修改后流式细胞仪fc500培训手册-final

培训日程安 培训所需设备及试 每日开机程 每日关机程 长期关机程 日常保养与.......................................................................................................Flow-CheckTM自动质控操 仪器QC及验证操 双色淋巴细胞亚群获取和分 单色&多色样本获取和分 HLA-B27检 四色免洗淋巴细胞亚群绝对计 DNA测 相关文件：《CytomicsFC500MCLwithCXPsoftwareInstructionsForUse《FC500tetraCXPSystemguide《CYTO-STATtetraCHROMECD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5InstructionsForUse《CYTO-STATtetraCHROMECD45-FITC/CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5InstructionsForUse《HLA-B27-FITC/HLA-B7-PEInstructionsForUse《CoulterDNAPrepReagentsKitInstructionsForUse流式细胞仪装机培训日程安排第一天件的建立，并以Immuno-Trol样本做四色标记做为最终验证管验证结果）;第二天第一天实验内容全部练遍第三天前两天内容全部练遍仪器的日常及保养，简单故障的排除课程评估（通过用户各步骤独立上机操作确认培训所需设备及试剂心12x75mm的5ml试管)；固定或可调节的加样器及相应加样头若干：20ul,50ul,100ul,200ul,250ul，多聚PBS配制方法：800mlNaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24gpH7.2～7.4（HClNaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同）1L，0.22μm滤多聚溶液配制方法：液用PBS配制4%多聚溶液，待完全溶解后（溶解时需要不断搅用时，用PBS稀释为2%浓度的应用液。应用液2-8C存放，可使用一周。CytomicsCytomicsFC检查鞘液桶，确认：检查废液桶，确认：400ml检查液桶，确认：加满液打开电源箱开关，启动计算机。在出现的Windows操作系统登陆框内输入用户名及相应点击桌面图标，启动流式细胞仪注意：30打开电源箱门，检查并确认：AIRFILTERVACUUMFILTERWATERTRAP液体不超过VACUUMTRAP液体不超过SYSTEMVACUUM计量表，确认读数在-17~-30in.HgSYSTEMPRESURE计量表，确认读数在28~32PSIADJUSTER钮旋转调节压力至30±2后，将调节钮复位。执行Prime，并排除管路中气泡激光器预热10-15分钟，待仪器主机面板指示灯变为，且提示“Awaiting每日工作后，执行如下关机程序1，常规用2ml有效氯浓度0.5-1%的次氯酸钠溶液（或Cleanse液）做样品，置于进样盘上1号位置，用另外3个洁净的样本管每管2ml蒸馏水或鞘液置于进样盘上2-4位置。在ResourceExplorer状态栏中单击PANEL图标，选择Cleanse.PNL拖到AcquisitionManagerCarouselNoLocation(试管位点击的运行键，运行程序MCLMCL清洁样本头:0.5-1%MCL上盖，上下来回擦拭样本头至少10次。15真空管路：按Cytometer主界面上的键，使其处于Idle（闲置）状态将两个真空管 适配器内加满双蒸水，分别放在进样盘的1、2号位置，将进样盘置于MCL上，并盖好上盖。当屏幕显示“PressIdleModebuttontoInitialize”时，单击 键，屏幕显示“Cleansecycleinprogress”，进行真空管路当屏幕再次显示“PressIdleModebuttontoInitialize”时，完毕，取下进样盘，盖好MCL上盖。按键使仪器恢复初始状态CLENZ液程序当执行完上述流程后，直接点击软件上的Cleanse键，此时仪器调 当屏幕显示“PressIdleModebuttontoInitialize”时，结束按键使仪器恢复初始状态。仪器自动将 液排入废液桶内，将鞘液充满退出CXP软件，关闭所有窗口，在弹出的窗口中选 或，认是否需要保存对Protocol的更改 长期关机程序用户常错误地认为，仪器不用的时候，不要去开启它的电源，这样可以延长它的寿命。事实恰恰相反，所有的仪器，开的越多故障发生率就越低，(某些部件有时间除外)。我们建议CytomicsFC500的用户，每周至少开机1-2次。如果实在没有样本，请开机后，以蒸馏水为样本运行15分钟后关机。