酶水解酪蛋白 15g大豆胨 5gNaCl 5g琼脂 15g蒸馏水 1000mlPH 7.3、121℃15分钟灭菌后，倾制平板。1cm2区域，351MHcl。菌落四周消灭透亮环为阳性。2、硝酸盐复原试验：见奈瑟氏菌属鉴定。3、碳水化合物分解试验：见奈瑟氏菌属鉴定。第六章 分支杆菌属、棒状杆菌属、芽胞杆菌属一、试验目的：〔一〕把握分支杆菌的形态特征；把握标本直接涂片检查抗酸杆菌的技术；了解结核杆菌的养分要求及生长特点。〔二〕把握白喉杆菌的常规鉴定。〔三〕把握三种芽孢杆菌的形态学特征，了解其主要培育特性和生化反响。二、试验内容与方法：〔一〕分枝杆菌属生长特点BCG和耻垢分枝杆菌在LJ培育基上的生长特点。并了解该培育基的主要成分及其制备方法。罗氏培育基罗氏〔Lowenstein-Jensen，LJ〕培育基以鸡蛋为根底，用于分枝杆菌的分别和培育。分枝杆菌对存在于大多数培育基中的一些毒性成分高度敏感。LJ培育基中的马铃薯粉、入孔雀绿以抑制污染菌的生长。参与天门冬酰胺以保证分枝杆菌某些种最大量产生菸酸。根底：天门冬酰胺3.6g马铃薯粉30gKH2PO4MgSO4.7H2O柠檬酸镁2.4g0.24g0.6g甘油dH2O12g600ml添加物：颖全鸡蛋匀浆1000ml2%孔雀绿水溶液20mldH2O溶解盐类和天门冬酰胺。缓慢参与马铃薯粉和甘油。12130分钟。置颖〔一周内〕5%3070%乙醇浸泡15分钟。将蛋逐个打入带有玻璃珠的无菌烧瓶，混匀，过滤。1000ml蛋浆至上述的马铃薯粉混合液。2%20ml。分装试管。斜置于血清凝固器或流通蒸汽灭菌器，加热至85℃50分钟。35℃孵育4841个月。【方法】LJCO26-10周，具体生长状况详见教材。标本的直接涂片检查涂片标本直接涂片有以下两种方法。薄涂片：挑取痰或其它处理过的标本的0.01ml10×10mm的范围。枯燥固定。0.1ml20×2.5mm范围，枯燥固定。萋-尼二氏抗酸染色法【染色液】Ziehl氏石炭酸复红液 称取碱性复红4g溶解于95%酒精100ml内即成碱性复红酒精饱和溶液。取该饱和液10ml与50g/L的石炭酸水溶液90ml混匀即成。3%3ml95%97ml混匀。吕弗勒〔Loeffler〕氏碱性美蓝溶液称取美蓝〔亚甲蓝〕2g95%100ml，制30ml100ml100g/L0.1ml即成。【操作方法】用片夹夹住涂片滴加Ziehl氏石炭酸复红液微火加热，保持染液冒蒸汽，切勿煮沸，烧干。染液将要干时随即添加。冷却后，以清水从玻片反面冲洗掉多余的染料。滴加3%盐酸酒精脱色，至玻片上几乎无红色为止。水洗后以吕弗勒〔Loeffler〕1min。水洗、待干、油镜镜检。【结果】抗酸杆菌染成红色，非抗酸杆菌染成蓝色。【留意事项】5分钟后再过火焰灭菌，以保灭菌彻底，防止污染环境。石炭酸复红液加温染色过程中，温度不易过高，均匀使染液沸腾和蒸发干。如急于观看结果，可将染后标本用吸水纸平铺于玻片上，轻压吸干，但用过的吸水纸上可能有少量染色的抗酸杆菌，帮不宜再用于其次份标本，以免产生错误诊断。镜检方法与报告方式详见教材。第七章 肠杆菌科鉴定第一节 鉴定过程20余种，由于菌种较多，鉴定时须按科－属－种的次序进展，大致分下述几个步骤。〔一〕与其它科细菌的鉴别〔详7-1〕7-1肠杆菌科与其他科细菌的区分试 葡萄糖氧化酶形态鞭毛

