同步荧光光谱法

同步荧光光谱法当前1页，总共76页。一、同步荧光分析原理

同步荧光技术是同时扫描激发单色器和发射单色器波长的情况下来测绘荧光光谱图。由测得的荧光强度信号对发射或激发波长作图，称为同步荧光光谱。当前2页，总共76页。SYNCHR.EX.SCANNOR.EM.SCANNOR.EX.SANNOFLUORESCATTERLINE/nmnm当前3页，总共76页。1、固定波长的同步荧光光谱(Constantwavelengthsynchronousluminescence,CWSL)(1)在同步扫描中，使激发波长与发射波长保持固定的波长间距，即常数。将同步荧光信号对发射或激发波长测绘荧光光谱图，则为固定波长的同步荧光光谱。当前4页，总共76页。（2）定量依据激发光谱强度分布发射光谱强度分布（2）同步扫描激发波长时的发射光谱（3）同步扫描发射波长时的激发光谱（2）（3）（1）当前5页，总共76页。（3）同步荧光光谱的特点

a.同步光谱与激发光谱及发射光谱都有关系。它同时利用了化合物的吸收特性和发射特性，因而使光谱分析的选择性得到改善。b.有利于多组分混合物的分析。同步荧光光谱可以把强带增强而减小弱带的干扰。c.可消除Raylei干扰，使Roman强度降低且拉宽。当前6页，总共76页。（4）的选择只有当恰好相当于某吸收带和其发射带之间波长间距时，才能观察到同步信号。

=斯托克斯位移（发射波长与激发波长之差)

与狭缝宽度d的大致原则：只受瑞利：当同时受瑞利和拉曼散射干扰

—测定波—拉曼散射光的波长当前7页，总共76页。

2、固定能量的同步荧光光谱

constantenergysynchronousluminescence(CESL)固定能量的同步荧光光谱，是指在同步扫描过程中，使激发波长与发射波长之间保持着固定的能量差。RayRoman当前8页，总共76页。常数表示波数差与

成正比拉曼光与入射光之间的频率差称为拉曼位移当前9页，总共76页。当或时

固定能量的同步荧光光谱可消除瑞利散射和拉曼散射，而固定波长的同步荧光光谱只能消除瑞利散射，使拉曼散射拉宽。二者皆能降低光谱的复杂性，提高选择性。abcF当前10页，总共76页。二、同步扫描仪器设备1、固定波长的荧光光谱的获得

对于以光栅为单色器的荧光分光光度计，只要分别设置激发和发射两个单色器所需的起始波长，并使它们以同样的速率进行扫描，便可进行固定波长同步扫描荧光测定。2、固定能量同步扫描是非线性的可变角同步扫描，需通过微处理机控制而加以实现。当前11页，总共76页。三、应用1、在多环芳烃分析中的应用减小光谱的重叠（1）固定波长同步荧光法用于煤中多环芳烃的测定

苊(Ace)，2,3-苯并芴(BF)，蒽(Ant)，苯并芘(Bap)，苝(Per)

用标准加入法计算2,3-苯并芴（2）低温固定能量同步荧光法当前12页，总共76页。煤液化样品中各种有机物的同步荧光光谱煤液化样品的固定波长同步荧光光谱当前13页，总共76页。2、同步荧光法在医药检验方面的应用（1）违禁药品中苯丙胺和吗啡加奎宁麦角酸二乙酰胺的测定（2）二苯并呋喃中痕量咔唑和蒽当前14页，总共76页。（3）酪氨酸和色氨酸严重重叠CWSL的同步荧光色氨酸的光谱特征的同步荧光酪氨酸的光谱特征

or70nm的二阶导数同步荧光可对

Trp和Tyr分辨同步荧光可对Trp、Tyr、Phe分辨当前15页，总共76页。（4）维生素B1、B2混合物中维生素B1的测定用铁氰化钾将B1氧化硫胺荧（5）尿液中肾上腺素和去甲肾上腺素的同时测定当前16页，总共76页。总结：荧光测量稳态测量时间依赖的测量当前17页，总共76页。

