发酵、酿造工艺实验讲义

第六部分发酵、酿造工艺实验第一篇发酵工程设备发酵工程设备实验项目及其各专业必修、选修表实验序号实验项目实验学时实验类型实验类别面向专业（以下打“√”为必修，“＊”为选修，数字为开课学期）生科生技生工食品1小型生物反应器的安装与拆卸2验证√(6）√(5）2小型连续培养实验装置的设计组建3综合√(6）√(5）3体积溶氧传递系数的测定3综合√(6）√(5）4摇床培养确定酵母菌体培养条件8综合√(6）√(5）5反应器培养液的灭菌与接种培养8综合√(7）6pH电极、溶氧电极的校正2验证√(7）7生物制品的冷冻干燥6综合√(7）83M3机械搅拌通风发酵罐结构的认识4验证√(7）91M3中试发酵设备的操作方法12综合√(7）10面包酵母流加培养与分批培养试验24综合√(7）学时合计727216第二篇酿造工艺学实验酿造工艺学实验项目及其各专业必修、选修表实验序号实验项目实验学时实验类型实验类别面向专业（以下打“√”为必修，“＊”为选修，数字为开课学期）生科生技生工食品1葡萄酒酿造过程24/14综合√(6）√(4）2葡萄酒结束理化指标的测定8/0综合√(6）√(4）3葡萄酒感官品评4/2综合√(6）√(4）4乳酸发酵工艺10/8综合√(6）√(4）5醋酸发酵工艺10/8综合√(6）√(4）学时合计56/325632第一篇发酵工程设备实验一小型生物反应器的安装与拆卸机械搅拌式生物反应器，又称发酵罐，是生物工程设备的重要组成部分，在微生物工程、酶工程、细胞工程（细胞培养）、基因工程（基因工程菌）等科学研究领域，生物反应器均为生物技术转化为产品必要的设备。由于小型生物反应器进料、出料、清洗、电极校正等过程都不同于大型发酵罐，需要拆卸之后进行，因此熟悉生物反应器结构及安装与拆卸操作是正确使用反应器的前提。一、实验目的掌握生物反应器安装和拆卸的操作规程，认识和了解生物反应器的结构与功能。二、基本原理生物反应器装置分两大部分：1.罐体及内部的各传感器、检测电极；2.罐外检测控制装置，蒸汽及无菌空气系统。反应器罐体具有可卸上盖，与罐体是通过橡皮垫圈和螺栓密封。盖上设有接种口、空气进口、尾气出口、各种检测仪表的插孔、温度传感器及溶氧电极和pH电极插口、消泡剂和酸碱液注入口、取样口、备用口、压力表、安全阀等；罐底部设有夹套层，用以热交换，罐内有搅拌桨叶、档板、空气分布器；罐外：连接各种传感器及电极相应的控制器，可以自动地调控试验所需的培养条件；连接无菌空气系统，并配备一台自动调控装置；连接蒸汽发生器，供灭菌使用。三、实验装置3L园柱形机械搅拌式生物反应器尾气图1机械通风式搅拌生物反应器尾气四、实验步骤1.首先断开所有电源。2.卸下可移动的所有检测电极和探头。3.拧下螺栓，打开上盖，检查培养罐内部是否清洗干净。4.插入校正完毕的pH电极和氧电极于罐侧面相关位置，并与放大器连接。5.加入配置好的培养液，加盖（由于盖上的零件较多，必须对准位置后再盖上去），并对称拧紧螺母，直至上盖被密封固定。6.将事先清洗干净并开启的尾气过滤器装于盖上，安装安全阀、泡沫传感器、观察灯、压力计、取样管，以及灭过菌的无菌空气过滤器进气管等，剩余的孔洞须用硅胶塞和瞎塞拧紧备用。7.检查检测系统的连接，调试密闭。8.作出3L机械通风搅拌式生物反应器的结构示意图，注明各装置名称。9.标注检测系统的连接。五、思考题1.小型生物反应器的安装和拆卸应该注意那些问题？2.pH电极、溶氧电极如何校正？实验二小型连续培养实验装置的设计组建连续培养是在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物，理论上对数生长期可无限延长。不同于分批培养发酵周期受培养基消耗殆尽的影响，连续培养使微生物在特定的环境中持续保持旺盛生长状态，随着培养基不断加入，产物不断生成排出，减少了非发酵时间，可提高发酵工业的生产效益和自动化水平。常用的连续培养方法有恒浊法与恒化法两类，恒化连续培养在研究微生物利用某种底物进行代谢的规律方面被广泛采用。本实验设计组建实验室恒化法培养装置，有助于对恒化法连续培养及装置特性加深理解。一、实验目的设计组建小型微生物连续发酵装置，掌握连续发酵的操作原理和方法。二、实验原理恒化法是通过控制培养基中营养物主要是生长限制因子的浓度来调控微生物生长繁殖与代谢速度的连续培养方式。由于培养基质加入流量与产物流出的流量保持恒定，随着培养时间的推移，培养器中各物质浓度不随时间改变，称为恒化法，设计恒化器培养装置除满足液体深层培养所必须的条件外，着重在于满足上述条件。三、实验仪器与材料三角瓶、玻璃槽、玻璃管、棉花、蠕动泵、橡胶管、磁力搅拌器、温度计、酒精喷灯四、实验步骤1.用实验室仪器设计一套恒化法连续培养装置（厌氧培养），并组建安装。2.画出你所组建的简单连续培养装置示意图并注明各装置的作用。3.设计出求算单级连续培养比生长速率的实验步骤及求算µ的过程。五、思考题1.在你组建的装置中如何实现培养器中基质浓度的恒定？如何保证培养过程无污染？2.连续发酵培养在工业生产与科研上的意义？实验三体积溶氧传递系数的测定单位体积发酵液氧传递系数kLa可称为“通气效率”，不同类型的发酵罐由于供氧装置的不同其体积溶氧传递系数不同，kLa大意味着反应器供给单位发酵液的氧的能力强。通过kLa的测定，可了解发酵过程中氧的传递效果的好坏，对提高氧的利用率和增产节能都有着重要意义。一、实验目的学习运用亚硫酸盐法测定小型生物反应器的kLa值。二、基本原理用Cu2+为催化剂，溶解在水中的氧能立即将水中的SO32-氧化成为SO42-，其氧化反应的速度在很大范围内与SO32-的浓度几乎无关。因此氧化速率是控制氧化反应的因素。其反应式如下：2Na2SO3+O22Na2SO4剩余的Na2SO3与过量的碘作用Na2SO3+I2+H2ONa2SO4+2HI剩余的I2用标定的Na2S2O3溶液滴定。标准Na2S2O3溶液的用量取决于溶解氧的量。每1ml溶氧可氧化2molNa2SO3，也就消耗掉4molNa2S2O3。因此每消耗1molNa2S2O3（与对比样的体积差）必有1/4mol溶氧在通氧过程中参与反应。则：溶氧当量Nv=KLa（c*-c）KLa=Nv/0.21三、实验仪器与材料3L生物反应器、250ml三角瓶、25ml移液管、滴定台、滴定管、Na2SO3、CuSO4、碘溶液、Na2S2O3四、实验方法与步骤1.称取12.6gNa2SO3和0.072gCuSO4。按实验一方法打开发酵罐，将1L自来水加入到发酵罐中，开始搅拌，依次加入Na2SO3晶体和CuSO4，搅拌使完全溶解。取样10ml，作为未通气的对照组，注入预先准备好的过量的碘溶液中。2.安装好发酵罐，检查使密闭。开阀通气，打开搅拌器到常用转速。气阀开启迅速调至预定空气流量。当罐内溶液中有气泡冒出时，开始计时，作为通氧时间的开始。3.氧化时间持续10-20min，到预定时间停止通气和搅拌，准确记录通氧时间。4.取样10ml作为样液，注入预先准备好的过量的与对照组所注入的相同量的碘溶液中。5.在对照组与样液中分别加入淀粉溶液3滴作为指示剂，分别用标定的Na2S2O3溶液滴定，至碘溶液中蓝色消失。6.分别记录对照组与样液滴定所消耗Na2S2O3溶液的量。五、实验结果滴定前读数滴定后读数滴定消耗量△V对照液滴定V1=样液滴定V2=六、思考题1.kLa的大小受哪些因素的影响？2.测定kLa值其他方法有哪些？实验四摇床培养确定酵母菌体培养条件正交试验(Orthogonalexperimental)是研究多因素多水平的试验方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法，可大幅度减少试验工作量，因而正交试验在很多领域的研究中已经得到广泛应用。本实验即是利用正交试验的方法选择酵母最佳培养基以掌握正交试验的方法。一、实验目的通过摇瓶法确定发酵周期，学习应用正交法确定发酵培养基最佳配比。二、实验原理1.培养周期的确定。生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，可采用直接比浊法进行测定。摇瓶培养中通过定期取样测定酵母浓度，找出对数生长末期确定为培养终点。2.最佳培养基的确定。