肠杆科F－周毛或无

弧菌科F＋弧形单毛

非发酵O/-＋＊单、丛毛、周毛、无＊不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌除外〔二〕肠杆菌科的初步分群菌属名苯丙氨酸葡萄糖酸盐变形杆菌属+-普罗菲登斯菌属+-摩根氏菌属+-克雷伯氏菌属-+菌属名苯丙氨酸葡萄糖酸盐变形杆菌属+-普罗菲登斯菌属+-摩根氏菌属+-克雷伯氏菌属-+肠杆菌属-+沙雷氏菌属-+哈夫尼亚菌属-+埃希氏菌属--志贺氏菌属--沙门氏菌属--枸橼酸杆菌属 - -爱德华氏菌属 - -耶尔森氏菌属 - -〔三〕苯丙氨酸阳性的各属及种的鉴别苯丙氨酸阳性，葡萄糖酸盐阴性的有：变形杆菌属，普罗菲登斯菌属，摩根氏属。各属的鉴别鉴别所用试验：H2S，鸟氨酸、枸椽酸盐，见表7-3表7-3 苯丙氨酸阳性的各属鉴别试验 变形杆菌属 普罗菲登斯菌属摩氏摩根菌属H2S+-+鸟氨酸枸橼酸盐+/-+/--++-变形杆菌属种的鉴别：变形杆菌属“伯杰“版里有三个种：一般变形杆菌、奇异变形菌、产粘变形杆菌。产粘7-4表7-4 变形杆菌属种的鉴别试验 一般变形菌 奇异变形菌吲哚+-鸟氨酸-+普罗菲登斯菌属种的鉴别：该属有3 个菌种，即碱性普罗菲登斯菌、斯图氏普罗菲登斯菌、雷极普罗菲登斯菌，其鉴别见表7-5表7-5 普罗菲登斯菌属内各菌种的鉴别试验 产碱性普罗菲登斯菌，斯图氏普罗菲登斯菌雷极氏普罗菲登斯菌尿素酶 - -/+ +覃糖-+-侧金盏花醇+-+摩根氏菌属的鉴定：只有一个种，摩氏摩根菌。其鉴定见表7-3苯丙氨酸阳性，葡萄糖酸盐阴性的肠杆菌科细菌的双歧索引5-3-7苯丙氨酸＋葡萄糖盐－↓＋一般变＋一般变奇异变形菌 形菌↓↓↓＋＋－，＋――变形杆菌属普罗菲登斯菌属摩氏摩根属↓↓鸟氨酸＋吲哚，鸟氨酸尿素酶，侧金盏花醇，－－，＋ ＋＋ －＋ ――雷极普产碱普斯图氏罗菲登罗菲登普罗菲斯菌斯菌登斯菌图5-3-7 苯丙氨酸阳性菌群鉴定双岐索引〔四〕 葡萄糖盐阳性的各属及种的鉴别。〔1〕 葡萄糖酸盐阳性〔＋〕苯丙阴性〔－〕的菌属：克雷伯氏菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、哈夫尼亚菌属。可用动力、山梨醇NDA酶、7-6。表7-6 葡萄糖盐阳性的各属的鉴别试验 克雷伯氏菌属肠杆菌属沙雷氏菌属哈夫尼亚菌属动力 －＋＋＋山梨醇 ＋＋/－＋－NDA酶 －－＋－棉子糖 ＋＋＋/－－克雷伯氏菌属种的鉴别：是临床分别较多的。二者的区分在吲哚。另外两个亚种虽然临床不多见，但已从臭鼻患者、甲基红、赖氨酸、丙二酸盐鉴别，详见表7-7表7-7 克雷伯氏菌属种的鉴别试验 肺炎克雷伯氏菌 产酸克雷伯氏菌 臭鼻克雷伯氏菌 鼻硬结克雷伯氏菌吲哚－＋－－甲基红－－＋＋枸橼酸＋＋－/＋－赖氨酸＋＋－/＋－丙二酸盐＋＋－－肠杆菌属种的鉴别：肠杆菌属有5个种：阴沟肠杆菌、坂崎肠杆菌、聚团肠细菌、产气肠杆菌、格高菲肠细菌。在鉴别上，氨基酸脱羧酶的价值较大。坂崎肠杆菌、聚团肠细菌可生黄色素，为鉴定供给了较为明显的特征，聚团肠细菌还有一个特点，就是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸皆为阴性。坂崎肠杆菌与阴沟肠细菌生化反响相像，以前曾被称为产黄色素的阴沟肠杆菌。经DNA争论1980年命名为坂崎肠杆菌Enterobactersakazak。与阴沟肠杆菌的区分在5个种的鉴别详见7-87-8肠杆菌属种的鉴别试验阴沟肠杆菌坂崎肠杆菌聚团肠细菌产气肠杆菌格高菲肠细菌赖氨酸－－－＋＋鸟氨酸＋＋－＋＋精氨酸＋＋－－－山梨醇＋－－/＋＋－尿素酶＋/－－－/＋－＋黄色素－＋＋－－沙雷氏菌属及哈夫尼亚菌属的鉴别：77-97-9粘质沙雷氏菌、液化沙雷的鉴别。试验阿拉伯糖棉子糖木糖