如确有需要超过一个月以上停机，请执行以下长期关机程序：取下鞘液桶和液桶，倒空桶内液体以蒸馏水冲洗鞘液桶和液桶将鞘液桶和液桶新放回仪抽屉内在两个桶内注满022μm膜过的蒸馏水。取4个试管，每管加入2ml蒸馏水，将4个进样管置于进样盘上1-4号位置。执行常规程序（至少3次，以保证将管路内含盐鞘液充分干净）执行真空管路点击，使蒸馏水充满真空管路按键，使仪器恢复初始状态正常关机，切掉所有电源。当重新启用仪器时，需执行以下程序鞘液桶和液桶将鞘液桶内充满鞘液，液桶充满液执行常规程序在运行样本前，执行Flow-Check质控程序。CytomicsFCCytomicsFC500流式细胞仪的正常运转和测定结果的可靠，仪器的日常保养与维3、Prime（排除液路系统气泡8、液60液的选择Cleanse液：流式细胞仪的常规用液，直接使用，可有效去除仪器管路内的样本、5-10%0.45m0.5-1%，表面活性剂——Triton1%，0.45m洗完毕后，一定要用蒸馏水，再次冲洗管路。蒸馏水必须以0.22m滤膜过滤后备用。仪器日常在下述情况下应进行仪器日常以清洁进样管路和样本头在使用了一些荧光染（PI、EB、AO、TO）后，也需要立即进行样本头和进样准备一支上样管，加入2ml漂白剂；另一只上样管，加入3ml蒸馏水将上述两管当做样本分别放在进样盘上，1号为漂白剂，2定期需要定期进行仪器检查和清一般6个月更换一次鞘液过滤器。网需要定期检查，发现滤网脏了，就需要了。注意：取下及安装时切勿损坏滤网。Flow-CheckTM自动质控操一、实验试剂：Flow-CheckTM荧光微球 488nm激发，发射光谱525-700nm，用于校准FS、SS散射光参数和FL1-FL4荧光参数PC7（770/488）Setup 488nm激发，发射光谱750-800nm，用于校准FL5荧光参APC（675/633）Setup PC7SetupAPCSetup√√√√√√√√Flow-Check质控所需要的试剂，置于室温平衡10分将校准微球充分混匀，按下述方式准备校正所需样本如仅需Flow-Check微球，取约0.5ml（15-20滴）加入12×75mm的试如需Flow-Check2：1的比例加入12×75mm的试管，即滴如需Flow-Check微球和另外两种微球，按2：1：1的比例加入12×75mm的试管，注意：为了避免污染微球，直接用微量加样器从瓶中吸取三、Flow-Check质控上机操作步骤CytomicsFC500点击“资源导航器 Explore）中“Protocols”面板，选择（Acquisition）”文件夹中相应文件（如：QC1LFlow-Check.PRO或QC2L在WorklistManager中输入自动上样盘号码（CarouselNo.）、样本管位置（Location）、 单 “CytometerControl”键，在“SetupMode”选项前打“√”按下“Start 按键，开始进行样本分析：调整FS、SS电压，使微球位500/500的位置，并以A门圈中图中的微球，调整各荧光直方图中的峰Mean值约注意：若HPX-CV>3%，请依次按如下方案观察仪器是否预热>20分钟按软件上的PRIME键，排除气泡干扰后重新运行Flow-选择 Panel反复仪器后重新运行Flow-若经以上处理后，HPX-CV仍然>3%用户可每日按下表填写质控结果，追踪仪器状态日仪器QC及验证操作Flow-SetTM质控微球可用于连续监测仪器状态的稳定性，了解光路和液路的情况，有利于保证实验的一致性和稳定性并设定各实验参数的靶值范围；利用 p标记实验样本，可以进行仪器的自动补偿条件设置。用Immuno-Trol或Cyo-Trol进行四色抗体标记，通过与靶值比较验证实验过程中从样本到结果分析是否在控。推荐每周进行一次QC及验证，每日开机进行一次Flow-Set质控，记录FS和各荧光信号的HPCV值，追踪一定时间内HPCV的变化，了解仪器的运行情况。一、实验试剂：Flow-SetTM荧光微球 488nm激发，发射光谱525-700nm，用于校准FS、SS散射光参数和FL1-FL4荧光参数p4Immuno-Trol )及Immuno-TrolLow CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3- 红细胞裂解液(OptiLyseC,PN:A11895):即用型，室温保存（18-FlowCount计数微球 1、Flow-SetTM荧光微球：取约0.5ml（15-20滴）加入12×75mm的试管Low，分别向前5管加入100μlImmunotrol质控血，第6管加入Immuno-TrolLow质控号管中加入20μlCD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5，涡旋混匀后，室温避光孵4、取出试管，每管加入红细胞裂解液OptiLyseC，涡旋混匀，室温避光10分钟向加样法加入100μlFlowCount微球。加入微球后2小时内必须上机检测。