在碳源、氮源、无机盐初步确定的前提下，通过四因素三水平正交试验，可判断四因素组合时各因素的最佳浓度，从而确定最佳培养基。三、实验仪器与材料1.实验仪器：全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、超净工作台、高压灭菌锅、天平；250ml三角瓶、50ml三角瓶、移液管（移液枪）。2.试验材料：葡萄糖、蔗糖、酵母膏、KH2PO4。四、实验方法与步骤1.养基的配制(见表1，2)表1正交表试验设计（100ml）因素水平葡萄糖蔗糖酵母膏KH2PO411.00.00.50.522.01.01.01.033.02.02.02.0表2正交表实验方案编号葡萄糖(A)蔗糖(B)酵母膏(C)KH2PO4（D）生物量（OD）0h12h24h36h48h60h1(1)(1)(1)(1)2(1)(2)(2)(2)3(1)(3)(3)(3)4(2)(1)(2)(3)5(2)(2)(3)(1)6(2)(3)(1)(2)7(3)(1)(3)(2)8(3)(2)(1)(3)9(3)(3)(2)(1)K1K2K3极差R2.取250ml三角瓶将上述培养基配制200ml，取6个50ml三角瓶各装入培养基10ml，及剩余的培养基（用于测定时稀释，当OD值小于或大于）于121℃下灭菌30min，冷却。（制备无菌水）3.冷却后接种0.5ml（接种量为5％），置于28℃培养箱进行培养。4.测OD值：将接种0h、12h、24h、36h、48h、60h不同时间的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定OD值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将OD值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。5.作各因素水平的K图。6.根据试验数据判定发酵时间及最佳培养基配比。五、思考题1.为什么要作K图？如果实验继续深入，应该改变那些因素水平，为什么？2.R值反应的是什么？有何意义？实验五反应器培养液的灭菌与接种培养小型台式玻璃生物反应器置于高压锅中灭菌，而金属制生物反应器的灭菌是采用夹套层蒸汽加热灭菌的方式进行的。由于结构的差异小型生物反应器灭菌与大型发酵罐灭菌操作有一定的差别，小型生物反应器的上盖上有众多的电极接口，需防止蒸汽打湿；蒸汽的进出口路线也有所不同，需保证蒸汽进出畅通。通过实际操作熟悉灭菌的过程。一、实验目的学习和掌握生物反应器灭菌与接种培养的操作，认识和掌握运用现代化反应器的操作规程及方法。二、实验原理将反应器内培养液的温度升至121℃，以达到灭菌的效果，灭菌后的培养基冷却至培养温度后，即可接种培养。接种时，严格按照无菌操作进行，避免杂菌污染。三、实验仪器与材料1.实验仪器5L升生物反应器、蒸汽发生器、反应器控制台、三角瓶；2.实验材料菌种：酵母菌；培养基：葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，无机盐。四、实验步骤与方法1.灭菌：在反应器安装就序后，接通电源，打开控制台总开关，开启冷却水阀，分别按下温度、pH、溶解氧、搅拌器开关键，调节搅拌器转速约120rpm，调整灭菌时间（30min），设置灭菌温度（121℃），同时，按下灭菌开关键。使电加热器对罐底夹套层进行加热，罐内温度逐渐上升，待温度升至105℃左右时，关闭废气出口阀。温度继续上升至灭菌温度，自动保温至设定时间后，由冷却水自动冷却至设置的发酵温度。2.培养条件的确定：通人反应器的空气是从空压机经空气过滤器而成无菌空气，再由空气分布管送入灭过菌的培养罐内。在控制台上，设定所需的搅拌转速、发酵温度、pH值，并将空气流量计的流量调至确定值。3.接种与培养：将事先培养好的培养液（在三角瓶中进行摇床培养，处于对数生长期的细胞，以无菌操作方式倒入已灭过菌的带有插在保险管套筒内的注射针及软管的三角瓶内）由接种口接入罐内，接种时，要在接种口的隔膜周围放上浸有酒精的棉花或用1-3ml乙醇覆盖，点燃，以产生上升的气流来防止杂菌污染。接种塞从无菌筒内取出，然后将接种针穿过火焰和隔膜，慢慢插入中心部位，拧紧连接螺帽，直至插入部分固定。接种量大体上是培养液的百分之几。如调节pH值和泡沫时，可将酸液和碱液及消泡剂装入三角瓶，灭菌后，分别经蠕动泵与反应器连接，与罐体连接的方法与接种相同。这样，通过控制台的自动控制，就可以自动地连接流加，使罐内保持所需pH值和泡层状态。4.取样：为了了解培养过程中反应物的变化情况，必须定时地进行取样，取样时，要关闭排气口，使罐内处于正压状态，打开取样口，培养液即可自动流出。但是，在第二次取样时，必须注意将残液放净后再取样。五、思考题1.本实验是采用何种方式灭菌的？你所了解的反应器灭菌方式有哪几种？2.如何保证接种过程中不使反应器内部发生杂菌污染？实验六pH电极、溶氧电极的校正为了准确测定发酵液的pH值和0D值，每发酵周期需对pH电极和溶氧电极进行校正。特别是a)长期未用的电极和新换的电极；b)被测溶液温度与标定时温度相差过大时尤需校正。pH电极的校正一、实验目的了解pH电极、溶氧电极的基本原理，掌握其校正方法及步骤。二、实验原理待校正的pH电极是由氯化银参比电极和玻璃电极组合在一起的复合玻璃电极。复合电极的内层玻璃管与玻璃球泡相通，内充以恒定pH植的标准缓冲溶液，从中引出氯化银电极导线，组成玻璃电极（即指示电极）。在外层玻璃管引入银丝，其表面覆盖一层AgCl薄膜。从上部扩大部分边上的注液口加入饱和氯化钾溶液，就形成氯化银电极，在外玻璃管的下部，开有一小口，装有多孔陶瓷芯，使KCl溶液可稍许向外溶液渗漏，即所谓液络部。复合电极的基本性能参数有电极转换系数（也称Nernst斜率），电极零电位，电极内阻，参比电阻，电极响应时间，耐高温冲击的次数等等，它们都有一定的要求和测试方法，对新使用的电极或已经发酵运行一段时间的电极，其性能参数要发生变化，对某些性能参数要进行测定，决定是否可投入使用。三、实验仪器与材料复合玻璃电极、pH操纵器、标准pH试剂、蒸馏水、Na2HPO4、柠檬酸四、实验方法与步骤打开pH操纵器、测量范围和温度开关，将pH电极的电插头插入放大器插孔。首先测标准pH试剂的温度，然后记下缓冲液瓶子标签上的温度条件下所得到pH值。缓冲液和电极组件应该是在同样的温度，如果不是，则允许2~3分钟时间达到热平衡。温度恒定后，调节温度。将电极浸入缓冲液pH7.0（0.2mol/LNa2HPO416.47mL，0.1mol/L柠檬酸3.53mL）中，获得稳定读数就立即将pH表（asymmetry）设定到缓冲液的值。将蒸馏水漂洗电极玻璃球泡部位，然后用软纸轻轻擦干，再浸入第二种缓冲液pH9.2（1/15mol/LNa2HPO4）或pH4.0（0.2mol/LNa2HPO47.71mL，0.1mol/L柠檬酸12.29mL）中，获得稳定读数后，用斜率电位计（mV/pH）纠正pH值。如此反复2-3次，直至读数与被测试剂相同并稳定。以上程序不得颠倒，否则不能获得有效的校准。图2复合玻璃电极的构造五、思考题1.在pH电极的校正操作过程中应注意哪些事项？溶氧电极的校正一、实验目的了解溶解溶氧（DO）电极的基本原理，掌握其校正方法。二、实验原理a电解型电极b原电池型电极图3氧电极的类型1.(极谱型)电解型电极电解型电极是由一个阴极（贵重金属如铂或金）、一个阳极（Ag/AgCl）和一种电解质，如中性NaCl溶液组成的。在某一溶氧浓度一定的溶液系统中，通过电极之间约0.6-0.8的电压，使溶解氧在阴极上被还原，从电极的电流~电压极谱图（图6）可以看出，OA为极谱残余电流；A点为氧的分解电压，当外加电压大于分解电压A，这时电极输出电流Ⅰ随着电压增大而增加，当达B点后，电极电流就不再随着外加电压而增加，即电极电压进入恒图4扩散电流与氧浓度的关系定区，这时称为饱和电流或扩散电流。当外加电压继续增至C点时，电极输出电流迅速增加，这是由于水被还原成氧所造成的。从图中也可看出饱和电流与溶氧浓度成正比关系。因此，只要把外加电压固定在电流电压图中的平坦部分，电极输出电流就可以校正测量溶解氧，这个固定电压常选在0.6～0.8V之间。