粘质沙雷氏菌－－－

液化沙雷＋＋/－＋哈夫尼亚菌属只有一个种，即蜂窝哈夫尼亚菌，其特点是不分解乳糖〔间或也有分解的约5，发酵葡萄糖产气，动力阳性，吲哚阴性，V-P阳性，枸橼酸盐阳，H2S阴性，赖氨酸鸟氨酸阳性，山梨醇阴性，棉子糖阴性，与其他菌属的区分见前表7-6〔五〕苯丙氨酸、葡萄糖盐均阴性的各属及种的鉴别属间鉴别：7-10表7-10 苯丙氨酸、葡萄糖盐均阴性的各属间鉴别属属属菌属菌属属属属菌属菌属菌属H2S－－＋/－＋/－＋－动力＋－＋＋＋－*枸橼酸盐－－＋/－＋－－吲哚＋－/＋－－/＋＋－/＋赖氨酸＋/－－＋－－＋/－尿素－－－＋/－-－＋/－

爱德华氏

耶尔森氏*30℃以下培育有动力。枸橼酸杆菌属内种的鉴别：该属包括弗劳地枸橼酸杆菌异型枸橼酸菌丙二酸盐阴性枸橼酸杆菌三者鉴别见表7-11表7-11 枸橼酸杆菌属内种的鉴别试验 弗劳地枸橼酸杆菌 异型枸橼酸菌 丙二酸盐阴性枸橼酸杆菌H2S ＋/－ － －吲哚 － ＋ ＋侧金盏花醇 － ＋ －丙二酸盐 －/＋ ＋ －爱德华氏菌属内种的鉴别：3H2SVP阴性、枸椽酸盐阳性IMViC＋＋－－、鸟氨酸阳性，其他糖和醇皆阴性。与其他7-10。埃希氏菌属从临床中常分别的是大肠埃希氏菌，吲哚阳性，甲基红阳性、枸橼酸阴性〔IMViC＋＋－－〕7-12。另外，A－D株现在认为是大肠埃希氏菌的一个生物群，留意区分致病的大肠埃希氏菌，尤其是腹泻标本中的大肠埃希氏菌，应作ETEC、EPEC、EIEC、EHEC、EAggEC的血清学鉴定，以免漏检和误诊。表7-12 埃希氏菌属与志贺氏菌的区分试验赖氨酸醋酸盐粘液酸〔粘质酸盐〕志贺氏菌属的鉴定：