三、Flow-Set质控上机操作步骤CytomicsFC500tetraCXPAutoSetup（自动设置）之前，确认在“EditProducts（编辑产品）”框中已正确地输入了QC产品信点击菜单栏中“Tools”，选择“AutoSetupScheduler”选项，在弹出的框中选择“ASLSA45-84-8-3-C”，或者需要进行单平台绝对计数选择“AStetraCXP45-84-8-3FC-C”；在“CarouselNo：”对应的方框中输入转盘号，如“1”；单击此时出现“CarouselLoadReport”屏幕，仪器自动加载实验方案；如不需要绝对计如果需要绝对计数，请关闭该窗口，在AcquisitionManager中点击图标，在弹出的“AbsoluteCountCalibration”框中，钩选“ManualAbsoluteCountCalibration “Enable，确认样本管位置（Location）是否正确，并按正确顺序将各样本管摆在上样转盘上，打开转盘盖子，将转盘置于仪器上，盖好盖子，点击“”开始分析，所有样本运行完毕后，点击“Finish”。确认“接受”还是“”该仪器设置：点击“RejectAll”，（不保存）细胞设置，并根据需要排除系统故障后重新进注意：若HPX-CV>3%，请依次按如下方案观察仪器是否预热>20分钟按软件上的PRIME键，排除气泡干扰后重新运行Flow-选择 Panel反复仪器后重新运行Flow-若经以上处理后，HPX-CV仍然>3%用户可每日按下表填写质控结果，追踪仪器状态日双色淋巴细胞亚群获取和分析【实验目的和原理【实验试剂①Isotypecontrol（IgG1-FITC/IgG1-PE）,④CD3-FITC/CD8-PE,PN:A07734；⑤CD3-FITC/CD16+56-PE,2、红细胞裂解液(OptiLyseC,PN:A11895):即用型，室温保存（18-3、0.01MPBS4、Immunotrol质控血 ）或者EDTA抗凝血【实验步骤取5支流式试管，编号为1、2、3、4、5，分别将100μl抗凝全血或Immunotrol质控血加入5号试管中，不要将血挂在试管内壁上在各管中依次加入20μl的IgG1-FITC/IgG1-PE、CD3-FITC/CD19-PE、CD3-FITC/CD4-PECD3-FITC/CD8-PE、CD3-FITC/CD16+56-PE，涡旋混匀后，室温避光孵育20分取出试管，每管加入500μl红细胞裂解液OptiLyseC，涡旋混匀，室温避光10分钟（约1200rpm）离心5min，弃去上每管加入2ml的PBS，涡旋混匀，300g离心5min每管加入0.5mlPBS混匀，4℃避光1h内上机检测；若不上机，加入0.5ml含1-2%多聚【注意事项 弃掉试管中上清液时，一定保证垂直倒掉，不能反复倾倒，防止细胞丢失2~8℃保存，抗体试剂在保质期内稳定，不能冻存。抗体保存期间或与细胞孵育时注意避 任何试剂的外观改变，如沉淀、变色，都表明试剂已不稳定，这时试剂不能使用。④为得到理想结果，血样应在静脉穿刺后6h 操作时如未按指定的孵育时间、离心次数或温度进行，容易发生错误。 抗体试剂虽含有叠氮钠保护剂，仍需注意微生物污染，以免导致错【群淋巴细胞亚群正常参考值】（各最好建立自己的参考值CD3（总T淋巴细胞 50-CD3+CD4+(Th细胞 27-CD3+CD8+(Tc/Ts细胞 15-CD3-CD16+CD56+(NK细胞 7- 5- 2、选择参数：单击中的“CytometerControl”，选择“Acq.Setup”选项卡，点击3、建立该实验方案所需图形：本实验需要画两个图①SS/FS双参数点图：单击 中的（ColorDotPlot）键，X轴参数选择“SSLinSSLin”,Y轴参数选择“FSLinFSLin”，Gate参数选择“Ungated”，如需在图形中直接显示细胞相对面分含量，可在“Show%onplot”前的方框中打“√”，如下图。单击OK。单击（PolygonalRegion）键，在FS/SS点图中画多边形门A，用来②FL1/FL2双参数点图：单击 中的（ColorDotPlot）键，X轴参数选择“FL1-FITCFL1LOG”,Y轴参数选择“FL2-PELOGFL2LOG”，Gate参数选择“A”，如下图左，单击OK。 中选择键，在FL1/FL2点图中第一个对数格处画十象限，如下图③将鼠标移至该图左下角，出现“∑”时，单击鼠标左键，显示统计。单击“∑”图标，可编辑统计项，依据本实验所需数据要求在弹出的窗口中选择Number、“MeanCalculationMathod”选项前打“√”，如图。 