反应式为：阴极：O2+2H2O+2e-→H2O2+2OH-H2O2+2e-→2OH-阳极：Ag+Cl-→AgCl+e- 总反应：4Ag+O2+2H2O+4Cl-→4AgCl+4OH-用NaCl或KCl作为电解质，电解质在使用过程中被消耗，必须在一段时间后补充。2.原电池型电极原电池型电极不采用外电压，而是选用参比电位比阴极电位高的碱性金属（锌、铝或镉）作阳极，以贵重金属（银或金）作阴极，这是氧就在阴极自发地被还原，产生电动势。银—铅电池型电极的电子反应为：阴极：O2+2H2O+4e-→4OH-阳极：Pb→Pb2++2e-总反应：O2+2Pb+2H2O→2Pb(OH)2随着时间的推移，这一反应也会氧化电极。为了校正氧电极，使液体被空气中的氧饱和，假定饱和度被扩大至100%显示。电极的零点适宜用氧气调节，因为电极显示是氧分压而不是氧浓度，显然在1MKCl溶液中饱和时氧的实际浓度只有其在水中浓度的73%，但还是假定空气饱和时，在1MKCl溶液中得到与在水中相等的数值显示。三、实验仪器与材料溶氧电极、DO测量放大器（指示组件）、压缩空气、水浴锅、铁架台、Na2SO3。四、实验方法与步骤1.将氧电极置于与恒温水浴（温度调至与被测发酵液相等）相连接的内部盛有水的带夹套烧杯中，并置于气体分布管的上方，电极的连线与放大器连接并将放大器开关打开。2.设置0：将电极置于饱和Na2SO3溶液中，待DO测量放大器显示电压值稳定，调节零电位器，使数字显示器达到0值。3.设置满量程：将空气通入气体分布管，使带夹套烧杯中的水被空气饱和，使其达到充分搅拌。设置压力选择器至三档中的任何一档（即100，200，800mmHg），使数字显示器指向约95%，再操作斜度电位器，仔细调节指示值，至95%显示。4.精度检查：用惰性气体N2通入气体分布管，使水饱和。显示器将指向0，而在此操作期间，压力选择器0和斜度电位器不再调节。五、思考题1.在校正溶氧电极时为何要待DO测量放大器显示电压值稳定？2.溶氧电极如何保养？实验七、生物制品的冷冻干燥冷冻干燥是利用升华的原理进行干燥的一种技术，将被干燥的物质在低温下快速冻结，然后在适当的真空环境下使冻结的水分子直接升华成为水蒸气逸出的过程。在众多的干燥方法中最能保证热不稳定性生物制品的质量：即生物活性不变、外观色泽均匀、形态饱满、结构牢固、溶解速度快，残余水分低。应用于疫苗、抗生素、菌种保藏等。要获得高质量的生物制品（包括部分发酵制品），对冻干的理论和工艺应有一个比较全面的了解。一、实验目的学习和掌握冷冻干燥设备的工作原理、应用范围和操作要点；掌握应用冻干法干燥生物活性物质的方法和要求。二、实验原理物质在干燥前始终处于低温(冻结状态)，同时冰晶均匀分布于物质中，升华过程不会因脱水而发生浓缩现象，避免了由水蒸气产生泡沫、氧化等副作用。干燥物质呈干海绵多孔状，体积基本不变，极易溶于水而恢复原状。在最大程度上防止干燥物质的理化和生物学方面的变性。三、实验仪器与材料ALPHA1-2冻干机、超低温冰箱、生物酶制剂、圆底烧瓶。四、实验方法与步骤1.预冷冻。将已测酶活性的酶溶液置于冷冻容器中，于-80℃超低温冰箱2h进行预冻。2.启动冷冻干燥机，当温度下降至-54℃以下时，打开冷冻机盖快速放入需要冻干的材料（注意戴手套操作，并打开瓶塞），密封冻干器。3.抽真空，使真空度达到20Pa，维持36h左右。4.待冻干材料呈粉状或膜状后，关闭真空泵及冻干机，待真空撤去后，先封好瓶盖，再取出冻干材料。5.将已冻干的酶测定活性，比较冻干前活性。五、注意事项1.制备样品应尽可能扩大其表面积，厚度不超过1cm，其中不得含有酸碱物质和挥发性有机溶剂；2.样品必须完全冻结成冰，如有残留液体会造成气化喷射；3.注意冷阱约为-65℃，可以做低温冰箱使用，但必须戴保温手套操作防止冻伤；4.启动真空泵以前，检查出水阀是否拧紧，充气阀是否关闭，有机玻璃罩与橡胶圈的接触面是否清洁无污物，良好密封；5.一般情况下，该机不得连续使用超过48小时；6.样品在冷冻过程中，温度逐渐降低，可以将样品取出回暖一段时间后（仍处于冰冻状态），继续干燥，以缩短干燥时间。六、思考题1.采用冻干法制备生物发酵剂中应注意哪些问题？实验八3M3机械搅拌通风发酵罐结构的认识机械搅拌通风发酵罐在制药、\o"生物"生物制品的生产开发中起着特别重要的作用。在众多类型的发酵设备中，兼具通气又带机械搅拌的标准式发酵罐用途最为普遍，广泛使用于\o"抗生素"抗生素、\o"氨基酸"氨基酸、有机酸、酶制剂等领域，在生物制品工厂广泛使用。据不完全统计，占发酵罐总数的70%-80%，故又称通用式发酵罐。一、实验目的通过实地观察，了解机械搅拌式发酵罐的内部结构组成，各装置的配备安装及功能。二、实验原理机械搅拌式发酵罐主体包括罐身、搅拌器、\o"轴封"轴封、消泡器、中间轴承，空气分布器、挡板、冷却装置、人孔等，配套装置：各工艺参数监测系统、空气除菌系统、蒸汽热力系统等。发酵罐主体各装置依据设计规范达到各自设置的作用。三、实验设备3M3机械搅拌通风发酵罐.四、实验方法与步骤1.打开人孔及内视灯观察以下各装置。1.1罐体的材料、高径比、封头形式。1.2搅拌器组数、叶轮类型。1.3挡板的组数及安装。1.4空气分布装置的形式。1.5轴封的类型和结构。1.6消泡装置类型和安装。1.7冷却装置的类型。1.8进料、进气、排料、出料、取样装置。1.9加热、冷却装置。1.10压力、温度、pH、溶氧控制接口。2.作出3M3机械通风搅拌式生物反应器的结构示意图，标注以上各装置名称。图5机械搅拌通风发酵罐参考示意图3.考察本设备配备的蒸汽系统组成。4.考察本设备所配备的空气除菌系统组成，并作出空气除菌流程示意图。五、思考题1.小型和大型生物反应器设计上有什么不同点？2.本设备所选用的搅拌叶轮、机械消泡装置、冷却装置分别为何种形？除此之外分别还有哪些类型？3.本设备配备的蒸汽系统蒸汽生产量多大？4.本设备所配备的空气除菌系统为几级？分别采用何种过滤器？实验九1M3中试发酵设备的操作方法发酵车间实地训练是培养技能型人才，增强工程意识的必要途径。通过中试发酵设备全方位的直接操作真正提高学生的适应能力和实战技能。一、实验目的1.通过发酵中试车间实训，体验上罐操作的全过程。2.熟悉车间管路布置及各设备性能。3.掌握空气过滤系统操作、冷却系统操作、工艺参数控制。4.加深对分批培养的基本原理及过程的理解。二、实验原理微生物技术产品从实验室到工业生产的开发过程中，需要进行小试、中试、生产逐级放大培养，中试培养已经近似于生产发酵。其工艺环节包括：空消、实消、空气除菌、接种、移钟、消泡、进料、取样、出料等；工艺参数控制包括：温度、pH值、溶氧、压力等。三、实验设备与材料1M3机械搅拌通风发酵罐、食用菌。图6发酵罐检测装置配备示意图四、实验操作步骤1.空消：首先，清洗培养罐内部，特别要注意在空气分布或取样管导出残留污物。罐内加入20%～30%的水后，通入加热蒸汽（蒸汽需经过滤膜过滤），在121℃下杀菌15min。杀菌过程中不断地打开阀门，确保彻底杀菌。杀菌完成后，从取样管将罐内液体排出。2.培养基制备：培养基的加入量一般为罐容积的50%～60%。将称量好的培养基组分，经溶解后加入到发酵罐中。此时培养液的体积为实际所需培养基容积的80%。由于蒸汽杀菌过程中有大量的蒸汽转变为水，使发酵液体积增大。对于合成培养基的灭菌操作，葡萄糖与磷酸盐应分别灭菌后，在开始培养前加入以避免在杀菌过程中，葡萄糖与氮化合物之间发生美拉德反应，以及磷酸盐与其他金属离子形成沉淀。3.安装控制装置：安装调试好PH电极、溶氧电极。4.实消与冷却：夹套内通入加热蒸汽，是培养液温度达到80℃以上。随后将蒸汽直接通入发酵罐，在121℃下杀菌15min。杀菌过程中，间断打开各阀门，排出内部空气，以保证各出管内杀菌完全。此时如果不采用夹套预热至一定温度，直接通入蒸汽杀菌的话，培养基装置内冷凝水增加，将增加培养液体积调节的难度。杀菌完全后，夹套内通入冷却水，进行培养基的冷却。为保证罐内正压，应通入适量无菌空气。5.操作条件的设定：在无菌条件下连接好酸、碱消泡剂等流入管线。设定好通风量（一般为0.5～2L/min.L）、温度和pH值。6.接种、培养：将浸有酒精的脱脂棉围绕在接种口周围，点火后打开接种口，加入无菌水，调节好罐内培养液量（必要时应加入葡萄糖、磷酸盐等溶液），进而将种子培养液注入。接种