埃希氏菌+++

志贺氏菌---志贺氏菌属有47-12所列的方法鉴别。只有生化反响的结果确定是志贺氏菌后才做血清学凝集试验以鉴定。4种，分别为A、B、C、D，鉴定4种志贺氏菌具体做法见有关产品说明。沙门氏菌属的鉴定：沙门氏菌属的鉴定以抗血清凝集方法最便利，在凝集前必需确区分，方法参见表7-10。沙门氏菌分型血清种类较多，依血清可将沙门氏菌属分成1000多个血清型，具体做法参见有关产品说明。耶尔森氏菌属的鉴别：耶尔森氏菌属中只小肠结肠耶尔森氏菌较为常见，该菌与其它相应的菌属鉴定要点有二点：尿素阳性；37℃动力阴性，30℃以下动力阳性。借此可与肠杆菌科中其他细菌相区分。其次节 试验方法常用分别培育基(一)麦康凯琼脂【目的】：麦康凯琼脂是一种兼有选择和鉴别作用的培育基性厌氧的革兰氏阴性杆菌.【原理和解释】：MAC.结晶紫和胆盐抑制大多革兰氏阳性菌，赐予MAC选择性作用.在该培育基上，革兰氏阴性菌通常生长良好.依据其发酵乳糖的菌株长成红色或紫红色的菌落.菌落四周可有一个在酸的作用由胆盐形成的沉淀圈，菌落呈红色是由于分解乳糖产酸和吸取中性红，以及当培育基PH降低至6.8以下的中性红发生颜色变化所致。不发酵乳糖的菌株〔如志贺菌和沙门菌〕长成没有颜色、透亮的菌落，培育基的外观也无转变。经室温孵育后小肠结肠炎耶尔森氏菌长成不发酵乳糖的小菌落。【成分和制备】混合以下成分，加热煮沸，121℃15分钟灭菌，冷却至50℃倾注成平板。蛋白胨乳糖琼脂20g10g13.5g胆盐中性红结晶紫1.5g30mg1mgdH2O1000ml，pH7.1【方法】在MAC琼脂上分别划线接种临床标本或试验菌，35℃大气中〔不要置于CO2环境中〕初步观看结果后再平板置于室温24小时，以提高粪便中的小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率。〔二〕 SS琼脂【目的】沙门氏－志贺氏〔salmonella-shigella，SS〕琼脂是一种选择性鉴别性培育基，用于分别粪便标本中的沙门菌和志贺氏菌。【原理和解释】SSSS琼脂的选有硫代硫酸盐复原酶，可将硫代硫酸盐复原成亚硫酸盐和H2S。无色的H2S与铁盐反响形成不溶性硫化亚铁而被检出。SS琼脂具有强选择性，因而可承受大量接种物，有助于从粪便中分别出病原菌，乳糖是该培育基中唯一的糖，极少数可在SS琼脂生长的乳糖发酵菌长成红色菌落。不发酵乳糖的细菌长成无色半透亮菌落〔。【成分和制备】混合以下成分，加热煮沸溶解，无需高压蒸汽灭菌，冷却至50℃倾注成平板。牛肉膏5g枸椽酸铁1g蛋白胨5g中性红25mg乳糖10g煌绿0.33mg胆盐8.5g琼脂13.5g枸椽酸钠8.5gdH2O1000ml硫代硫酸钠8.5gpH7.4【方法】将粪便或增菌肉汤接种于SS35〔不要置于CO2环境中〕培育18-24小时。〔三〕伊红美兰琼脂【目的】伊红美兰〔Eosin-Methyleneblue，EMB〕琼脂用于含有混合细菌标本的革兰阴性杆菌的分别和鉴别。【原理和解释】菌，但对革兰阴性杆菌很少或无毒性作用。依据乳糖发酵，对革兰氏阴性杆菌进展鉴别。培育〔间或不发酵乳糖或缓慢发酵乳糖的另一种糖源。在EMB琼脂，小肠结肠炎耶尔森氏菌产生的菌落具有金属光泽，产生这一现象的美兰伊红盐。由于发酵乳糖和蔗糖菌落四周的pH下降而产生沉淀。黑色染料也被吸取入菌落。不发酵乳糖和蔗糖的细菌由于蛋白质氧化脱氨使pH提高，从而稳定美兰－伊红混合物产生无色菌落。【成分和制备】混合以下成分，加热煮沸溶解，121℃15分钟灭菌，冷却至50℃倾注成平板。蛋白胨10g伊红丫0.4g乳糖5g美兰65mg蔗糖5g琼脂13.5gK2HPO42gdH2O1000mlpH7.4【方法】见SS琼脂〔四〕HE琼脂［目的】HE〔Hektoenenteric〕琼脂是一种具有选择性和鉴别作用的培育基，推举用于从粪便或经选择性肉汤增菌后的肠道病原菌的分别。【原理和解释】HE琼脂含蛋白质、胆盐、硫代硫酸钠、枸椽酸钠、乳糖、蔗糖及pH指示剂酸性复红和道革兰阴性杆菌生长缓慢。依据发酵乳糖和蔗糖及产生H2S〔蓝为黄色，酸性复红为红色，这两种颜色的混合就成了桔黄色到桔红色〕〔如沙门菌和志贺菌产生硫化氢，H2S与枸椽酸铁铵反响生成黑色沉淀物，积蓄在菌落内。不同在HE琼脂的反响如下：志贺菌、普罗菲登氏菌－绿色菌落沙门菌、变形杆菌－从兰绿色到兰色菌落，有或无黑色中心。大肠杆菌、克雷伯菌、肠杆菌－黄色菌落，菌落四周呈从橙色到橙红色。【成分和制备】：混合以下成分，加热至刚沸腾，冷却至50℃倾注成平板。蛋白胨酵母浸出膏胆盐12g3g9g硫代硫酸钠枸椽酸铵铁溴麝香草酚蓝5g1.5g64mg乳糖12g酸性复红0.19g蔗糖12g水杨苷2gNaCl5g琼脂13.5gpH7.6dH2O1000ml【方法】见SS琼脂二 常用生化试验〔一〕 氧化酶试验〔见奈瑟氏菌属鉴定〕〔二〕 硝酸盐复原试验【目的】该试验用于肠杆菌科〔＋〕的鉴定，以及奈瑟氏菌属〔一〕和布兰汉氏菌的鉴别。【原理和解释】用，可以通过培育基中分解代谢最终产物或者没有硝酸盐来证明。红色反响即为硝酸盐复原试验阳性。盐已被复原成终末产物〔氨或氮气〕。为了确定哪种可能性，其次步是参与少量锌粉，锌粉可将硝酸盐复原成亚硝酸盐。因此，假设在第一步时硝酸盐未被复原〔即仍在培育基中〕，菌硝酸盐复原试验阳性。【培育基成分和制备】混合以下成分，校pH7.4-7.6，分装。121℃15分钟灭菌。蛋白胨硝酸钾dH2O【试剂】锌粉硝酸盐试剂：

