基因工程综合实验

基因工程综合实验第1页/共74页异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）第2页/共74页SDS电泳:

不同的蛋白质分子具有不同的电荷和分子量。蛋白质在强阴离子去污剂SDS与某一还原剂(如二巯基乙醇)共同作用下并加热使蛋白质解离后，变性的蛋白质与SDS结合并因此而带负电荷，不同的蛋白质结合SDS的量仅与分子量成正比而与氨基酸的序列无关，在SDS电泳时，蛋白质在聚丙烯酰胺中的迁移率仅仅取决于蛋白质的分子量。聚丙烯酰胺凝胶电泳由丙烯酰胺单体和交联剂N，N′—亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下，形成三维网状结构。凝胶电泳不仅具有分辨不同分子量蛋白质的作用(即分子筛作用)，还具有浓缩作用。由于不连续缓冲系统具有把样品中的SDS-多肽复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而提高了分辨率。采用考马斯亮蓝快速染色，可及时观察电泳分离效果。第3页/共74页大肠杆菌高效表达外源基因须遵循基本原则

大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的表达系统，由于待表达的外源基因结构具有多样性，尤其是真核生物基因的结构与大肠杆菌基因结构之间存在较大的差异，因而在构建表达系统时必须具体情况具体分析。一般来说，高效表达外源基因必须考虑以下基本原则。第4页/共74页1、优化表达载体的设计

为了提高外源基因的表达效率，在构建表达载体时，对决定转录起始的启动子和决定mRNA翻译的SD序列进行优化。具体方法包括组合强启动子和强终止子；增加SD序列中与核糖体16SrRNA互补配对的碱基因序列，使SD序列中6～8个碱基与核糖体16SrRNA的碱基完全配对；根据待表达外源基因的不同情况调整SD序列与起始密码子ATG之间的距离及碱基的种类；防止核糖体结合位点附近序列转录后形成“茎环”二级结构。Shine-Dalgarnosequence;SDsequence因澳大利亚学者夏因(Shine)和达尔加诺(Dalgarno)两人发现该序列的功能而得名。信使核糖核酸(mRNA)翻译起点上游与原核16S核糖体RNA或真核18SrRNA3′端富含嘧啶的7核苷酸序列互补的富含嘌呤的3～7个核苷酸序列(AGGAGG)，是核糖体小亚基与mRNA结合并形成正确的前起始复合体的一段序列。第5页/共74页2、提高稀有密码子tRNA的表达作用。

数密码子具有简并性，而不同基因使用密码子的频率不相同。大肠杆菌基因对某些密码子的使用表现了较大的偏爱性，在几个同义密码中往往只有一个或两个被频繁地使用。如编码Pro的密码子包括CCG、CCC、CCU和CCA等。第一个密码子在大肠杆菌的基因中都高频地出现，而另外三个密码子出现的频率很低。此时可通过点突变等方法将外源基因中的稀有密码子转换为在受体细胞中高频出现的同义密码子。同义密码子使用的频率与细胞内相应的tRNA的丰度呈正相关，稀有密码子的tRNA在细胞内的丰度很低。在mRNA的翻译过程中，往往会由于外源基因中含有过多的稀有密码子而使细胞内稀有密码子的tRNA供不应求，最终使翻译过程终止或发生移码突变。第6页/共74页3、提高外源基因mRNA的稳定性。

大肠杆菌的核酸酶系统能专一性地识别外源DNA或RNA并对其进行降解。对于mRNA来说，为了保持其在宿主细胞内的稳定性，可采取两种措施，一是尽可能减少核酸外切酶可能对外源基因mRNA的降解，二是改变外源基因mRNA的结构，使之不易被降解。第7页/共74页4、提高外源基因表达产物的稳定性