量一般为1%～10%，盖好接种口后，调节搅拌转数至所需值，培养开始。7.取样：为了解培养过程中的变化，需定时取样进行样品分析。由于罐内为正压，打开取样管时，样品自然流出。取样时应将上一次取样时残留在取样管中的培养液去除后在取样。另外，取样后应通入加热蒸汽，以防取样管路污染杂菌。8.培养结束：将电极与培养液全部取出，培养液在121℃下杀菌15min后，排出到指定地点。罐内应冲洗干净。五．思考题1.发酵罐的放大有哪些方法？国内常用的方法有哪些？实验十面包酵母流加培养与分批培养试验流加培养又称补料分批培养，是在分批培养的过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。其优点可使发酵系统中维持很低的限制性底物浓度，减少底物的抑制或其分解代谢物的阻遏作用，避免出现限制性底物浓度过高影响菌体得率和代谢产物生成速率的现象。本实验通过面包酵母流加培养与分批培养的结果加以验证。一、实验目的1.以斜面菌种活化为起始，经实验室菌种扩大、车间菌种扩大至发酵罐培养，熟悉发酵培养的全过程；2.对比分批培养与流加培养面包酵母菌生长过程及菌体得率；3.巩固灭菌、空气过滤、冷却、发酵罐工艺参数控制等操作过程；4.加深补料分批续培养的基本原理的理解，熟悉流加补料过程的控制方法；5.熟悉菌体离心分离及真空干燥过程的操作。二、实验原理面包酵母在通风供氧充足的前提下，培养基中葡萄糖为限制性基质，葡萄糖的浓度对于提高酵母得率是至关重要的。本实验面包酵母培养的目的是获得最大酵母浓度，因此采用葡萄糖流加培养，并比较同样条件下分批培养的效果。三、菌种与培养基1.菌种：面包酵母2.培养基酵母斜面培养基10°麦芽汁固体斜面，pH5.0；酵母摇瓶种子培养基10°麦芽汁，pH5.0或葡萄糖10%，玉米浆1%，尿素O.2%，pH5.0；酵母分批发酵培养基玉米粉经液化、糖化，折合葡萄糖浓度为10%，玉米浆1%，硫酸铵0.4%，pH5.5。四、实验设备与材料1.30L、300L种子罐；3M3全自动发酵罐；2.摇床；3.超净工作台；4.离心机；5.显微镜；6.分光光度计7.灭菌锅8.培养箱9.真空干燥箱10.试管，棉塞，500ml三角瓶，5L三角瓶，分口膜。五、实验方法与步骤1.分批培养1.1总流程斜面培养（斜面培养基配制、灭菌，接种，培养）→摇瓶种子培养→种子罐培养（糖化液稀释至l0%浓度，添加辅料，灭菌，接种。）→发酵罐培养→菌体分离。1.2斜面种子制备自保藏斜面中挑取一环酵母菌体接入新鲜的斜面试管中，于28℃培养箱中培养24h。1.3摇瓶种子的制备将上述培养好的斜面种子接入500ml三角瓶装的灭过菌的100ml摇瓶种子培养基中，在28℃，200rpm震荡培养15-20h。1.4种子罐培养于30L发酵罐装入20L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至30℃，将培养好的摇瓶种子接入发酵罐（接种量2-3%）进行发酵。培养条件为：温度28℃，搅拌转速200rpm，通风量1vvm。1.5发酵罐培养按实验八中步骤，进行空罐灭菌（包括空气过滤器灭菌）、实罐灭菌操作。消泡剂灭菌。将种子罐中的酵母菌种压送至发酵罐，通气量在3—5L/min，搅拌转数200rpm，接种量10％。发酵条件1.4同种子罐培养。1.6过程监控0小时：取样测定总糖和还原糖；4-24小时：每隔4小时取样镜检、测定还原糖、菌体浓度。2.流加培养2.1种子制备同分批培养种子制备过程。2.2流加培养前的准备工作葡萄糖于流加储罐灭菌。2.3流加培养通气量3—5L/min，搅拌转数200rpm，接种量10％。控制流加储罐压力使达到流加25g/100mL葡萄糖，当发酵罐内葡萄糖浓度达到20—30g/L，滴加0.1mol/L氨液，控制培养液pH值为5.0。通过调节风量和搅拌转数控制溶氧浓度在10％左右。2.4过程监控同1.6步骤。3.菌体离心分离将分批培养与流加培养发酵液用布袋初步过滤，放入离心机，转速1000r/min，10min.。4.菌体干燥4.1将离心分离后的菌体置于不锈钢托盘放入真空干燥箱，将箱门关上，并关闭放气阀，开启真空阀，再开启真空泵电源开始抽气，使箱内达到所需真空度，关闭真空阀，再关闭真空泵电源开关。4.2把真空干燥箱电源开关拨至“I”处，设定温度60℃，箱内温度开始上升，当箱内温度接近设定温度时，加热指示灯突亮突熄，反复多次，一般120min以内搁板层面进入恒温状态。4.3当所需工作温度较底时，可采用二次设定方式，如所需工作温度60℃，第一次可以设定50℃，等温度过冲开始回落后，再第二次设定60℃，这样可降低甚至杜绝温度过冲现象，尽快进入恒温状态。（注意：智能型仪表请参照操作方法）4.4干燥时间12h.当干燥时间较长，真空度下降，需再次抽气恢复真空度，应先开启真空泵电机开关，再开启真空阀。4.5干燥结束后，先关闭电源，旋动放气阀，解除箱内真空状态，再打开箱门取出物品。（解除真空后，因密封圈与箱门吸紧变形不易立即打开箱门，经过一段时间后，等密封圈恢复原形后，才能方便开启箱门。）5.称重干燥结束后取出菌体，计算菌体总得率。六、分析方法1.菌体量(X)生物量的测定生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。比浊法。以空白培养基为对照，在550nm处测定发酵液的吸光值。酵母浓度测定(湿重法)：吸取5ml菌液，2500rpm离心5min，去上清液，称量菌体湿重。2.还原糖的测定斐林试剂法3.发酵活力的测定(选做)：称取0.26g鲜酵母，加5g在30℃下恒稳1h的面粉制成面团。置于30℃水中．测定面团从水底浮出的时间。浮起时间在15min内认为样品合格。4.分析决定初始体积V0，比生长速率μ及菌体浓度X的测量，补料速度F与补料浓度SF的计算与控制。七、实验结果1.分别画出分批培养与流加培养过程中，培养液中葡萄糖(g/L)、酵母菌体量(g/L))随流加培养时间的变化曲线；2.分别计算酵母产率(质量分数，葡萄糖)。八、讨论1.流加培养与分批培养菌体浓度的区别何在及原理分析；2.推导理想状况下准稳态恒速流加与与时间参数的方程。第二篇酿造工艺学实验实验一葡萄酒的酿造一、目的与要求1．确定葡萄酒酿造的最佳工艺条件，同时简单了解葡萄酒酿制的工艺原理。2．掌握干红葡萄酒酿造中发酵的监控方法及相关的操作要求。3．了解如何确定葡萄酒酒精发酵的结束，同时对葡萄酒进行分离和封装，转入后发酵阶段。4、熟悉各个理化指标的测定方法。二、实验原理葡萄酒酿造就是将葡萄转化为葡萄酒。它包括两个阶段：第一阶段为物理化学或物理学阶段，即在酿造红葡萄酒时，葡萄浆果中的固体成分通过浸渍进入葡萄汁，在酿造白葡萄酒时，通过压榨获得葡萄汁；第二阶段为生物学阶段，即酒精发酵和苹果-酸乳酸发酵阶段。葡萄酒酿造的目标就是，实现对葡萄酒感官平衡及其风格至关重要的这些口感物质和芳香物质之间的平衡，然后保证发酵的正常进行。葡萄的糖分，全部由葡萄糖与果糖构成，这两种糖在酵母作用下，直接发酵生成乙醇和二氧化碳及种种副产物，同时放出热量。二、实验仪器与材料1.pH计、手持糖量计、温度计、天平、量筒、烧杯、比重计、水浴锅、电炉、移液管、锥形瓶、容量瓶、5L玻璃瓶、塑料盆，纱布。2.斐林试剂A、B液，1%次甲基兰，0.1mol/L氢氧化钠溶液、1%酚酞指示剂、邻苯二甲酸氢钾，95%酒精，盐酸、亚硫酸、白砂糖、酵母、KHCO3。三、实验方法与步骤（一）原料筛选：选择新鲜、无腐烂、充分成熟的葡萄酿造葡萄酒。选好原料后注意除去残枝败叶和青果，尽量避免接触水分和长期存放。无论生产白葡萄酒还是红葡萄酒，都要选用含糖量高的原料，含糖多则产酒精多，如果100毫升的葡萄汁中能够含17克糖，也就是17%的含糖量，发酵后酒精度可以达到10度。此外，含酸量最好是0.6-1.0克/毫升葡萄汁，以造成酸性环境，便于酵母菌的生长繁殖，同时也可以增进葡萄酒的风味。葡萄的出汁率越高越好，这样可以少用原料，降低成本。要达到以上要求，葡萄就要充分成熟。我国栽培的优良酿酒葡萄品种很多，例如，酿造白葡萄酒的品种有意斯林、霞多丽、雷司令、赛美容、白诗南、白玉霓、琼瑶浆、龙眼等。酿造红葡萄酒的品种有赤霞珠、品丽珠、梅鹿辄、宝石、西拉、黑彼诺、法国兰、蛇龙珠等。（二）破碎：破碎的目的是使葡萄汁液与酵母菌接触，这样，酵母菌可以充分地利用葡萄汁中的糖分进行发酵。破碎时要注意以下几点：1、破碎要充分，尽量使每颗葡萄果粒的果皮都能被压破。2、破碎时不要压破种子，以免种子中的油脂、单宁、糖苷等物质溢流到葡萄汁中而引起葡萄酒产生麻、涩、苦等异味。3、避免与铜、铁容器接触，以免增加酒中的铜、铁含量，影响酒的质量，破碎机和压榨机与葡萄汁接触的部件最好用不锈钢制成。4、腐烂的果粒和没有成熟的青果粒都会影响酒的质量，破碎前应摘除干净。5、作红葡萄酒，破碎时要将果梗去除，因为果梗中含有较多的单宁、树脂等，会给酒带来过重的涩味。而且，果梗中的水分较多，带梗破碎会增加葡萄汁的含水量、降低含糖量。破碎是用各种类型的破碎机进行的。（三）压榨：压榨是将果实的汁液或刚完成发酵的新酒与果实皮、渣分离开的工序。作红葡萄酒时，压榨是在前发酵完成以后进行的，而作白葡萄酒时，压榨是在发酵以前进行的。为提高出汁率，作白葡萄酒时可以带梗进行破碎和压榨，另一方面，因为作白葡萄酒是果汁发酵，果汁中单宁含量少，如果带梗压榨可以增加葡萄汁中单宁含量，反而对酒的澄清有利。压榨的关键是掌握好压力，既要使葡萄汁或者新酒被充分地压榨出来，又不能压破种子。为了保证酒的质量，可以采用分次取汁的方法，将不加压力或者稍加压力便自行流出的汁称为自流汁，是作优质酒的原料，大约占汁液总量的50%-55%，然后施加压力榨出的汁称为压榨汁，亦可用来酿制质量较好的酒。如果在果实皮渣中加人水，搅拌后还可溶出一些可溶性的物质，然后再榨出的汁称为“二道汁”，这种汁液只能作质量较差的酒，或者发酵后进行蒸馏作白兰地。（四）果汁成分的调整：果汁中的糖、酸和单宁等，既与发酵有密切的关系，又影响成品品质。酿制一般果酒，压榨的果汁即可进行发酵，但为了使酿成的酒中成分接近，且质量良好，并促使发酵安全进行，必须根据果汁成分的情况进行调整。1.糖分调整：糖是产生酒精的基础。酒精的含量对于葡萄酒的贮藏是有力的保证，酒精含量低的新酒在陈酿期间很容易受到杂菌的感染，一般来说，酒精度为14度以上的酒才是安全的。所谓“酒精度”是指在100毫升的酒液中含有1毫升的酒精为酒精度1度。而生成1度酒则需要在100毫升葡萄汁中含有1.7克的糖或者1升葡萄汁中含有17克糖。增加酒精浓度的方法有两种，一是补加糖使生成足量浓度的酒精，一是发酵后补加同品种高浓度的蒸馏酒或经处理过的酒精。实践中，酿制优质葡萄酒须用前者。补加酒精量以不超过原果汁发酵的酒精量的10%为宜。生产上，可以根据我们所要求达到的酒精度以及葡萄中实际的含糖量来计算需要加人的糖量。（举例来讲，现有含糖量为14%的葡萄，要酿造1000升14度的葡萄酒，需加多少糖？已知，100升葡萄汁需1.7公斤糖生成1度酒。那么，100升葡萄汁需1.7*14公斤糖生成14度的酒，即为23.8公斤糖。100升葡萄汁中现有糖14公斤。需加糖23.8-14=9.8公斤。）

