HIV抗体检测与质量控制

滋病毒（人类免疫缺陷病毒）艾滋病毒（即人类免疫缺陷病毒）是一种逆转录病毒，它具有极强的迅速变异能力，这一特征不仅使人体的免疫系统难以抵御其侵害，而且给特效治疗药物和预防用疫苗的研制带来困难。艾滋病毒直接侵犯人体的免疫系统，破坏人体的细胞免疫和体液免疫。它主要存在于感染者和病人的体液（如血液、精液、阴道分泌物、乳汁等）及多种器官中，它可通过含HIV的体液交换或器官移植而传播。第一页，共57页。病毒现状

在世界范围内导致了近1200万人的死亡，超过3000万人受到感染。在感染后会整合入宿主细胞的基因组中，而抗病毒治疗并不能把病毒根除。在2004年底，全球有约四千万被感染并与人类免疫缺陷病毒共同生存的人，流行状况最为严重的仍是撒哈拉以南非洲。1986年7月25日，世界卫生组织（WHO）发布公报，国际病毒分类委员会会议决定，把艾滋病病毒改称为人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）简称HIV。第二页，共57页。病毒特点

HIV病毒主要攻击人体的辅助T淋巴细胞系统；一旦侵入机体细胞，病毒会和细胞整合在一起终生难以消除；病毒基因变化多样；广泛存在于感染者的血液、精液、阴道分泌物、唾液、尿液、乳汁、脑脊液、有神经症状的脑组织液，其中以血液、精液、阴道分泌物中浓度最高；对外界环境的抵抗力较弱，对乙肝病毒有效的消毒方法对艾滋病病毒消毒也有效；感染者潜伏期长、死亡率高；艾滋病病毒的基因组比已知任何一种病毒基因都复杂。

第三页，共57页。体外生存

人类免疫缺陷病毒在人体外生存能力极差，不耐高温，抵抗力较低，离开人体不易生存，常温下只可生存数小时至数天。HIV对热敏感。在56℃条件下30分钟即失去活性，但在室温保存7天，仍保持活性。第四页，共57页。灭活方法

国际卫生组织推荐对艾滋病病毒灭活加热100℃持续20分钟，效果较理想。第五页，共57页。

病毒形态人类免疫缺陷病毒直径约120纳米，大致呈球形。第六页，共57页。

致病机制HIV选择性的侵犯带有CD4分子，主要有T淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等。第七页，共57页。传播途径

HIV感染者是传染源，曾从血液、精液、唾液、尿液、阴道分泌液、眼泪、乳汁等分离得HIV。性接触传播血液传播

母婴传播第八页，共57页。

疾病诊断HIV抗体筛查试验ELISA试验化学发光法快速检测补充试验抗体确证试验：免疫印迹试剂（WB）和条带免疫试验（RIBA）核酸试验：核酸定性和核酸定量试验

第九页，共57页。HIV抗体检测目的HIV抗体检测可用于诊断、血液筛查、监测等。以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。第十页，共57页。HIV抗体筛查样品

血清/血浆/全血滤纸干血斑口腔黏膜渗出液尿液第十一页，共57页。筛查试剂

国家食品药品监督管理局注册批准有效期内酶联免疫试剂应批批检合格选择敏感性和特异性高的试剂第十二页，共57页。筛查方法酶联免疫吸附试验（ELISA）化学发光或免疫荧光试验（CIA/IFA）：采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果快速检测（RT）及其它检测试验

第十三页，共57页。酶联免疫吸附试验（ELISA）HIV抗体检测试剂（第三代）：检测HIV-1/2抗体HIV抗原抗体联合检测试剂（第四代）：可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体用酶标仪测定结果有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定第十四页，共57页。ELISA试验中可能出现的问题和原因分析问题可能的原因（非试剂盒本身的原因）测定的重复性差1.加样本及试剂量不准2.加样过快，孔间发生污染3.加错样本4.加样本和试剂时，加在孔壁上部非包被区5.温育时间、洗板、显色时间不一致6.酶标仪滤光片问题第十五页，共57页。ELISA试验中可能出现的问题和原因分析问题可能的原因（非试剂盒本身的原因）白板（阳性对照不显色）1.漏加酶结合物2.洗液配制问题，量筒不干净含酶抑制物3.漏加显色剂A或B4.终止液当显色剂使用全部板孔都有显色1.洗板不干净2.加底物的吸头被酶污染3.洗板液受酶污染4.由于仪器或加样头造成的交叉污染第十六页，共57页。ELISA测定中的干扰因素内源性干扰因素外源性干扰因素第十七页，共57页。内源性干扰因素