大肠杆菌中含有多种蛋白水解酶，在外源基因表达产物的诱导下，蛋白水解酶的活性可能会增加。因此，须采用多种措施提高外源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性。常用的方法包括：①将外源基因的表达产物转运到细胞质或培养基中；②选用某些蛋白水解酶缺陷株作为受体菌；③对外源蛋白中水解酶敏感的序列进行修饰或改造；④在表达外源蛋白的同时，表达外源蛋白的稳定因子。第8页/共74页5、优化培养与诱导过程

优化培养过程包括多方面，首先是与细菌生长密切相关的条件或因素，如培养系统中的溶氧（转速）、pH值、温度和培养基的成分等，这些条件的改变都会影响细菌的生长及基因表达产物的稳定性。第二方面是对外源基因表达条件的优化。细菌生长到一定的阶段后，开始诱导外源基因的表达，诱导的方式包括添加特异性诱导物和改变培养温度等。第9页/共74页实验用材料、器皿及试剂1、材料菌株和质粒：BL21(pETTEVCP)

垂直电泳装置2、试剂

—IPTG贮备液：

—l×凝胶电泳加样缓冲液：

—30%Acr-0.8%Bis（W/V）

—TEMED:直接用原液，避免挥发。

—电极缓冲液（pH8.3）

—2×样品稀释液

—染色液

—脱色液

第10页/共74页pET-22b（+）质粒图谱TEV-CPBamHIEcoRI第11页/共74页第12页/共74页

1、蛋白质的诱导表达（1）将含有外源基因的单菌落加入到10ml含有Amp的LB培养基中，37℃220rmp过夜培养（14-16小时）。（2）取300μl培养液于10ml无抗生素的LB培养基（1:100），37℃220rmp培养45分钟，至菌液OD600≌0.4-1.0（最好0.6），加入40μlIPTG至终浓度为1mmol/L，继续诱导培养2-3小时。（3）取上述菌液1ml于离心管中，并以未诱导的空白载体的细菌培养物为对照，冰上放置5分钟，离心（6000rmp）1

分钟。（4）在沉淀中加入100μl的1×凝胶加样缓冲液，沸水中加热5

分钟。离心（12000rmp）1分钟，（5）取上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。实验操作程序第13页/共74页2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（1）制备分离胶按下表配制分离胶。

6.255.63.10.18750.12512.530%Acr-0.8%Bis（mL）1mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液（mL）H2O（mL）10%SDS（mL）10%过硫酸铵（mL）TEMED（uL）用量试剂将上述胶液配好，混合后，迅速注入两块玻璃板的间隙中，至胶液面离玻璃凹槽3.5cm左右。然后在胶面上轻轻铺1cm高的水，加水时通常顺玻璃板慢慢加入，勿扰乱胶面。垂直放置胶板于室温约20-30min左右使之凝聚，此时，在凝胶和水之间可以看到很清晰的一条界面，然后析出胶面上的水。第14页/共74页（2）制备浓缩胶

制备方法按下表相对比例混合所需溶液，用少量灌入玻璃板间隙中，冲洗分离胶胶面，然后倒出。把余下的倒入玻璃板间隙中，使液面与玻璃板凹槽处齐平，插入梳子，室温放置20-30min。凝聚后小心拔出梳子。取出梳子后向形成的胶孔加入蒸馏水，冲洗出未凝聚的丙烯酰胺等，倒出孔中水，再加入电极缓冲液。1.671.257.030.10.110.030%Acr-0.8%Bis（mL）1mol/LpH6.8Tris-HCl（mL）H2O（mL）10%SDS（mL）10%过硫酸铵（mL）TEMED（μL）用量试剂第15页/共74页（3）将灌好胶的玻璃板垂直固定在电泳槽上，带凹槽的玻璃板与电泳槽紧贴在一起，形成一个贮液槽，向其中加入电极缓冲液液，使其与胶孔中的缓冲液相接触。在电泳槽下端的贮液槽中也加入电极缓冲液。（4）加样：加样的量应适中，样品中至少含有0.25μg的蛋白质，染色后才能检测得出，1.0μg的蛋白质则十分明显。样品的点样体积根据样品溶液的浓度和凝胶孔的大小，可在20μL。加样时用微量进样器（50-100μL体积）吸取已处理好的标准蛋白质样品20μL（或根据商品说明加样）。