加糖时还应结合酵母菌对糖液浓度的适应性。酵母菌在含糖20克/100毫升以下的糖液中，繁殖、发酵都较旺盛，再增高糖浓度，繁殖、发酵就延缓。因此，生产上酿制高酒度的葡萄酒常用分次加糖法，即先加适量的糖，以适应酵母旺盛地繁殖发酵，等发酵降低糖浓度后，再加剩余的糖。加糖时先将糖溶于一部分葡萄汁中，然后再兑到全部葡萄汁中去，并将其搅拌均匀

2.酸度调整：发酵时，果汁中的含酸量以0.6—1.2克/100毫升为适宜。这是因为酵母菌只有在适宜的酸性条件下才能正常的生长和繁殖。此外，有机酸有利于色素的溶解，改进果酒的色泽，还可以增进果酒的清凉口感。若酸度低于0.5克/100毫升，则另加酒石酸或柠檬酸或酸度高的果汁调整。酸过高，除了用糖浆降低或用酸低的果汁调整外，还可用中性酒石酸钾中和。（五）装瓶（入罐）：葡萄装量不超过瓶容的80％，以预留足够空间便于发酵期间二氧化碳气和热量的排放，防止气体聚集引起的溢罐或者爆瓶；同时按汁量加入60～80mg/LS02，搅匀，S02添加量的计算：[葡萄果实×70%×60]/[0.06×1000]。并加入果胶酶20mg/L(或按说明书)同时取汁测糖、酸、比重、温度。（六）酵母的活化添加：采用工业专用酵母，按照200mg/L的量称取酵母，放入三角瓶中，加入50mL蒸馏水或者果汁，在40℃条件下活化20分钟。在加入二氧化硫4～8h后，向葡萄浆中添加酵母。（七）前发酵：发酵是葡萄酒酿造的生物过程，也是将葡萄浆果转化为葡萄酒的主要步骤。它涉及酵母菌将糖转化为酒精和发酵副产物即乳酸菌将苹果酸分解为乳酸两个生物现象，即酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵。只有当葡萄酒中不再含有可发酵糖和苹果酸时，它才被认为获得了生物稳定性。发酵有人工发酵和自然发酵之分，所谓自然发酵是由葡萄皮上自然附着的酵母菌进行发酵而人工发酵则是选用经过人工培养的纯种酵母加入葡萄汁中进行的发酵，通常人工发酵容易得到质量好而且稳定的葡萄酒。这里，我们先介绍自然发酵的方法。自然发酵时，将经过破碎的葡萄或压榨的葡萄汁用泵抽到发酵池或者发酵桶中，一般装到发酵池桶体积的五分之四。两、三天内由于酵母的呼吸作用，产生二氧化碳，出现大量气泡，如果是混合发酵即汁液与果皮混合在一起，由于果皮与果渣被二氧化碳气体顶起来，飘浮在液面上，因此形成一层似盖子的果皮层，叫“酒帽”或“酒盖”，这时，应将“酒帽”或“酒盖”压入汁液中，以便空气与荀萄汁充分接触，酵母才能得到很好的繁殖，同时也便于果皮上的色素和单宁物质溶于汁液中发酵期间要特别注意温度的控制，由于生产季节气温较高，加上酵母本身放出一部分热量，葡萄汁的温度会很快上升，这时可用冷却排管降温，或用泵抽出葡萄汁散发其中热量再放回去、葡萄汁的温度宜保持在20-30℃之间，经过1-2周，当葡萄汁中的糖分大部分已转变为酒精，含糖量仅为0.5-1.0%时，前发酵即可完成，此时的葡萄汁液已转变为含有酒精的“新酒”或“原酒”人工发酵就是对萄萄汁进行S02杀菌处理后接种工业专用酵母进行发酵，人工发酵的管理与自然发酵的管理基本相同。发酵过程每天测一到两次比重、温度，糖度绘制发酵曲线，并根据发酵曲线，及时调整发酵过程的控制。（八）分离皮糟：用洁净的布袋或纱布，进行挤压或扭压，使葡萄酒与皮渣分离，流出的汁液称为原酒。压榨后的皮糟中仍然含有相当于本身重量的40％～50％的葡萄酒。有蒸馏条件的可立即进行蒸馏，得到皮糟蒸馏酒精。（九）后发酵：当比重降至1010～1020或者含糖量降至0.5%以下，前发酵结束新酒应立即从发酵桶或发酵池转移到贮酒桶中进行后发酵。后发酵是一个缓慢而又复杂的过程。在此阶段，少量残糖继续生成酒精，同时酒中的酸与酒精发生作用产生酯的芳香，开始了陈酿。由于后发酵过程中发酵逐渐停止，香气逐渐增加，酵母活力减弱，增加了有害杂菌的感染机会，稍一疏忽便会招致酒的酸败。为了避免这种情况，当主发酵终止时，应将原酒移入小口的容器内，并使酒液装满，塞上木塞，大约经过2周左右，酒中杂质慢慢沉积于容器底部，酒液变清，这时可用橡胶管以虹吸方法将澄清的酒液抽出，并将酒度调整至16度～17度。（方法是按每升原酒添加40毫升96度的食用(或药用)酒精。）后发酵期间的管理要求是：1、贮酒桶须预先进行清洗消毒，以免后发酵期间新酒被杂菌感染。2、新酒装入贮酒桶的量，约占桶容积的90-95%。贮酒桶上要安装发酵栓，发酵栓的作用是使桶中的二氧化碳逸出，而外界空气不能进人贮酒桶。在后发酵时，酵母进行微弱的活动，进一步将新酒中存留的残糖转化为酒精，直到没有残糖为止。（十）葡萄原酒的贮藏和陈酿：红葡萄原酒后发酵完成后，要立即添加足够量的SO2。一方面能杀死乳酸细菌，抑制酵母菌的活动，有利于红原酒的沉淀和澄清。另一方面，SO2能防止红原酒的氧化，使红原酒进入安全地贮藏陈酿期。（十一）澄清与过滤：葡萄酒的澄清，分自然澄清和人工澄清两种方法。新酿成的红葡萄酒里，悬浮着许多细小的微粒，如死亡的酵母菌体和乳酸细菌体，葡萄皮，果肉的纤细微粒等。在贮藏陈酿的过程里，这些悬浮的微粒，靠重心的吸引力会不断沉降，最后沉淀在罐底形成酒脚（酒泥）。罐里的葡萄酒变得越来越清。通过一次次转罐倒桶，把酒脚（酒泥）分离掉，这就是葡萄酒的自然澄清过程。红葡萄酒单纯靠自然澄清过程，是达不到商品葡萄酒装瓶要求的。必须采用人为的澄清手段，才能保证商品葡萄酒对澄清的要求。