1.0g0.1g100mlA液：对氨基苯磺酸0.8g5N醋酸 100mlB液：a-萘胺 0.5g5N醋酸 100ml〔3〕5N(30%)醋酸冰醋酸 300mldH2O 加至1000ml【方法】将待检菌种接种硝酸盐肉汤，35℃孵育过夜，参与硝酸盐试剂A液和B液各5滴，轻摇培育物，使试剂混合均匀，假设在1-2分钟内消灭红色反响，则为阳性结果。假设没有红色反响，参与少量锌粉，在5-10分钟内观看结果。【质控】大肠埃希菌－－阳性硝酸盐阴性不动杆菌－－阴性〔三〕苯丙氨酸脱氨酶试验【目的】与肠杆菌科其它成员的鉴别。【原理和解释】苯丙氨酸琼脂含酵母浸膏、NaCl缓冲液和DL－苯丙氨酸，能够使苯丙氨酸氧化脱氨的a-〔FeCl3〕试剂反响形成绿色反响产物。因此，参与试剂后马上消灭绿色。表示苯丙氨酸脱氨酶阳性。【培育基成分和制备】混合以下成分，煮沸，分装，121℃10分钟灭菌，制成斜面。【试剂】

DL－苯丙氨酸酵母浸膏NaClNa2HPO4琼脂dH2OpH 7.3

2.0g3.0g5.0g1.0g12g1000ml酸性氯化铁FeCl3 12g浓盐酸 2.5mldH2O 100ml装在棕色瓶，避光，4℃贮存。【方法】用试验菌单个菌落接种，35℃培育18-24小时，参与FeCl3试剂，观看结果。【质控】大肠杆菌－－阴性变形杆菌－－阳性〔四〕葡萄糖酸盐试验【目的】与肠杆菌科其它成员的鉴别。【原理】细菌葡萄糖酸盐 2－酮基葡萄糖酸加热2Cu+2－酮基葡萄糖酸盐 Cu2O↓+ 氧化物复原铜离子 复原剂 氧化亚铜沉淀〔蓝色〕 〔黄色－橙红色沉淀〕【培育基成分和制备】混合以下成分，校pH7.0，分装试管。115℃15分钟灭菌。蛋白胨 1.5g酵母浸出膏1.0g葡萄糖钾 40gK2HPO4 1g【试剂】班氏试剂：成分：硫酸铜〔CuSO4.5H2O〕1.73g无水碳酸钠 10g枸椽酸钠 17.3gdH2O 100ml制备方法：A液：将枸橼酸钠和无水碳酸钠溶解于60mlH2O中。B液：将硫酸铜溶解于20mlH2O中。将B液加到A液中并连续摇动，用蒸馏水补足至100ml。【方法】大量接种待检菌于培育基中，35℃培育18-24小时，用灭菌吸管吸出一半培育物，参与10果，阴性结果时，将未用的培育物再培育24小时后重复试验。【质控】大肠杆菌－－阴性克雷伯菌－－阳性〔五〕克氏双糖铁琼脂〔Kligerironagar，KIA〕【目的】克氏双糖铁可检测细菌发酵乳糖和葡萄糖以及产生H2S鉴别。【原理和解释】KIAH2S指示剂、PH指示剂和琼脂。KIA中乳糖的含量是葡萄糖的10倍。发酵葡萄糖的细菌产生很多种酸，使培育基从红色变为黄色。培育基底层〔无氧酵解〕的产酸量比斜面〔有氧呼吸〕大得多。细酸。因此经过24小时的孵育，假设消灭碱〔红色〕性斜面和酸性〔黄色〕底部，则说明试验菌仅发酵葡萄糖而不发酵乳糖。发酵葡萄糖乳糖的细菌产生大量酸位PH的逆转。因此酸性斜面和底层表示试验菌发酵乳糖和葡萄糖。培育基中假设有裂隙或气泡，说明试验菌在发酵糖的同时还产生气体〔CO2和H2〕。另一个鉴别系统是指示H2S的产生，详见SS琼脂。【成分及制备】蛋白胨20g氯化钠5g牛肉浸膏3g枸椽酸铁铵0.5g酵母浸出膏3g硫代硫酸钠0.5g乳糖10g琼脂12g葡萄糖蒸馏水1g1000ml酚红0.2%将上述成分加热溶解，分装试管，装置宜多些，115℃20分钟灭菌，制成高层斜面。【方法】种。35℃培育18-24小时。观看结果。结果判定：糖发酵类型：斜面 底层 结果判定碱 酸 只发酵葡萄糖酸 酸 发酵乳糖葡萄糖碱 碱 不发酵乳糖葡萄糖有裂隙或气泡－－产气黑色沉淀物－－产H2S【留意事项】必需在18-24小时孵育期内观看和判定KIA结果，提早或推迟均可引起判定错误。〔六〕动力－吲哚－尿素琼脂〔MIU〕【目的】用于肠杆菌科成员的鉴别，可检查细菌的动力，产生吲哚和分解尿素。【原理和解释】MIU〔对二甲基氨基苯甲醛〕反响生成红色产物〔玫瑰吲哚〕，吲哚而被检出。某些细菌具有尿素酶，能够分解尿素形成氨，使培育基变碱，pH指示剂酚红变成红色。该培育基为半固体，可检查细菌的动力。【成分及制备】蛋白胨氯化钠葡萄糖KH2PO40.4%酚红水溶液琼脂20%尿素水溶液dH2O