4-4时间分辨荧光法（Time–DomainFluorometry）

(Time–ResolvedFluorometry）当前18页，总共76页。一、时间分辨法原理用短脉冲光源激发的荧光体群体，随时间而衰变，其衰变率为受激分子的寿命当前19页，总共76页。用

F(t)或

N(t)对

t作图1/eF(t)orN(t)tort荧光寿命为荧光强度衰变到初始值的1/e所需要的时间。当前20页，总共76页。特点：采用适当的激发光源和检测体系，可以得到在固定波长的荧光强度—时间曲线和在固定时间的荧光发射光谱。（1）可以对混合物中光谱重叠但寿命差异的组分进行分辨；（2）可消除杂质与背景荧光；（3）可测量溶剂松弛的时间。当前21页，总共76页。二、时间分辨仪器设备激发光源、时间延迟设备、激发单色器、样品池、荧光单色器及设有门控的检测器1、激发光源短脉冲的激发光源闪光灯氮闪光灯几条高强度射线氢闪光灯氘闪光灯连续线强度低当前22页，总共76页。激光器氮分子激光器337.1nm氩离子激光器351nm染料激光器所需波长光子通量大、峰值功率高、单色性好、发生的光脉冲持续时间短，激光荧光法具有较高的灵敏度和选择性。当前23页，总共76页。2、检测器如光电倍增管带有门控的当前24页，总共76页。三、时间分辨荧光的分析应用荧光体的荧光寿命的测定时间分辨荧光光谱荧光发射的衰变曲线当前25页，总共76页。1、荧光体混合物中两组分的同时测定例用8-羟基喹啉-5-磺酸(R)同时测定Al和Ga15.20ml样品+1ml0.045%R+

2ml20%NH4Ac(or20%NH4Cl)

调pH至4.5，稀释至25ml

氘灯激发测定荧光强度—时间曲线当前26页，总共76页。（1）测定荧光衰变曲线

Al–RGa–R可利用上述两个荧光化合物的差异对它们进行同时测定。当前27页，总共76页。（2）计算含量铝配合物和镓配合物的衰变曲线铝配合物和镓配合物的对数衰变曲线比较（1）和（4）的荧光强度得Al的含量比较（2）和（5）的荧光强度得Ga的含量当前28页，总共76页。2、芳基的测定例用ps双色荧光法对卤素芳族化合物光离解作用所产生的芳基进行检测（1）用25ps，266nm激光脉冲使1-(氯甲基)萘，

1-(溴甲基)萘，2-(氯甲基)萘，2-(溴甲基)萘等化合物离解产生芳基。（2）在延迟60ps后，用25ps，355nm激光脉冲激发芳基的荧光，产生橙色荧光，600nm，

10ns，如图所示。当前29页，总共76页。（a）和（c）一致，是1-萘甲基所致（b）和（d）一致，是2-萘甲基所致当前30页，总共76页。3、溶剂松弛时间的分辨测量

许多分子在基态时具有从中等到大的偶极矩，在激发态时偶极矩发生变化，从而引起周围溶剂分子中电子的重排和溶剂分子围绕激发态溶质分子偶极的重新定向，这个过程称为溶剂松弛，这个过程所需的时间叫溶剂松弛时间。在松弛过程中，能量有所降低，因而发射向长波位移。时间分辨荧光法可记录不同时间的发射光谱，因而可测量松弛时间。当前31页，总共76页。例14-氨基苯邻二酰亚胺（4-AP）的丙醇溶液在不同的温度下的时间分辨的荧光光谱图室温下，-132℃荧光光谱与时间t无关在-77K，荧光光谱与t有关在4ns，溶剂还未重新取向在23ns，溶剂取向已完成当前32页，总共76页。例22-对-苯甲基萘-6-磺酸盐染料溶剂甘油温度A图4℃1.8ns,8.0ns,12.2nsB图57℃1.8ns,8.0ns,12.2ns当前33页，总共76页。

4-5相分辨荧光法（Frequency-DomainFluorometry/Phase-ModulationFluorometry)当前34页，总共76页。

Theobjectiveofbothtime-domainandfrequency-domainfluorometryistorecovertheparameterdescribingthetime-resolveddecay.当前35页，总共76页。