1X凝胶电泳加样缓冲液：

50mmol/LTris-CI(pH6.8)50mmol/LDTT2%SDS0.1%溴酚蓝

10%甘油第16页/共74页（5）电泳及结果测量将电泳槽及电泳仪相连接，上槽为负极，下槽为正极。打开电源开关，将电压调到最大，调节电流旋钮，使每板电流为25mA进行电泳，直至样品中染料迁移至下端1cm时，停止电泳。取下玻璃板，小心地把其中一块玻璃板从凝胶上取下来。第17页/共74页3、染色和脱色

将分离胶部分取下，放在盛有染色液的染色槽中浸泡30min左右。倒去染色液，用蒸馏水漂洗一次，然后加入脱色液，室温浸泡凝胶或者放在摇床上振动脱色，更换几次洗脱液，直至蛋白质区带清晰。97664429M123kDa图8TRSV-CPSDS电泳

1，3：诱导处理菌液；

2：未诱导菌液；

M：蛋白质分子量第18页/共74页思考题1、简述SDS的原理及测定的方法。2、诱导外源基因在大肠杆菌中表达的方法有哪些？加入IPTG的作用是什么？(作业)3、在聚丙烯酰胺中的为什么蛋白质的迁移率仅仅取决于其分子量？4、聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶由哪几部分构成？（作业）5、大肠杆菌高效表达外源基因必须遵循基本原则？第19页/共74页实验八农杆菌介导的烟草基因转化原理：农杆菌发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和琥珀碱型甘露碱型、黄瓜碱型和农杆碱型冠瘿碱第20页/共74页LB(25bp)RB(25bp)T-DNA(23kb)

图4-12Ti质粒结构示意图

Vir区基因(30-40kb)Ti200kbT-DNA的转化需要Vir区基因的表达和左右边界（LB、RB）的存在第21页/共74页Ti质粒作为基因转化的载体形式：共整合载体同源序列LBRBKm

rKmR目的基因同源序列同源序列vir区第22页/共74页双元载体助手Ti质粒pAL4404LBRB多克隆位点植物选择基因细菌选择基因lacRK2orivir区第23页/共74页将双元载体转入农杆菌的两种方法细胞内含有携带Vir区基因的质粒，常用菌株有LBA4404、EHA105三亲交配法冻融法将提取的双元载体与含Ti质粒的农杆菌混合，在液氮中速冻1分钟，然后在37℃下融化。第24页/共74页

影响农杆菌介导基因转化效率的因素：1、菌株染色体背景

不同农杆菌株的类型的chv基因决定了其对受体细胞的识别和附着能力的差异。根癌农杆菌的胭脂碱型和琥珀碱型生长快、不结球，转化易于操作，但共培养时菌体附着能力较差：章鱼碱型则生长慢、易结球，转化难于操作，但共培养时菌体附着后不易洗去。2、共培养介质细菌培养基：受体植物为农杆菌宿主，所需共培养时间短；植物受体培养基：具有通用性，特别适合共培养时间较长的植物。否则易造成农杆菌过度繁殖，导致植物外植体呼吸作用抑制和细菌分泌物毒害。

第25页/共74页3、侵染浓度和时间

浓度过高、时间过长会引起农杆菌细胞间的竞争性抑制，而且过度增殖会抑制受体细胞的呼吸作用；浓度过底、时间过短则造成受体细胞表面农杆菌附着不足。禾谷类作物一般侵染浓度较高，接种浓度为OD600＝1.0－2.0；侵染时间1-2小时。烟草、大白菜等对侵染敏感的双子叶植物要求菌体浓度要低的多,一般为OD600=0.5；侵染时间5－10分钟。第26页/共74页4、共培养条件