人工的澄清方法有以下几种：1.下胶下胶就是往葡萄酒中加入亲水胶体，使之与葡萄酒中的胶体物质和以分子团聚的丹宁、色素、蛋白质、金属复合物等，发生絮凝反应，并将这些不稳定的因素除去，使葡萄酒澄清稳定。为了使葡萄酒中的胶体和不稳定的大分子团发生絮凝沉淀，必须使其发生两方面的变化：即通过吸附带相反电荷的粒子失去电性，或者通过粒子的相互吸附增加粒子的质量。红葡萄酒的下胶，通常采用蛋白质类下胶剂，如酪蛋白（来源于牛乳）、清蛋白（来源于蛋清）、明胶（来源于动物组织）、鱼胶（来源于鱼鳔）。蛋白胶在葡萄酒内能形成带正电荷胶体分子团。红葡萄酒加胶的效果，一方面取决于红葡萄酒的温度，温度最好在20℃左右。如果温度超过25℃，下胶的效果就很差。另一方面取决于红葡萄酒中丹宁的含量。一般采用先往红葡萄酒中补加丹宁，而后再加胶，这样效果更好。往红葡萄酒中下胶的方法是，把需要的下胶量称好，提前一天用温水浸泡，充分搅拌均匀。加胶的数量，应通过小型试验来确定，一般20mg～100mg/L。下胶是人为方法加速红葡萄酒的自然澄清过程。2.过滤过滤是使葡萄酒快速澄清的最有效手段，是葡萄酒生产中重要的工艺环节。随着科学技术的进步，过滤的设备，特别是过滤的介质材料，不断地改进，因而过滤的精度也不断地提高。过去在葡萄酒工业上普遍使用的棉饼过滤，现在已被淘汰。现在葡萄酒工业广泛用的过滤设备有：硅藻土过滤机、板框过滤机、膜式过滤机3.离心离心处理可以除去葡萄酒中悬浮微粒的沉淀，从而达到葡萄酒澄清的目的。在红葡萄酒生产中应用不多。(十二)红葡萄酒的稳定性处理澄清的红葡萄酒装瓶以后，经过或长或短时间的存放，会发生浑浊和沉淀。葡萄酒生产者的任务，就是要通过合理的工艺处理，使装瓶的红葡萄酒，在尽量长的时间里，保持澄清和色素稳定。葡萄酒的浑浊是指澄清的葡萄酒重新变混或出现沉淀。按红葡萄酒浑浊的原因，可归结为三种类型的浑浊，即微生物性浑浊、氧化性浑浊和化学性浑浊。防止微生物性浑浊的措施是将葡萄酒加热杀菌，或通过无菌过滤的方法，将葡萄酒中的细菌或酵母菌统统除去。防止氧化性浑浊的方法是，在葡萄酒贮藏时，及时添加SO2，保持一定游离SO2含量，可有效地防止氧化。在红葡萄酒装瓶时，添加一定量的Vc。Vc和游离SO2容易和葡萄酒中的游离氧结合，保护葡萄酒不被氧化。葡萄酒的化学性浑浊，是由于葡萄中含有过量的金属离子或非金属离子。通过合理的工艺，把这些不稳定的因素除去，就可以提高葡萄酒的化学稳定性。为了提高红葡萄酒的稳定性，通常采取以下工艺措施：①葡萄酒的热处理红葡萄酒的热处理有二种作用，一方面热处理能加速红葡萄酒的成熟，促进氧化反应、酯化反应和水解反应。另一方面，热处理能提高葡萄酒的稳定性。热处理有以下几种提高稳定性的作用：热处理能引起蛋白质的凝絮沉淀；热处理可使过多的铜离子变成胶体而除去；热处理可使葡萄酒中保护性胶体粒子变大，加强其保护作用；热处理可以破坏结晶核，不容易发生酒石沉淀；加热有杀菌作用，可防止微生物引起的浑浊沉淀；加热还能破坏葡萄酒中的多酚氧化酶，防止葡萄酒的氧化浑浊。红葡萄酒热处理的方法有三种。一种是把装瓶的红葡萄酒在水浴中加热，品温达到70℃，保温15分钟；第二种方法是热装瓶，就是将45℃～48℃的葡萄酒趁热装瓶，自然冷却；第三种方法是对大量要处理的散装葡萄酒，通过薄板热交换器，在温度较高的情况下，瞬间加热，也能达到热稳定的目的。②葡萄酒的冷处理葡萄酒的低温处理，一方面能改善和提高葡萄酒的质量，越是酒令短的新酒，冷却改善感官质量的效果就越明显。另一方面，冷却对提高葡萄酒的稳定性，效果特别显著，是提高瓶装葡萄酒稳定性最重要的工艺手段。冷却提高葡萄酒稳定性的作用，主要表现在以下几方面；冷却可以加速葡萄酒中酒石的结晶，通过过滤或离心，可把沉淀的酒石分离掉；冷却可使红葡萄酒中不稳定的胶体色素沉淀，趁冷过滤可分离掉；冷却能促进正价铁的磷酸盐、单宁酸盐，蛋白质胶体及其他胶体的沉淀。经过低温冷却的葡萄酒，在低温下过滤清后，其稳定性要显著提高。目前人工冷却葡萄酒通常有二种方法。一种是把葡萄酒在冷却桶里，冷却降温，使温度达到该种葡萄酒冰点以上1度的温度，在该温度下保温七天，趁冷过滤，即达到冷却目的。另一种方法是用速冷机冷冻葡萄酒，使葡萄酒瞬间达到冰点，即可趁冷过滤，也有冷冻效果。③提高葡萄酒稳定性的其他方法阿拉伯树胶能在葡萄酒中形成稳定性胶体，能防止澄清葡萄酒的胶体浑浊和沉淀。用阿拉伯树胶稳定红葡萄酒，用量为200～250mg/L。在装瓶过滤前加入。偏酒石酸溶于葡萄酒里，由于它本身的吸附作用，能布在酒石结晶的表面，阻止酒石结晶沉淀，能在一定的时间里延长葡萄酒的稳定期。（十三）贮存、成品调配：贮存：把分离出来的葡萄酒倒入贮酒桶进行贮存，室温为8℃～18℃，相对湿度为85%，贮酒场所应保持卫生、空气新鲜，必须随时使贮酒桶内的葡萄酒装满。成品调配：当甜葡萄酒含糖不足时，需加糖。加糖量=原糖重量×(要求糖度-原酒糖度)/(100-要求糖度)。当酒精浓度低于指标时，需用同品种酒度高的调配，加酒精量=原酒体积×(要求酒度-原酒度)/(100-要求酒度)(十四)红葡萄酒的装瓶与包装葡萄酒的装瓶与包装，是葡萄酒生产的最后一道工序，也是最重要的一道工序。它决定葡萄酒最终以什么样的形式和什么样的质量，进入市场，与消费者见面。红葡萄酒装瓶前，首先检验装瓶酒的质量。经过理化分析，微生物检验和感官品尝，各项指标都合格，才能进入装瓶过程。