10g5g1g2g2ml2g100ml900ml混合以上成分〔尿素除外〕加热溶解。121℃15分钟灭菌。冷却至50℃左右时参与滤过除菌的20%尿素水溶液，分装于灭菌试管，每管约3ml。【方法】35℃或25℃孵育24结果。【结果判定】动力阳性〔有动力〕现绒毛条纹状生长物。阴性〔无动力〕－细菌主要沿穿刺线生长，四周培育基保持澄清。尿素酶阳性－培育基变红阴性－培育基颜色不变吲哚阳性－参与吲哚试剂后，培育基外表呈现红色环。阴性－无上述红色环消灭。〔七〕甲基红试验【目的】甲基红试验用于肠杆菌科成员的鉴别。【原理和解释】生菌，如大肠杆菌产生大量的有机酸，包括乳酸、醋酸、甲酸和琥珀酸。乙酰甲醇产生菌如克雷伯菌和肠杆菌。产生少量有机酸和大量的中性产物，特别是2，3－丁二醇，MR试验用于鉴别混合酸产生菌和乙酰甲醇产生菌，MRMRpH4.4时，MR为红色，但在PH6.0，则变成黄色，MR阳性菌产生大量酸，使MR呈红色，而MR阴性菌则使MR呈黄色。【培育基成分和制备】蛋白胨 7g葡萄糖 5gKH2PO4 5gdH2O 1000ml加热溶解，每管分装1ml，121℃15分钟灭菌。【试剂】甲基红试剂：将甲基红50mg溶解于95%乙醇150ml中，再参与蒸馏水100ml【方法】将待检菌接种于MR肉汤中，35℃孵育1－3天，参与MR试剂1－2滴，观看结果。【结果判定】阳性：培育物有足够的酸，使MR试剂仍保持明显的红色〔pH4.4〕阴性：培育基呈黄色〔pH6.0〕〔八〕氨基酸脱羧酶试验【目的】用于革兰阴性发酵和非发酵菌成员的鉴别。【原理和解释】CO2CO2，精氨酸、鸟氨酸产生腐胺和CO2。氨基酸脱羧酶培育基含上述三种氨基酸之一，葡萄糖和pH指示剂溴麝香草酚蓝，在孵pHpH上升，指示剂从黄变紫。科成员时，比照因发酵葡萄糖而变黄。【培育基成分与制备】〔略〕【方法】35℃培育1-4天每天检查一次。【结果判定】阳性：培育基变紫色阴性：培育基黄色比照：培育基黄色【留意事项】不含氨基酸的比照管孵育18-24小时后仍保持黄色，说明仅发酵葡萄糖。假设比照管为阳性〔紫色〕，则全部氨基酸脱羧酶试验皆无效，不能作出判定。脱羧酶试验在孵育期静置后可呈现两层不同的颜色，黄色和紫色，在判定结果前要轻轻24小时，就消灭任何紫色的痕迹，可判定为阳性结果。有时由于孵育时间太长pH指示剂被破坏，颜色可能不清或消逝。这可在试管中再加溴麝香草酚蓝来证明。〔九〕枸椽酸盐试验【目的】有助于肠杆菌科成员的鉴别：埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属、耶尔森氏菌属和摩根氏菌属为阴性，其它菌属通常为阳性。有助于细菌种间的鉴别：如嗜水气单胞菌〔＋〕与杀鲑气单胞菌〔－〕、洋葱假单胞菌〔＋〕与嗜麦芽假单胞菌〔－〕【原理和解释】利用枸椽酸盐作为唯一碳源的细菌具有枸椽酸酶，将枸橼酸分解产生草酰乙酸盐和乙酸盐。CO2，CO2与钠离子和水结合形成碱性物质碳酸钠，结果培育基中的pH上升，指示剂溴麝香草酚蓝从绿色变为普鲁士蓝，假设细菌不能利用枸椽酸盐作为唯一碳源，在培育基上就不能生长，培育基不变色。【培育基成分和制备】〔西蒙氏枸椽酸盐培育基〕枸椽酸钠枸椽酸钠氯化钠硫酸镁NH4H2PO4K2HPO4溴麝香草酚蓝琼脂dH2O2g5g0.2g1.0g1.0g80mg15g1000ml混合以上成分，加热溶解，分装试管，121℃15分钟灭菌，制成斜面。【方法】将少量试验菌接种培育基斜面，35℃孵育24-48小时。【结果判定】阳性：细菌生长，培育基变兰色阴性：细菌不生长，培育基无变色。【质控】阳性－产气肠杆菌阴性－大肠杆菌【留意事项】〔十〕丙二酸盐试验【目的】丙二酸盐试验检测细菌利用丙二酸盐作为唯一碳源的力气，培育基中含有缓冲液，pH碳源的细菌，通常在该培育基上不能生长，培育基的pH没有转变，指示剂仍保持绿色，有些丙二酸盐阴性的细菌，由于发酵葡萄糖而产酸使培育基变黄。【培育基成分和制备】酵母浸出膏氯化钠1g2g(NH4)2SO42gK2HPO40.6gKH2PO40.4g丙二酸钠3g葡萄糖0.25g溴麝香草酚蓝25mgdH2O100mlpH6.7混合以上成分，加热溶解，分装试管，121℃15分钟灭菌。【方法】接种试验菌于丙二酸盐肉汤，35℃孵育24-48小时。【结果判定】阳性：整个培育基呈浅蓝色到深普鲁士兰色。阴性：没有颜色变化〔绿色〕或黄色〔仅发酵葡萄糖〕第八章 弧菌科鉴定第一节 鉴定步骤〔一〕与肠杆菌科及非发酵菌区分：葡萄糖的非发酵菌区分。〔二〕弧菌科中菌属间的鉴别：8-1表8-1 弧菌科三个菌属的鉴别试验甘露醇鸟氨酸精氨酸嗜盐性0/129(三)各菌属中种间的区分