（1）共培养温度农杆菌在20~30℃的范围内都可以生长

vir区基因表达的适宜温度多在20~25℃共培养温度25℃左右

外植体生长温度通常在25－26℃左右（2）共培养PH值酸性培养环境有利于农杆菌的侵染。因为植物细胞释放的对农杆菌有趋化作用的化学物质（如酚类、糖类）虽然在不同酸碱度下比较稳定，但在pH=5.0－5.8时对vir基因的诱导能力最高。

第27页/共74页

（3）诱导物和抑制物酚类是vir区基因表达的主要信号物质。是否添加视植物种类不同而异。宿主植物不需添加。（4）共培养时间

T~DNA的整合表达需要16小时以上。共培养时间要视植物类型而异，如烟草、生菜和花生一般在2天左右；水稻、玉米和小麦等禾谷类作物一般为3天；西瓜、甜瓜等瓜类以4－6天为佳。5、其他影响因素

外植体的类型，外植体的生理状态、抑菌剂种类等。第28页/共74页实验所用器皿及试剂1、器皿与材料

—超净工作台

—光照培养箱

—28℃恒温摇床

—高速离心机

—1.5ml无菌Eppendorf管

—微量移液器及各种型号吸头

—镊子、刀子等

—培养皿

—含目的基因的农杆菌

—NC89烟草叶片2、药品试剂

—卡那霉素（50mg/mL）

—利福平（30mg/mL）

—羧苄青霉素(250mg/mL)

—乙醇溶液（70%）

—0.1%氯化汞溶液第29页/共74页操作程序1、培养基的配制—YEP培养基（参见细菌培养基的配制）——预分化培养基：MS大量元素，MS微量元素，MS维生素，铁盐，蔗糖30g/L，6-BA3mg/L，NAA0.2mg/L，pH5.8，琼脂9g/L。——MS0培养液及共培养基：MS大量元素，MS微量元素，MS维生素，铁盐，蔗糖30g/L，pH5.8（注：共培养基添加琼脂9g/L）——选择培养基：MS大量元素，MS微量元素，MS维生素，铁盐，蔗糖30g/L，6-BA3mg/L，NAA0.2mg/L，pH5.8，琼脂9g/L，卡那霉素100mg/L，羧卞青霉素500mg/L（注：卡那霉素和羧苄青霉素在冷却到60℃时加入倒制平板）——生根培养基：MS大量元素，MS微量元素，MS维生素，铁盐，蔗糖20g/L，pH5.8，琼脂9g/L，羧卞青霉素250mg/L（注：羧苄青霉素在倒制平板前加。第30页/共74页培养基配置一组：预分化培养基：1000ml（500ml/瓶、2瓶，）分装后封口，高压灭菌，冷却至60℃分装平板40皿。大量元素20X母液

50ml/L微量元素100X母液

10ml/L维生素100X母液10ml/L铁盐100X母液10ml/L蔗糖定溶后调pH5.8

琼脂粉9g/L（每瓶4.5g）30g/L3mg/L0.2mg/L6-BANAA第31页/共74页

琼脂粉大量元素20X母液/L

50ml/L微量元素100X母液/L

10ml/L维生素100X母液10ml/L铁盐100X母液10ml/L蔗糖定溶后调pH5.89g/L（每瓶4.5g）30g/L二组：共培养培养基：1000ml（500ml/瓶、2瓶）分装后封口，高压灭菌，冷却至60℃分装平板40皿。第32页/共74页三组：选择培养基：1200ml（300ml/瓶、4瓶）分装后封口，高压灭菌，冷却至60℃，加入卡那霉素和羧苄青霉素，分装平板皿。大量元素20X母液