人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。常见的有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、医源性诱导的抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子等第十八页，共57页。外源性干扰因素常常是由于血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝集不全、反复冻融等第十九页，共57页。分析ELISA测定中出现的假阳性或假阴性结果时，需综合考虑试剂因素、操作因素和标本因素等。第二十页，共57页。ELISA法结果判断临界值概念:将检测的阳性和（或）阴性对照的OD值代入计算公式计算出来的判断阳性和阴性结果的界值判断标准:标本OD值与临界值的比值大于等于1(S/CO≥1)为阳性注意:不同厂家、不同方法临界值计算公式不同第二十一页，共57页。酶联免疫吸附试验（ELISA）优点：准确性高、价格低廉、判断结果标准客观、结果便于记录和保存用途：流行病学监测及临床大量标本的检测第二十二页，共57页。化学发光或免疫荧光试验采用发光或荧光底物既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光或荧光底物用发光仪或荧光仪测定结果第二十三页，共57页。（1）免疫渗滤试验：斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验以硝酸纤维膜为载体HIV抗原点状固定在膜上加待检样品阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点有效试验的质控点必须显色快速检测（RT）及其它检测试验第二十四页，共57页。斑点免疫胶体金快速诊断试验第二十五页，共57页。（2）免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体HIV抗原线状固定在膜上待检样品（血液、唾液或尿液）沿着固相载体迁移阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带有效试验的质控带必须显色第四代快速试剂（SD）：可区分抗原抗体的检测第二十六页，共57页。第二十七页，共57页。全血样品加50ul样品于样品垫中手指血方法静脉血方法加一滴缓冲液15分钟内读取结果快速检测（RT）及其它检测试验第二十八页，共57页。病人条质控条第二十九页，共57页。第三十页，共57页。快速检测（RT）及其它检测试验优点:快速单份标本检测不需额外试剂或设备操作简便缺点:肉眼判断较主观价格较贵结果不易保存（建议拍照保存）第三十一页，共57页。HIV筛查试剂的选择检测目的实验设施条件价格其他：检测数量、标本用量、复检问题、习惯等等第三十二页，共57页。试剂-1有反应

无反应

试剂1双份或双孔检测或两种试剂*均有反应

一有反应,一无反应

均无反应补充实验报告HIV抗体阴性

图2使用抗体检测试剂的检测流程*两种试剂可以是原有试剂加另一种试剂，也可以是两种不同试剂。临床诊断相关的检测策略使用抗体检测试剂的筛查检测流程第三十三页，共57页。HIV抗体筛查结果的意义及处理阴性：真阴性未感染HIV病毒假阴性注意窗口期阳性：真阳性感染HIV病毒假阳性非特异性反应操作失误处理：筛查试验无反应报告为“HIV抗体阴性”；有反应必须进行复检，复检两次检测均无反应报告为“HIV抗体阴性”，复检检测均有反应或一个有反应一个无反应需进行“补充试验”；报告为“HIV感染待确定”，不能出具阳性报告。第三十四页，共57页。补充试验

是通过检测样本中是否存在艾滋病病毒抗体或者核酸确定艾滋病病毒感染的检测方法。

补充试验包括抗体确证试验[免疫印迹试验、条带/线性免疫试验，特定条件下的替代检测（三种酶联免疫、三种快速试验或酶联加快速试验），免疫层析和核酸检测试验（核酸定性检测和核酸定量检测试验）第三十五页，共57页。HIV抗体确证试验确证试验的试剂：必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。确证样品：可采用血清、血浆、滤纸干血斑确证试验方法：

免疫印迹试验、条带/线性免疫试验，特定条件下的替代检测（三种酶联免疫、三种快速试验或酶联加快速试验），免疫层析或免疫渗滤试验第三十六页，共57页。条带免疫试验（RIBA）/重组免疫印迹法（万泰）第三十七页，共57页。阳性免疫印迹试验（WB/RIBA）阴性不确定核酸试验或2-4周后随访出现HIV-2指示带根据情况进一步检测HIV-2报告HIV-1抗体阴性报告HIV-1抗体阳性图5免疫印迹试剂（WB/RIBA）试验流程抗体确证试验检测流程第三十八页，共57页。HIV抗体WB及RIBA/LIA试验结果报告：（1）符合HIV-1抗体阳性判断标准，报告“HIV-1抗体阳性”，并按规定做好检测后咨询和疫情报告。符合HIV-2抗体阳性判断标准，报告“HIV-2抗体阳性”，并按规定做好检测后咨询和疫情报告。（2）符合HIV抗体阴性判断标准，报告“HIV抗体阴性”。如疑似“窗口期”感染，建议2-4周后随访或进一步做HIV核酸检测，尽早明确诊断。（3）符合HIV抗体不确定判断标准，报告“HIV抗体不确定”，在备注中应注明“2-4周后复检”或尽快做核酸检测。抗体确证试验检测报告第三十九页，共57页。WB不确定结果原因：HIV感染早期HIV感染晚期非特异性反应污染处理：核酸检测2-4周后随访重采血