为了延长瓶装红葡萄酒的稳定期，防止棕色破败病，红葡萄酒装瓶以前，要加入30mg～50mg/L的Vc。一天能装多少酒，就加多少酒的Vc，加Vc的红葡萄酒必须当天装完。

装盛红葡萄酒的玻璃瓶，国内外通用波尔多瓶，即草绿色有肩玻璃瓶，容量为750ml。新瓶必须经过清洗才能装酒。回收旧瓶，必须经过杀菌和清洗处理，才能装酒。

葡萄酒的灌装，对小型的葡萄酒厂，可采用手工灌装。中型或大型的葡萄酒厂，都采用装酒机灌装。

对于装瓶后立即投入市场，短时间里就能消费的红葡萄酒，可采用防盗盖封口，这样成本低。国内外大多数红葡萄酒，都是采用软木塞封口，软木塞封口比较严密，可以延长瓶装红葡萄酒的保存期限。

所谓葡萄酒的包装，就是对装瓶压塞的葡萄酒，进行包装装璜，使其成为对顾客有吸引力的商品。葡萄酒的包装装璜，主要是加热缩帽，贴大标，贴背标，装盒，装箱等。干红葡萄酒的发酵工艺过程图四、实验结果1.分析测定葡萄原汁成分（糖度、酸度）；2.详述实验室酿造葡萄酒的工艺流程；3.详述实验室酿造葡萄酒的工艺控制要点；4．观察、记录发酵过程中的糖度，PH，颜色，气味，发酵程度。观察时间颜色气味PH糖度发酵程度（现象）五、思考与分析1．如何确定红葡萄酒的皮渣分离时间？2．后发酵的目的是什么？实验二葡萄酒发酵结束理化指标的测定一、实验目的了解葡萄酒酒精发酵工艺，熟悉各个理化指标的测定方法，并对自酿葡萄酒进行理化指标的测定。二、仪器和试剂：1.电炉，蒸馏装置，胶带，酒精计(0-40%)(V/V)；2、斐林试剂A、B液，1%次甲基兰，0.1mol/L氢氧化钠溶液、1%酚酞指示剂、葡萄糖5g/L。三、实验方法与步骤：(一）理化指标测定1.还原糖、总糖的测定：直接滴定法2.总酸的测定：中和滴定法3.酒度的测定：蒸馏法四、实验结果分析测定自酿葡萄酒的理化指标，并根据测定数据分析你所酿制的葡萄酒有何优缺点五、分析与思考简单论述葡萄酒发展前景及葡萄酒酿造副产物的开发与利用附：总糖和还原糖的测定（一）──费林试剂比色法1.实验目的掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用直接滴定法测定还原糖的方法。2.实验原理斐林氏溶液与还原糖共沸，其中斐林氏溶液中的Cu2+被还原糖还原为Cu2O（砖红色）时，反应达到终点，过量的还原糖使次甲基蓝指示剂蓝色褪去，显露出Cu2O的红色即为终点。3.实验材料和用具1）试剂费林甲液：称取68.29g硫酸铜（CuSO4·5H2O），溶于蒸馏水中并稀释到1000ml。费林乙液：称取346g酒石酸钾钠及100gNaOH，溶于蒸馏水中，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。0.25％葡萄糖标准溶液：准确称取2.500g经98-105℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000ml容量瓶中，加入5ml浓HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000ml。2）器具：电热恒温水浴锅，调温电炉，250ml锥形瓶，滴定管。4.操作步骤

1）标定预备试验：吸取费林溶液A、B各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水，摇匀，在电炉上加热至沸，在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时，加2滴次甲基蓝指示液，继续滴至蓝色消失，记录消耗的葡萄糖标准溶液的体积。2）标定正式试验：戏取费林溶液A、B各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水和比预备试验少1mL的葡萄糖标准溶液，加热至沸，并保持2min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。计算式中：F——费林溶液A、B各5mL相当于葡萄糖的克数，g；m——称取葡萄糖的质量，g；V——消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。3）葡萄酒样品还原糖测定：准确吸取一定量的样品（V1）于100mL容量瓶中，使之所含还原糖量为0.2～0.4g，加水定容至刻度。吸取费林溶液A、B各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水和一定量的试样（试样所含还原糖量为0.2-0.4g），加热至沸，并保持2min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。按式（4）计算。4）葡萄酒样品总糖测定：准确吸取一定量的样品（V1）于100mL容量瓶中，使之所含总糖量为0.2～0.4g，加5mL盐酸溶液，加水至20mL，摇匀。于68±1℃水浴上水解15min，取出，冷却。用200g／L氢氧化钠溶液中和至中性，（加入2滴酚酞，用NaOH溶液滴定至微红色）。调温至20℃，加水定容至刻度（V2）。吸取费林溶液A、B各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水和一定量的试样（试样所含总糖量为0.2-0.4g），加热至沸，并保持2min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。按下式计算。

式中：X——总糖或还原糖的含量，g／L；F——费林溶液Ⅰ、Ⅱ各5mL相当于葡萄糖的克数，g；V1——吸取的样品体积，mL；V2——样品稀释后或水解定容的体积，mL；V3——消耗试样的体积，mL；G——葡萄糖标准溶液的准确浓度，g／mL；V——消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL。所得结果应表示至一位小数。5.注意事项1）本法是根据一定量的碱性酒石酸铜溶液（Cu2＋量固定）消耗的样液量来计算样液中还原糖含量，反应体系中Cu2＋的含量是定量的基础，所以在样品处理时，不能用铜盐作为澄清剂，以免样液中引入Cu2＋，得到错误的结果。2）碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。3）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2＋的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。4）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。5）样品溶液应预测，其目的：一是本法对样品溶液中还原糖浓度有一定要求（0.1%左右），测定时样品溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近，通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，浓度过大或过小应加以调整，使预测时消耗样液量在10ml左右；二是通过预测可以知道样液大概消耗量，以便在正式测定时，预先加入比实际用量少1ml左右的样液，只留下1ml左右样液在继续滴定时加入，以保证在1分钟之内完成继续滴定工作，提高测定的准确度。6）必须严格控制反应液的体积，标定和测定时消耗的体积应接近，使反应体系碱度一致。热原一般采用800W电炉，电炉温度恒定后才能加热，热原强度应控制在使反应液在两分钟内沸腾，且应保持一致；否则加热至沸腾所需时间就会不同，引起蒸发量不同，使反应液碱度发生变化，从而引入误差。沸腾时间和滴定速度对结果影响也较大，一般沸腾时间短，消耗糖液多，反之，消耗糖液少。滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。因此，测定时应严格控制上述条件，力求一致。平行试验的样液消耗量相差不应超过0.1ml。