一、相分辨法原理

1、单指数衰变的荧光当样品被激发光激发而发射荧光时，如激发光的光强度被正弦调制，其角调制频率为，则发射光也同样被调制。由于吸收和发射之间的时间延迟，调制的发射光比起激发光在相上延迟了角。但发射光的调制比起激发光的调制小一些，也即是发射光的改变部分的相对幅度比起激发光要小些。当前36页，总共76页。—去调制因素激发光和发射光的光强正弦调制当前37页，总共76页。在测量相角（）或去调制因素（m）之后，可以计算该荧光体的荧光寿命。相分辨法是荧光寿命的测量方法之一。当前38页，总共76页。m10MHz30MHz10MHz30MHz、m与的关系如下：当前39页，总共76页。m随的增大而下降m=1发射光与激发光的调制幅度相同m

越小发射光被调制的幅度越小随的增大而增大，寿命越长，延迟的越大。当荧光分子的寿命越长，发射相对于激发延迟的时间就越长。当前40页，总共76页。2、多指数衰变的荧光如果样品中含有两种荧光体，或者单一荧光体而进行进一步激发态反应，则荧光是双指数衰变。如果进行多步反应，则荧光是多指数衰变。

由和m

所计算的是表观荧光寿命。如采用相灵敏检测器的相荧光计，—激发光的调制度（或振幅）—去调制因素单一荧光体当前41页，总共76页。对于相灵敏检测器—稳态荧光光谱—检测角度在不同相角测定荧光光谱，称为相灵敏荧光光谱，即为在固定时间的荧光光谱。当前42页，总共76页。若样品溶液中含有A、B两种荧光体，它们的荧光寿命分别为A和B。如，则该组分的发射被抑制当前43页，总共76页。

要得到混合物中组分A的稳态光谱，须把检测器相角调节至和组分B正交。这是很费时的，最好得到另外的信息:先得到任何一组分的稳态荧光光谱，然后调节检测器相角至该荧光光谱和混合物的荧光光谱重叠，则可得到与另一组分正交的相角。使用任何一组分的纯溶液以确定检测器的相角。当前44页，总共76页。

当用相灵敏检测器在各种不同检测器相角测绘样品的相灵敏荧光光谱。对于单一化合物，其荧光峰波长基本上保持不变而与检测器相角无关。如果不是均匀的发射，则荧光峰随着检测器相角而改变，在不同检测器相角得到的相灵敏光谱是鉴别不均匀发射的有力工具。当前45页，总共76页。3、相分辨荧光法与时间分辨荧光法比较用于荧光参数测量的仪器可分为两大类稳态测量steady-state时间依赖的测量timedependent相分辨荧光法与时间分辨荧光法本质上都是时间依赖或时间分辨的测量。当前46页，总共76页。（1）仪器时间分辨荧光法的局限性

a.仪器常常非常复杂，常局限于有关专家使用；

b.灵敏度常低于稳态测量。相分辨法的优点

a.仪器类似于稳态测量的仪器，使用简单；

b.灵敏度高；

c.数据处理快。当前47页，总共76页。（2）测量参数

a.F(t)-t

曲线时间分辨

b.m..

相分辨当前48页，总共76页。（3）从实验的观点，相分辨有下列优点：在时间分辨的方法中，测量的延迟信号的去卷积对于计算测量系统的限定时间的响应是必要的，而相分辨法不受此限制；相分辨法允许不同方向的直接测量。如在各向异性的延迟测量中，平行和垂直偏振成份的和m的测定；相分辨法为基于荧光寿命差异的光谱成份之直接分辨提供了一种简单、有效的方法。当前49页，总共76页。二、相分辨仪器设备

与一般荧光分光光度计大致相似，但增加了光调制器及测量相角和去调制因素的设备。当前50页，总共76页。1、光调制器（1）Kerr调制器不能透射UV（2）Pockels调制器需要较低电压，能透过紫外光，可在连续可变的频率下操作，但要求高度准直的光，适用于以激光器为光源的相分辨荧光计。（3）Dedye-Sears超声波调制器能透过紫外光，对光准直的要求不太高，可用于各种光源。