50ml/Lx1.2微量元素100X母液

10ml/L维生素100X母液10ml/L铁盐100X母液10ml/L蔗糖定溶后调pH5.8

琼脂粉9g/L30g/L3mg/L0.2mg/L6-BANAA

羧苄青霉素

500mg/L卡那霉素100mg/L第33页/共74页大量元素20X母液/L

50ml/Lx1.8微量元素100X母液/L

10ml/L维生素100X母液10ml/L铁盐100X母液10ml/L蔗糖定溶后调pH5.830g/L四组：MS液体培养基：1800ml（150ml/瓶、12瓶）

分装后封口，高压灭菌。第34页/共74页

五组

YEP农杆菌培养基：300ml（50ml/瓶、6瓶，）

蛋白胨10g/L

酵母粉10g/LNaCl5g/L

定溶分装后，封口，高压灭菌六组无菌水：24瓶（150ml/瓶）无菌三角瓶100ml12个，50ml70个无菌滤纸12包

50ml离心管12个

第35页/共74页2、基因转化

注：以下操作均须在超净工作台上进行，所需器皿均须灭菌

1、烟草Nc89种子催芽后，播种于塑料盘中，常规管理，至2-3

片真叶期，备用。

2、将农杆菌（内含带卡那霉素抗性基因的表达载体），在固体

LB（含卡那霉素50mg/L，利福平20mg/L）培养基上划线接种；在28℃、黑暗条件下培养3天。

3、挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有

50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，28℃，250rpm，振荡培养约48小时,至对数生长后期。第36页/共74页4、将处于对数生长后期的农杆菌液，在无菌离心管中，

3000rpm，离心5分钟；用液体MS0重悬浮，稀释3倍（OD600=0.4~0.6），用于转化。5、取烟草叶片，用水洗去表面的污物，吸干多余的水分，用70%

乙醇消毒30秒，再用0.1%HgCl2

消毒10分钟，用无菌水冲洗

5次，灭菌滤纸吸去表面水，用刀片切成小块(0.5×0.5cm2)

左右。6、将切好的烟草叶片，平放于预分化培养基中，25℃，光照时间16小时/天，光照强度2000LX，预培养2天。7、将预培养后的烟草叶片浸入同时准备好的菌液中10分钟，中间摇动几次；然后用灭菌的滤纸吸干多余菌液，接入共培养基；弱光下，28℃，共培养2-3天（外植体基部可见微菌落）。第37页/共74页8、共培养后的外植体先用含羧卞青霉素500mg/L的无菌水洗涤3

次，再用含羧苄青霉素500mg/L的MS0培养液洗1次，然后用灭菌滤纸吸干，转入选择培养基上，恒温培养(条件同预培养)；每15天更换一次培养基。9、待芽长至1cm左右时，切下，移入MS生根培养基中，若20-30天后，转基因苗将会生根。10、待根系发育好后，移入盛有无菌土（基质）的花盆中（注意洗净根部培养基），用塑料薄膜保湿2天后，温室常规管理。对抗性苗进行抗性鉴定.第38页/共74页

选择培养（转化）芽分化生根

预培养共培养选择培养（未转化）第39页/共74页实验结果描述：选择培养3周后，观察实验结果。发现烟草叶片周围产生大量愈伤组织，并有芽点产生。表明，外源基因可能已整合与烟草的基因组中。第40页/共74页思考题1、在植物基因转化中，应用的农杆菌主要有哪两种类型？2、根据农杆菌染色体毒性(chv)基因不同（合成冠廮碱的不同），又分别分为哪些类型？3、农杆菌介导的植物基因转化中，Ti质粒作为基因转化的基因载体，主要有哪两种形式？4、将双元载体导入农杆菌的方法。5、在农杆菌介导的基因转化中，常用的共培养介质有哪几种？6、在农杆菌介导的基因转化中，用于诱导vir区基因活化的酚类物质主要有哪些？第41页/共74页7、植物基因转化中应用的DNA直接吸收转化法主要包括哪些？8、在用农杆菌侵染植物外植体时，菌液浓度过高或高低，侵染时间过长或过短，均会造成转化效率的降低，为什么？（作业）9、农杆菌介导基因转化中，培养时间要视植物类型而异，如烟草、生菜和花生一般在2天左右；水稻、玉米和小麦等禾谷类作物一般为3天；西瓜、甜瓜等瓜类以4~6天为佳。10、农杆菌介导基因转化中，共培养温度一般为多少度？，共培养基的pH一般为多少？。11、农杆菌介导的基因转化中，T-DNA完成转移所必需的两个条件是什么？（作业）12、描述农杆菌介导的烟草基因转化的基本步骤。