滴定酸的测定—中和滴定法1.实验目的和内容1）采用中和滴定法测定葡萄酒（果酒）中滴定酸的含量。2）适用于各种类型葡萄酒（果酒）中滴定酸含量的测定。以g/L报告其结果，测定值保留一位小数。2.实验原理利用酸碱中和的原理，以氢氧化钠标准溶液直接滴定葡萄酒（果酒）样品中的滴定酸，用酚酞指示剂指示滴定终点，由所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积计算葡萄酒（果酒）中滴定酸的含量。3.试剂酚酞指示剂溶液，10g/L：称取酚酞1.0g，溶于60mL乙醇中，用水稀释至100mL。0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液。氢氧化钠标准溶液，c(NaOH)＝0.1mol/L。1）配制将氢氧化钠配成饱和溶液，注入塑料瓶（或桶）中，封闭放置至溶液清亮，使用前虹吸上层清液。量取5mL氢氧化钠饱和溶液，注入1000mL不含二氧化碳的水中，混匀。2）标定称取0.6g于105～110℃烘至恒量的基准邻苯二甲酸氢钾，精确至0.0001g。溶于50mL不含二氧化碳的水中，加入2滴酚酞指示剂溶液，以新制备的氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈微红色为其终点。同时做空白试验。3）计算按下式计算氢氧化钠标准溶液的浓度：C＝m/(V1-V2)×0.2042式中：C——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；m——基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g；V——滴定时所消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；V1——空白试验消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；0.2042——与1.00mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=1.000mol/L]相当的，以克表示的邻苯二甲酸氢钾的质量。4.操作步骤1）样品的测定取调温至20℃的样品2.00-5.00mL(取样量可根据酒的颜色深浅而增减)置于250mL三角瓶中，加入中性蒸馏水50mL，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，摇匀后，立即用氢氧化钠标准溶液（c(NaOH)＝0.1mol/L）滴定至溶液微红色为终点，并保持30s内不变色，记录所消耗氢氧化钠标准溶液的体积V1。起泡葡萄酒和加气起泡葡萄酒需排除二氧化碳后，再进行测定。2）空白的测定吸取中性蒸馏水50mL置于250mL三角瓶中，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，其余操作同1。3）结果计算按下式计算滴定酸的量，以g/L表示：式中：X——样品中滴定酸的含量，g/L；c——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；V1——样品滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V0——空白滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2——吸取样品的体积，mL；Si——与1.00mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=1.000mol/L]相当的，以克表示的试样主体酸的质量。S酒石酸＝0.075；S苹果酸＝0.067；S柠檬酸＝0.064；S草酸＝0.045酒度的测定1.实验目的和内容1）采用酒精计法测定葡萄酒(果酒)中酒精度；2）适用于各种类型葡萄酒(果酒)中酒精度的测定，结果表示为体积百分数，即%(v/v)，保留一位小数。2.实验原理以蒸馏法去除样品中的不挥发物质，利用酒精计和温度计直接读取酒精度和温度的示值，并加以温度校正，求得20℃时乙醇的体积百分数，即酒精度。3.实验材料全玻璃蒸馏器、酒精计、量筒。4.操作步骤1）用一洁净、干燥的

100

mL容量瓶准确量取

100

mL（具体取样量应按酒精计的要求增减）样品（液温

20℃）于500

mL蒸馏瓶中，用50蒸馏水连续三次冲洗容量瓶，连接酒精蒸馏装置，加热蒸馏，直到蒸出的液体大约100毫升时，用蒸馏水定容至100mL

2）将试样倒入洁净、干燥的100

mL量筒中，静置数分钟，待其中气泡消失后，放入洗净、干燥的酒精计，再轻轻按一下，不得接触量筒壁，同时插入温度计，平衡5

min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度。根据测得的酒精计示值和温度，查附录，换算成20℃时酒精度。所得结果表示至一位小数。实验三葡萄酒感官品评一、实验目的学习葡萄酒感官品评的方法原则，了解葡萄酒品评分析，通过品评发现问题指导生产工艺。二、实验原理感官分析系指评价员通过用口、眼、鼻等感觉器官检查产品的感官特性，即对葡萄酒、果酒产品的色泽、香气、滋味及典型性等感官特性进行检查与分析评定。

三、方法步骤品酒1.品酒工作条件品酒室：光线明亮自然、空气流通、新鲜、室温20度左右，湿度60%-70%品酒最佳时间：早晨10点-12点2.品尝杯：无色透明含铅玻璃杯、不能有任何印记和气泡、颜色或装饰图案。杯身向内弯曲、使杯口收缩、形似削平的蛋壳、容量为200-225ml

品尝杯见图1。

2.调温调节去除标贴后的酒的温度，使其达到：起泡、加气起泡葡萄酒

9℃～10℃；白葡萄酒（普通）

10℃～11℃；桃红葡萄酒12℃～14℃；白葡萄酒（优质）13℃～15℃；红葡萄酒（干、半干、半甜）、果酒（半干、半甜）16℃～18℃；加香葡萄酒、甜红葡萄酒、甜果酒18℃～20℃。

2.

顺序和编号

在一次品尝检查有多种类型样品时，其品尝顺序为：先白后红，先干后甜，先淡后浓，先新后老，先低度后高度。按顺序给样品编号，并在酒杯下部注明同样编号。

4.倒酒将调温后的酒瓶外部擦干净，小心开启瓶塞（盖），不使任何异物落入。将酒倒入洁净、干燥的品尝杯中，一般酒在杯中的高度为1／4～1／3，起泡和加气起泡葡萄酒的高度为1／2。

5.感官检查与评定5.1

外观：在适宜光线（非直射阳光）下，以手持杯底或用手握住玻璃杯柱，举杯齐眉，用眼观察杯中酒的色泽、透明度与澄清程度，有无沉淀及悬浮物；起泡和加气起泡葡萄酒要观察起泡情况，作好详细记录。5.2

香气：先在静止状态下多次用鼻嗅香，然后将酒杯捧握手掌之中，使酒微微加温，并摇动酒杯，使杯中酒样分布于杯壁上。慢慢地将酒杯置于鼻孔下方，嗅闻其挥发香气，分辨果香、酒香或有否其他异香，写出评语。一类香气：源于葡萄浆果、具果味特征；二类香气：源于发酵，具酒味特征；氧化醇香：在氧化陈酿条件下形成的香气；还原醇香：在还原条件下形成（包括贮藏罐、木桶和酒瓶两个阶段）5.3

滋味：喝入少量样品于口中，尽量均匀分布于味觉区，仔细品尝，有了明确印象后咽下，再体会口感后味，记录口感特征。甜：甜味物质是构成柔和、肥硕、圆润等感官特征的要素；酸：源于浆果（酒石酸、苹果酸、柠檬酸）源于发酵（琥珀酸、乳酸、醋酸）；咸：主要是无机盐和少量有机盐；苦：酚类或多酚类物质；涩。5.4

典型性根据外观、香气、滋味的特点综合分析，评定其类型、风格及典型性的强弱程度，写出结论意见（或评分）。四、实验结果：写出品评表评语及评分原则附：啤酒感官品评一、外观：（共10分）1．色泽：淡黄带绿，淡黄色、淡金黄色（5分）2．透明度：清亮透明，有光泽，无明显悬浮物（5分）二、泡沫（共20分）1．起泡性：泡沫高度至杯子的1/2-2/3（5分）2．外观性：泡沫洁白细腻（5分）3．泡持性：5分钟（5分）4．附着力：饮后泡沫挂在杯子内壁上（5分）三、香气（共20分）1．具有新鲜酒花香气（5分）2．无老化味和氧化味（5分）3．无生酒花味（5分）4．无其他怪味、异味和腥味