枇杷叶内生菌菌种内细菌的分离培养与鉴定

枇杷叶内生菌菌种内细菌的分离培养与鉴定（终）枇杷叶内生细菌［摘要］中细菌的分离、培养和鉴定目的:培养和鉴定三种不同来源的枇杷叶内生细菌方法:将枇杷叶去皮，研钵研磨，得到组织提取物，用稀释法培养叶内内生细菌中的细菌，最后用单一染色法染色，用显微镜观察法观察细菌结果:培养皿中菌落形态呈现不同特征结论:枇杷叶内生细菌中不同细菌的数量和数量存在显著差异。［关键词］枇杷内生细菌多样性1引种：枇杷:蔷薇科枇杷，其花、果、叶、根均可入药，具有清肺降气、化痰的功效该果实酸甜可口，性凉，具有清肺润肺、止咳平喘、和胃止渴、降气止呕、温上润肺的功效。我国已开发出多种枇杷制剂，如李强枇杷糖浆，并因其多重功效而广泛应用于临床医学。因此，我们对枇杷内生细菌的培养和分离进行了初步研究2实验部分:2.1材料新鲜绿色枇杷叶（采自浙江工业大学下沙校区白草花园4种不同枇杷树）原植物鉴定为枇杷牛肉膏蛋白胨固体培养基（用于培养）、牛肉膏蛋白胨固体培养基+制霉菌素（用于细菌筛选）2.2操作方法：2.2.1内生细菌的分离:用自来水清洗新鲜植物表面，用1000毫升95%的酒精浸泡3-5分钟，然后用无菌水冲洗3-4次，放在超净的桌子上备用用研钵研磨枇杷叶，加入适量无菌水，然后用1毫升移液管将10毫升原液吸入一个有盖的空试管，标签为①用稀释法将原液稀释至含9毫升无菌水的试管的10-1〜10-5倍，制成10毫升溶液，分别标记为②〜⑥，得到梯度样品溶液，并保存在超净的工作台上。在超净工作台上，用200微升移液器将上述6管样品液分别转移至6个灌注板中的每一个200微升，分别涂上酒精灯，相应编号，标记稀释倍数、日期和组，并在26^培养箱中倒置培养3-5天2.2.2内生细菌的鉴定:从培养皿中分离的细菌中分别筛选出5个菌斑，分别用单一染色法进行染色。然后观察和鉴定染色细菌的显微形态特征。2.3操作过程:2.3.1样品制备溶液放在超净台上，用研钵研磨早期放置的枇杷叶，用无菌水溶解，用纱布过滤，得到样品溶液备用使用1毫升移液管从装有样品溶液的烧杯中吸取1毫升，并将其注入已经装有9毫升无菌水的试管中，并将其充分混合均匀，编号②然后，用1毫升移液管从2号试管中吸取1毫升样品溶液，并将其注入另一个装有9毫升无菌水的2号试管中以此类推，分别配制稀释10-3〜10-5倍的各种样品液，并分别编号为③〜⑥。2.3.2微生物分离的涂布板方法(1)倒置板:当牛肉膏蛋白胨琼脂培养基冷却至55-60°C时，向其中加入0.6毫升(50微克/毫升)制霉菌素。倒置板。方法:右手拿一个装有培养基的锥形瓶，放在火焰旁边5-10厘米的地方。左手用手掌边和小手指控制培养皿，将锥形瓶口对着火焰消毒，然后左手在靠近火焰的培养皿盖上开一条缝，迅速倒入约15毫升的培养基，盖上培养基，然后将培养基放在桌面上，浓缩后形成平板。涂膜:用记号笔分别用1-10-56倍稀释液书写培养基。之后，用200微升移液器分别从10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍稀释液中取出200微升对，并将其放入写有稀释度的平板中，然后将0.2毫升储备溶液吸入1倍的培养基中。培养基表面用无菌玻璃涂布棒轻轻均匀涂布。培养:将牛肉膏蛋白胨板在26OC培养箱中倒置3-5天。