第42页/共74页转基因植物的分子分析

对转基因植物进行分子分析，常在三种水平进行检测外源基因的整合和表达。DNA水平是否整合PCRSouthernRNA水平是否转录Northern蛋白质水平是否翻译WesternELISA第43页/共74页实验九植物总DNA的提取

原理：（二破、一抽、一沉）植物细胞中总DNA包括：核DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA

破壁：液氮研磨破膜：SDS或CTAB一类的去污剂抽提：大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过经处理过的RnaseA除去多糖类杂质去除较困难，通过暗处理，乙醇分级沉淀沉淀：异丙醇或乙醇

第44页/共74页影响植物DNA提取得率和质量的因素1、材料选取时，应尽量选幼嫩的叶片（3-4叶）。2、液氮研磨要充分，快速，否则影响裂解效果。3、再裂解过程和抽提过程中，中间摇动几次，增加材料和裂解液的接触。4、抽提液中饱和酚的PH值应接近8.0，这样可减少离心后水酚双面的交界面上有DNA滞留。5、在沉淀DNA时加入NaAc混合后，应放置几分钟，使Na+与DNA结合形成盐，这样在异丙醇或乙醇中盐不容易被溶解。6、操作过程中，动作应缓慢，减少机械损伤，保证基因组DNA的完整性。第45页/共74页提取DNA的检测

带型弥散：DNA降解1、电泳法：琼脂糖凝胶电泳前面量多含有RNA

点样孔亮带蛋白或杂质2、光吸收法：检测260nm和280nm的光吸收值。大于2.0RNA多RNase

小于1.8杂质或蛋白多抽提3、核酸浓度计算：OD260x50ng/ulx稀释倍数第46页/共74页实验所用材料、仪器和试剂1、重要的实验材料

植物材料：转马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的转基因烟草叶片引物：

PVY-5：GCAAATGACACAATGCATGCPVY-3：TCACATGTTCTTGACTCCAA第47页/共74页2、主要仪器和器皿

第48页/共74页基本原理和用途

离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因素的不同，而使物质分离的技术。随着生物化学、分子生物学和生物工程的发展，离心分离技术已在科研、生产中广泛应用。特别是超速离心技术已经成为分离、纯化和鉴别各种生物大分子的重要手段之一。第49页/共74页离心机的分类及用途低速离心机：转速为8000rpm以下；相对离心力为10000g以下；主要用于分离细胞、细胞碎片及培养基残渣等颗粒物，也用于粗结晶的较大颗粒的分离。高速离心机：转速为10000～25000rpm；相对离心力为10000～

100000g；主要用于分离各种沉淀物、细胞碎片和较大的细胞器等。为了防止高速离心过程中温度升高而使酶等生物分子变性失活，有些高速离心机设有冷冻装置，所以叫做冷冻离心机。超速离心机：转速为25000～80000rpm；最大相对离心力为