气单胞菌属+-+/--R

邻单胞菌属-++-S

弧菌属+/-+/-+/-+/-S弧菌属在临床试验室中可见到的不过10溶血弧菌、河弧菌和拟态弧菌等。各种弧菌的鉴别见表8-2表8-2 致病弧菌的生化特性试验弧菌拟态弧菌梅氏弧菌霍利斯弧菌海鱼弧菌河弧菌弗尼斯弧菌溶藻弧菌副溶血弧菌致伤弧菌精氨酸--+/--+++---赖氨酸++-/+- +/-- - +++鸟氨酸++-- -- - +/-++/-葡糖产气------+---麦芽糖+++-++++++甘露醇+++--++++-/+水杨苷----------蔗糖+-+--+++--/+氧化酶++-+++++++ONPG+++/----/+-/+--+/-硝酸盐++-+++++++0%NaCl++--------8%NaCl---/+--+/-+/-++/--0/129+++-/++-/+--/+-/++枸橼酸盐+++/---++--+/-气单胞菌属中与人类感染有关的只有三种：嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温存气单胞8-3表8-3 气单胞菌属的主要生化特性试验动力吲哚七叶苷阿拉伯糖水杨苷蔗糖甘露醇肌醇V－P葡萄糖产气

亲水气单胞+++++++-++

豚鼠气单胞菌+++++++---

温存气单胞菌++---++-+/-+邻单胞菌属只有一个种：类志贺邻单胞菌，生化特性见表8-4表8-4 类志贺邻单胞菌生化特性试验结果试验结果吲哚+精氨酸+MR+甘露醇-枸橼酸-七叶苷-尿素酶-赖氨酸+动力+/-鸟氨酸+其次节 试验方法肠杆菌科中消灭过的不再重复〔一〕嗜盐性试验【】目的】用于鉴定嗜盐菌【原理和解释】弧菌属中的有些弧菌如副溶血性弧菌具有嗜盐性这些弧菌也可依耐盐程度不同进展鉴别。【培育基的成分与制备】成分：蛋白胨2g蒸馏水100ml3%3gpH7.4制备方法将上述成分混合溶解，121153ml分装，4度贮存备用。【方法】少量接种待检菌于培育基内，35度孵育18-24小时，观看有无细菌生长，必需有阴性比照管，同时等量接种。【质控】阳性：副溶血弧菌阴性：嗜水气单胞菌〔二〕0/129敏感试验【目的】用于弧菌科的属间鉴别。【原理】0/129是二氨基喋啶，对弧菌属细菌有抑制作用，也可抑制邻单胞菌属细菌，而对气单胞菌则无抑制作用，因此可借此作弧菌科的属间鉴别。【含药纸片制作】0/129〔二氨基二异丙基喋啶〕80mg10ml0.8%酒精溶液，吸取此溶液1ml200片〔6mm〕37度烘干，备用，40ug0/129。【方法】将待检菌的胨水培育物，均匀涂布于碱性琼脂平板上，镊取0/129纸片，贴于接种区中心，3518-24小时，观看结果。消灭抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药。【质控】敏感S：副溶血弧菌耐药R〔三〕嗜盐菌应依据嗜盐性在肠杆菌科细菌鉴定用的培育基或生化反响管中多加确定浓度的氯化钠。如副溶血性弧菌试验用的培育基氯化钠浓度应达3%。