当前51页，总共76页。2、检测系统

由单色器，光电倍增管，锁定放大器组成。锁定放大器只检测与参比信号相同频率且具有一定位相关系的信号成份，从而大大提高了信噪比。当前52页，总共76页。三、相分辨荧光的分析应用1、荧光体两组分混和物中个别组分的荧光光谱的直接记录和荧光寿命的测定2－对－甲苯氨基－6－萘磺酸（TNS）和6－丙酰－2－（二甲基氨基）萘（PRODAN）混合物在乙醇溶液中稳态荧光光谱相灵敏荧光光谱调整DPRODAN被抑制TNS的荧光光谱，=3.6nsTNS被抑制PRODAN的荧光光谱，=11.6ns当当当前53页，总共76页。TNS和PRODAN的稳态荧光光谱当前54页，总共76页。TNS-PRODAN混合物的相灵敏荧光光谱当前55页，总共76页。从混合物直接记录下的TNS和PRODAN的荧光光谱当前56页，总共76页。2、溶剂松弛的相分辨在溶剂松弛过程中，一般情况能量有些降低，松弛态发射光谱红移。但降低温度会使光谱蓝移。

N-乙酰基-L-色氨酸胺（NATA）

solvent:丙稀甘油（1）不同T下的荧光光谱（2）相灵敏荧光光谱在固定D即t下所得到的荧光光谱当前57页，总共76页。NATA在丙烯甘油中的荧光光谱当前58页，总共76页。NATA在丙烯甘油中的相灵敏荧光光谱当前59页，总共76页。

4-6

荧光动力学分析法（FluorescentKineticAnalysis)当前60页，总共76页。一、动力学法原理由于化学反应的速率与反应物的浓度有关，在某些情况下与催化剂的浓度有关，因此可以通过测量反应的速率以确定待侧物的含量。光度法电位法荧光法测速率以荧光法监测反应速率，这种方法则称为荧光动力学分析法。当前61页，总共76页。aA+bBnC+mD=k[A]a[B]ba=1b=1=k[A][B]当前62页，总共76页。1、荧光动力学分析的特点（1）优点

a.只观测反应初期的速率，可用于某些反应速率慢、平衡常数小或可能发生副反应的化学反应；

b.动力学分析是一种相对测量,动力学分析法有可能比平衡法具有更好的选择性;c.灵敏度高、操作较快、易于实现自动化。当前63页，总共76页。（2）局限性

a.所使用反应的半衰期应在5ms到1h之间;b.必须严格地控制温度、pH、试剂浓度、离子强度等反应条件和其它可能影响反应速率的因素；

c.动力学测量的信噪比在本质上要比平衡法小,只有反应的一小部分用于测定；

d.试样基质的干扰问题仍可能发生,如降低有效浓度,与分析物结合。当前64页，总共76页。2、荧光动力学分析法非催化法催化法酶催化法（1）非催化法通过测量非催化反应的速率而测定某种反应物的浓度。当前65页，总共76页。（2）催化法以催化反应为基础来测定物质含量的方法。催化反应速率与催化剂的浓度成正比，因此可测定催化剂的浓度，也可用于测定某些对催化反应起助催作用或抑制作用的物质。例:8-羟基喹啉-5-磺酸+过硫酸铵Ag+当前66页，总共76页。(3)酶催化法基于酶催化的反应，这类反应的突出优点是它的特效性和高灵敏度,不仅可用来测定酶的活性,也可用来测定底物、活化剂和抑制剂.当前67页，总共76页。3、反应速率的荧光法监测假如化学反应的某种反应物或产物是荧光物质,便可利用荧光法来监测反应的速率。记F-t

曲线可通过正切法(斜率法)或固定时间法或固定荧光强度法获得校正曲线。当前68页，总共76页。（1）正切法从F-t曲线求反应速率然后用作图c当前69页，总共76页。(2)固定时间法使反应准确地进行到某一固定的时刻t，立即测定F,得到F-c曲线cF当前70页，总共76页。(3)固定荧光强度法测量荧光强度的变化值达到某一规定值所需的时间t，得到1/t-c曲线。c1/t当前71页，总共76页。荧光动力学分析法的优点：灵敏度高、选