500000g；为了防止温度升高和降低空气阻力和磨擦，超速离心机设有冷冻和真空系统。主要用于生物大分子、细胞器和病毒等的分离、纯化。第50页/共74页仪器型号和控制面板5810R型高速冷冻离心机控制面板shortfasttemptempprogspeedtimestartstop▽△open第51页/共74页操作规程1、插上电源，按离心机右侧壁上“I/O”键打开电源开关，仪器自检，依次显示eppendorf5810RV5.4如上图控制面板的显示屏所示介面。2、按“open”键打开离心机盖，根据离心样品的体积和样品离心的要求选择合适的转子和离心管，将转子放置在轴上并用六角螺丝刀拧紧。3、旋上转子盖，轻轻按下离心机盖，电子锁自动锁上机盖。按控制面板上的“temp”键，此时该键上方所对应的数字闪烁，按“△”或“▽”键设定所需温度，然后按控制面板上的“fasttemp”键，然后机器会根据转子的型号自动运行一个离心程序，使离心室的温度快速降至所需温度（到达设定温度后，机器会发出提示音）。第52页/共74页4、待机器发出提示音后，按“open”键打开机盖，旋开转子盖，将装有样品且平衡好的离心管对称放入转子中，旋上转子盖，盖好机盖。

[说明]

（1）如果此次离心不需要很长时间，则可以在上述操作后，按住“short”键，此时机器会运行“short”程序进行离心，此时操作面板上的“prog”上方所对应的数字会显示“SH”字样。按“short”键时间的长短，会决定转速的高低，当放开手后，转子转速会逐渐降低直至到零，“open”键灯亮，按“open”键打开机盖，旋开转子盖取出样品。（2）如果此次需要保证离心时间，则按下述操作进行。第53页/共74页5、按控制面板上的“speed”键，此时该键上方所对应的数字闪烁，按“△”或“▽”键设定离心所需转速。另外，连续按两次“speed”键，该键上方所显示的数值则是离心力的值，按“△”或“▽”键可设定所需离心力值的大小来完成离心。根据离心要求选择。6、按控制面板上的“time”键，此时该键上方所对应的数字闪烁，按“△”或“▽”键设定所需离心时间。另外，连续按两次或者三次该键，则可以调整转速升高或者降低加速度的梯度值，可根据离心样品不同的需要进行调节。

[说明]

（1）设置完成后如果要保存此次设置的参数，可以连续按两次“prog”键，此时该键上方对应的数字闪烁，按“△”或“▽”键选择要保存在哪个文件名下，选择完毕，按住“prog”键直至屏幕显示“ok”后，放开手，这时此次设置的参数就被保存了。第54页/共74页

下次离心如需要同样离心参数时，不用按其它按键设定，只需要按下“prog”键，然后按“△”或“▽”键找到程序名就可以直接“start”键开始进行离心。（2）如果不要保存此次设置的参数，可以直接按“start”键进行离心。此时“prog”键上方对应的数字显示为“0”

（“0”表示未保存的当前运行程序）。7、离心时间结束后，速度会逐渐降低，到零时“open”键灯亮，可按该键使机盖打开，旋开转子盖取出样品。8、关闭机器时，先按控制面板上的“”键关闭控制面板电源，再关闭机器侧壁“I/O”开关，拔下插入外电网电源插头。第55页/共74页注意事项1、离心机移动后,最好4个小时后再使用。2、检查离心机电源插座能否负担离心机的使用功率(250V,10A)。3、离心机使用时离心套管一定要对称放置，并质量相等。4、离心开始前必须检查转子盖是否旋好，并且盖好机盖。5、由于控制面板上面的按键是触摸式的，所以在设置参数时不要用力去按按键，以免造成按键失灵。当所设置的参数达到最大或者最小值时，再继续按“△”或“▽”数值显示不会变动，这时就不要再继续按按键了。6、使用完机器后不要马上盖上机盖，应等离心室内壁化霜，清理干净后，再盖上机盖。7、关闭机器时一定要记住，先按控制面板上的“”键，关闭控制面板电源，在关闭机器侧壁开关，拔下插头。8、转子长期不用时，一定要取出，再次使用时注意使用润滑油。第56页/共74页1.提取缓冲液（120ml，12个样品）配制