2.3.3观察:几天后做观察记录。分离的细菌用单一染色法染色，然后在显微镜下检查。细菌单一染色法：1，涂片:取两块干净的载玻片，每滴生理盐水置于载玻片中心，分别挑取细菌，无菌培养，涂于载玻片生理盐水中，使细菌悬液在载玻片上形成均匀的膜(每种细菌一片)。干燥:室温自然干燥固定:涂层表面朝上，通过火焰2-3次，使细胞质固化，从而固定，固定细菌形态，防止细菌轻易脱落。染色:水平放置载玻片，将染色液滴在涂膜上，将番红染色液染1-2分钟水洗:倒出染料溶液，用自来水洗涤用吸水纸吸收多余的水分，自然晾干。结果2.4:2.4.13天后观察:在5种培养基中，10-1号培养基有单个菌落，具有小、黄、湿、圆、凸起、不透明、边缘整齐等特点，其余培养基均无菌产生。一周后:在5种培养基中，10-1号培养基具有单一菌落，表现出大、黄、湿、圆、凸起、不透明、边缘整齐等特征。而其余的培养基是无菌产生的。两周后，在五种培养基中的第10-1号和第10-2号培养基中发现单个菌落。在10-1培养基中生长着许多单个菌落，其中单个菌落表现出分散性单一、小而均匀、个体微大、颜色黄白色、湿润、部分菌落有隆起、边缘整齐不透明等特点。在10-2培养基中有许多单个菌落，其中的菌落表现出单分散、小而均匀、粉红色、湿润、扁平、半透明、边缘整齐和一些不规则边缘的特征。然而，剩余的三种培养基仍然没有产生细菌。对256±199对染色细菌进行显微镜检查后，发现细菌呈现出不同的特征，细菌的数量和数量有显著差异。结果观察与讨论:结果观察:1。3天后，在5培养基中，除了在10-1稀释培养基中的菌落之外，在其余的培养基中没有产生细菌10-1稀释培养基:只产生一个菌落非常小，黄色，潮湿，圆形，凸起，不透明，边缘整齐2.1周后，在-15培养基中，除了稀释度为10倍的培养基中的菌落外，其余培养基中均无细菌产生-110倍稀释培养基:只有一个菌落大，黄色，潮湿，圆形，凸起，不透明，边缘整齐3.2周后，在5培养基中，在10-1和10-2倍稀释培养基中发现菌落，而其它3种培养基仍不产生细菌。10-1稀释培养基:许多菌落单独分散，小而均匀，有些稍大，颜色为黄色和白色，潮湿，有些菌落凸出，边缘整齐不透明-210倍培养基:许多菌落单独分散，小而均匀，颜色为粉红色，湿润，扁平，半透明，边缘整齐，有不规则的边缘细菌的分辩点:湿织与干织、厚与薄、松与大表面边数、密与小表面边123456789、薄、薄、薄、薄、略大、略大、略大、略大、略大、1薄、大部分不渗透细菌0（半湿润）总结与展望：1。 蒸汽灭菌后，应迅速倾倒平板，以防止培养基凝固。2。 涂布和分离应在培养基完全凝固后进行，不得过早进行，否则培养基容易破碎3。 分装时培养基液体不得超过锥形瓶的1/2,以防止4在高温蒸汽灭菌时溢出。最后，在本实验中，只有稀释比为10-1的培养基才会生长菌落。点平平平平平平平平隆起平齐齐齐齐齐齐齐齐集落描述上升颜色\\粉色苍白\\粉色苍白\\粉色苍白\\粉色苍白\\粉色苍白\\白色、黄色、圆形、黄色、椭圆形、白色、黄色、圆形、白色、黄色、圆形、白色、黄色、颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，颜色，枇杷叶在酒精中浸泡太久，大多数细菌被杀死b。多次