弧菌属中的氨基酸脱羧酶试验应在原1%氯化钠。第九章 非发酵菌鉴定第一节 非发酵菌初步分群非发酵菌的概念非发酵菌的完全提法是不发酵葡萄糖的革兰氏阴性杆菌境中进展。有效方法。同理，双(三)糖铁琼脂中能生长的细菌，但不分解下层的葡萄糖，则提示为非发酵菌。易治愈。所以，分别和鉴定这些细菌是格外必要的。二非发酵菌的类别7个菌属：1假单胞菌属Pseudomonas2产碱杆菌属Alcaligenes3无色杆菌属Achrombacter4土壤杆菌属Agrobacterium5不动杆菌属Acinetobacter6黄杆菌属Flavobacterium7摩拉氏杆菌属Moraxella在版伯杰手册中，无色杆菌并入产碱杆菌属中。除以上的七个菌属外，鲍特氏菌、布氏杆菌、弗朗西丝菌等也属于非发酵菌。三 生物学特性非发酵菌的主要生物学特征见表9-1。利用这几类菌在鞭毛、分解糖产酸、氧化酶、色素等几项特征上的差异相互区分，分成几个群。表9-1 几种非发酵菌的主要生物学特征菌属 鞭毛 分解糖产酸氧化酶色素尿素靛基质假单胞菌属 端毛 ＋/－＋/－＋/－＋/－－产碱杆菌属 周毛 －＋－－－无色杆菌属周毛＋＋－－－土壤杆菌属周毛＋＋－＋－黄杆菌属－＋＋＋－＋摩拉氏杆菌属－－＋－－－不动杆菌属－＋/－－－－－要为三大类：极端鞭毛的假单胞菌周身鞭毛的产碱杆菌、无色杆菌和土壤杆菌无鞭毛的黄杆菌、摩拉氏菌和不动杆菌。利用鞭毛做初步分群格外有效。细菌是否氧化分解葡萄糖产酸，以此可分为两大类：产酸的是大局部假单胞菌、无色杆菌和土壤杆菌、黄杆菌不产酸的是产碱杆菌、摩拉氏菌和不动杆菌及少数假单胞菌。色素在非发酵菌的鉴定中也很有价值易识别，细菌的色素为识别供给了格外有利的线索。四 鉴定流程以下流程可供鉴定过程中参考：非发酵菌革兰氏阴性杆菌动力＋－氧化酶氧化酶＋－＋－端鞭毛假单胞菌属糖产酸不动杆菌黄色素＋－＋－假糖产酸黄杆菌属摩拉氏菌属单＋－胞尿素产菌＋－碱属土无杆壤色菌杆杆菌菌五试验方法(一) 氧化酶试验(见奈瑟氏菌)(二) OF试验(Hugn-Leifson氧化发酵试验)培育基蛋白胨 2gNaCl 5gNaHPO4 0.3g溴麝香草酚蓝琼脂碳水化合物蒸馏水

0.08g2g1g1000mlpH 6.8±0.2【制备】按配方配制，准确校正pH值，适宜时培育基为绿色，参与木糖、阿拉伯糖等，培育基pH值会降低，应重校正，121℃15分钟灭菌后，分装高层试管，高度不应低于4厘米。【用法】穿刺接种，35℃培育，高层上半局部变黄，为氧化型产酸；整个培育基变黄，为发酵型产酸；不变或变兰为阴性。【比照】ATCC27853发酵型菌株：大肠杆菌ATCC25922阴性菌株：粪产碱杆菌〔三〕鞭毛染色〔改进Ryu氏法〕配方：A液：5%石炭酸10ml鞣酸2gB液：饱和硫酸铝钾液结晶紫酒精饱和液10ml应用液：A10份，B1份，混合即可，室温存放。【染色方法】95%酒精中浸泡24小时以上，用时酒精中取出，以干净纱布擦干后使用。在玻片上滴蒸馏水两滴，一张玻片上可同