——尿素51g

——1MTris.CI（pH8.0）6ml

——0.5MEDTA（pH8.0）2.4ml

——3.5MNaCI12ml

——苯酚7.5ml

——10%SDS12ml

——10%LDS12ml

试剂配好后定容至120ml，65℃水浴中溶解。然后加入0.3g的亚硫酸氢钠，分装于11个50ml的离心管中（每管10ml），置于冰水中。实验操作程序（一）转基因植物总DNA的提取

所用抽提缓冲液应在用前配制，加入亚硫氢酸钠后，易氧化，不能过夜。亚硫氢酸钠应避光保存。第57页/共74页2、提取程序1）取新鲜的转基因烟草叶片2g，加入足量的液氮充分研磨后，移入盛有提取液的离心管中，震荡数秒中，然后置于冰水中20分钟，中间震荡2-3次。每次研磨材料的量不宜过多，操作应快。

液氮研磨移入离心管第58页/共74页

置冰上20min振荡2－3次第59页/共74页2）10000r/min，4℃，离心15分钟。3）取上清液，加入3.5ml3MNaAC（pH5.3），混匀，再加2ml氯仿：异戊醇（24：1），轻轻混匀后，冰水中放置20分钟。

离心倒出上清第60页/共74页4）10000r/min，4℃，离心15分钟。5）取上清液，加入等体积冷的异丙醇，颠倒试管混匀，冰水中放置10分钟。

取上清加入异丙醇第61页/共74页6）用吸管捞出絮状DNA，离心1min使DNA到管底，经70%乙醇洗涤2次后，干燥，加500ul的TE缓冲液，65℃水浴中溶解。

沉淀DNA絮状DNA捞出DNA7）加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，即混匀后,12000rpm离心5min,取上清。再用等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，取上清。加入1/10体积3MNaAC（pH5.3），2倍总体积冷的无水乙醇沉淀DNA。第62页/共74页8）-20℃放置10分钟至数小时，室温，12000r/min，离心5分钟。9）沉淀用70%的乙醇洗涤2次，干燥后，加入50ulTE回溶，

-20℃保存。

洗涤DNA干燥DNA第63页/共74页思考题1、描述植物总DNA提取的基本过程。(作业)2、植物总DNA主要包括：核DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA。3、植物总DNA提取方法中，破坏细胞膜常用的的阴离子去污剂有：SDS、CTAB等。4、在植物总DNA提取过程中，蛋白质、RNA及多糖等杂质的去除，常采用什么方法？（作业）5、纯化DNA时，一般先用酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提一次，再用氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇或异丙醇沉淀。第64页/共74页实验十酶联免疫吸附（ELISA）技术原理：

ELISA为酶联免疫吸附法（Enzyme-linkedImmunoSorbentAssay）的简称。利用抗原和抗体特异结合的特点，将抗原直接或间接地固定在固相，然后使其与酶标抗体反应，再加入酶的底物，利用酶与底物的呈色反应，来判断抗原的存在及浓度。辣根过氧化物酶—邻苯二胺；碱性磷酸酶—4-硝基酚磷酸第65页/共74页ELISA检测程序包括抗体或抗原的包被、免疫反应及检出。包被就是将抗原或抗体固定在固相载体表面，亦称包埋。包被可采用物理吸附或共价交联的方法。包被的好坏是影响固-液抗体-抗原反应的重要因素之一。

ELISA中最常用的固相载体是多孔的聚苯乙烯微量反应板。聚苯乙烯微量反应板对蛋白质有较强的物理吸附作用，与蛋白类抗原（体）结合较强。使用聚苯乙烯反应板时，应用低离子强度并偏碱性的包被液，因在此条件下蛋白质易被吸附，缓冲液pH值在6.0以下时，非特异性吸附会有所增加。聚苯乙烯微量反应板第66页/共74页

加入酶标抗体抗原吸附加入酶标抗体(如羊抗兔)抗体(如兔抗抗原)与抗原结合

加入酶底物,呈有色反应B抗原抗体抗原与抗原结合(捕捉抗原)加入酶底物,呈有色反应C抗原(蛋白质)酶