第四十页，共57页。HIV-1核酸检测HIV-1核酸定性检测HIV-1核酸定量试验有反应报告HIV-1核酸阳性无反应报告HIV-1核酸阴性报告低于检测限>5000cps/ml,报告检测值≤5000cps/ml重新采样检测高于检测限低于检测限图８ＨＩＶ核酸试验流程临床诊断相关的检测策略第四十一页，共57页。核酸补充试验报告定性检测结果有反应，报告“HIV-1核酸阳性”；无反应，报告“HIV核酸阴性”。定量检测结果低于检测限，报告低于检测限；检测结果大于5000CPs/ml，报告检测值；检测结果低于等于5000CPs/ml，尽快再次严格按核酸检测的要求采样检测，报告检测值。临床医生可结合临床及流行病史、CD4+T淋巴细胞检测值或者HIV-1抗体随访检测结果等进行诊断或排除诊断。第四十二页，共57页。HIV抗体母亲HIV抗体经胎盘进入胎儿，出生时新生儿和婴儿早期抗体阳性，不一定是感染出生时母亲的抗体，80~90%在生后9~12个月消失，出生后18个月基本上全部消失18个月后儿童HIV抗体仍然阳性，视为自身感染产生的抗体18个月以下婴幼儿的HIV诊断第四十三页，共57页。婴幼儿HIV感染的抗体检测适用于：HIV感染产妇所生婴幼儿；母亲HIV感染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染的儿童。婴儿12个月时进行HIV抗体检测

阴性排除感染，纳入正常儿童保健；

阳性者继续追踪随访，至18个月再次进行HIV抗体检测，结果阴性排除感染。第四十四页，共57页。HIV抗体检测的要点根据目的选择检测方法及检测策略。严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。结果判定以试剂盒说明书为标准。筛查试验有反应，须作补充试验第四十五页，共57页。质量控制

质量控制是指为确保实验工作正常进行而在每一次实验过程中必须采取的各种措施。以保证检验结果达到允许的准确度。第四十六页，共57页。实验前质量控制

正确的标本采集和处理正确及时的运送样品实验前正确地处理和保存样品实验中质量控制

仪器校准选择合格试剂，采用正确的检测方法标准程序质控品的准备开展质控图质控

实验后质量控制

结果记录记录核对结果解释记录保存

质量控制第四十七页，共57页。实验前质量控制样品的采集：实验室应根据待测项目选用适当的方法采集样品。抗体检测可采集血清、血浆和全血；CD4+T淋巴细胞检测可采集K3EDTA或肝素或枸橼酸钠抗凝全血，并在24小时内室温送检；HIV-1病毒载量测定可采集EDTA或枸橼酸钠(ACD)抗凝全血，最好在6小时内离心分离血浆和血细胞。将分离的血浆分装到2-3支，冰冻保存，在冻存管上编号。做好样品处理记录并注明分装时间。第四十八页，共57页。实验前质量控制样品的保存：用于HIV抗体检测的血清和血浆样品,应存放于-20℃以下，短期（1周）内进行检测的样品可存放于2-8℃；用于CD4+T淋巴细胞检测的样品应在室温下（1823℃）保存，避免极端温度（冷冻或过热）,样品采集时间超过72h则不可检测；用于病毒载量检测的样品的保存条件应根据血浆检测时间而定，4天内可在4℃暂时保存，3个月以内冻存于-20℃以下，3个月以上应置于-70℃以下保存。血浆样品冻融次数不可超过3次。每次冻融在样品上标明。第四十九页，共57页。实验前质量控制样品的运输：1、样品送检时需与相应送样单同时送检。2、血清和血浆样品在2-8℃条件下由专人低温运输。3、CD4+T淋巴细胞检测样品需在在室温下（1823℃）运送，避免极端温度（冷冻或过热）。超过37℃的温度会破坏细胞，对血液学和流式细胞仪的检测有影响。4、病毒载量测定样品的运送：冻存的血浆样品在运输过程中要保持样品在冷冻状态，防止样品冻融。在4℃暂时保存的样品，在2-8℃条件下低温运输。抗凝全血样品在24小时内2-8℃条件下低温运输。第五十页，共57页。实验前质量控制运输采用WHO提出的三级包装系统

第一层容器：装样品，要求防