图标，保存实验方案；4、设定对应坐标轴：单击菜单栏“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在弹出的对话框中选择“Parameters”栏中的“FL1Log”,在对应的“Name”栏中输入“IgG1-FITC”；选择“图标，保存实验方案；5、单6、单击菜单栏“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在弹出的框中选择7、单击菜单栏“File”→“SaveProtocolAs…”，在弹出的框中输入“2CLym3-8、单击菜单栏“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在弹出的框中选择10、单击菜单栏“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在弹出的框中选择12、单击菜单栏“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在弹出的框中选择二、建立实验组合1、单击菜单栏“File”→“New”→“NewPanel…”，在弹出的框中“PanelName”栏中输入组合名称“2CLym”，在“NoofTest”栏中输入“5”，单击“Next”；2、在新的窗口中选中“Useplotsandgatesfrom”，并在其下方选项栏中选中“2CLymIsotype.PRO”，选中“Useregionsfromprotocol”，单击“Next”；3、在新的窗口中选中“Useplotsandgatesfrom”,并在其下方选项栏中选中“2CLym3-19.PRO”，选中“Carryregionsfromprevioustest”,选中“Useinstrumentsettingsfromprevioustest”（如下图）,单击“Next”，以下各管分别选择“2CLym3-4.PRO2CLym3-8.PRO”、“2CLym3-16+56.PRO”，其它选项不变，最后单击三、设置数据获取条1、单击菜单栏“View”→“CustomizeWorklistColumns”,在弹出的框中钩选“Panel、Protocol、RegionSource、Cytosettings、TubeID、CarouselNO.、Location、SampleID1、SampleID2”,单击“OK”；2、单击菜单栏“File”→“WorkspacePreferences”，在弹出的框中钩选“SampleID1、SampleID2、Y2KDate、TagNumber”，并选中“Starteachpanelat001”，其 Lym.pnl”拖至“AcquisitionManager”区域中，在“SampleID1”栏中输入患者姓名，“SampleID2”栏中依次输入“control、3-19、3-4、3-8、3-16+56”；4、获取停止条件设定：在“Acq.Setup”选项⑴．设定获取时间：“Acquisitionlimits”中的Duration（获取时间）默认为300（S；设定细胞总数：“Acquisitionlimits”中的Max.events(总细胞数)默认为2000个淋巴细胞，在FL1/FL2图中单击右键，选择“Format”，在弹出的框中，单击“StopandSave”选项卡，在“UseStopCondiion”前的方框打“”，并在“um注意：以上三个条件可根据实验要求进行更改，最先满足任一条件即停止数据获取。阈 A门内细获取停5、单击图标，在“SetupMode”前打“√”，“Baselineoffset”前面的方框不打6、设定阈值：在“Acq.Setup”选项卡中设定阈值，扣除碎片。通常以FS为阈值7、电压调节：单击“CytometerControl”窗口中的“Detectors”，调整FS、SS电压，并调整A门圈定淋巴细胞，使SS/FS点图中细胞分布良好（如下图左）；调整FL1、FL2电压，使FL1/FL2点图中细胞群位于左下象限（如下图右）；单击图标，保存实验条件；“Baselineoffset”前面的方框打“√”，去掉“Setup8、补偿调节：1号样本管数据收集完毕，自动换上2号样本管，在“SetupMode”前打“√”，“Baselineoffset”前面的方框不打“√”，在“CytometerControl”窗口中“P”选项前打“”，在荧光点图上出现快速调节滚动条，直接拉动垂直滚动条，调节FL2-FL1%，直到FITC单阳性细胞落在图中右下象限，如下图，继续微调，使B3和B4区域内细胞群平均荧光强度Y-Mean一致（差值<0.1）。通过拉动水平滚动条，调节FL1-FL2%，直到PE单阳性细胞落在左上象限，且B1和B3区域内细胞平均荧光强度X-Mean一致（差值<0.1），单击，保存条件；“Baselineoffset”前面的方框打“√”，去掉“SetupMode”前的“√”，收集数据；9、234、5号样本四、实验数据分析及报告格式设打开CXP分析软件，选择“File”→“New”→“NewProtocol”；选中出现的第一张点图，单击右键选择“FormatPlot”，在弹出的 中选中要分析的数据文件（wangcontrol2010-04-25001.LMD），其余选项如下图左所示，点击“OK”；在图形上圈淋巴细胞为A门；单击图标，在弹出的框中选择图标，在弹出的框中选中要分析的数据文件（wangcontrol2010-04-25001.LMD），“Gate”参数选择“A”，“XParameter”选择“IgG1-FITC”，“YParameter”选择“IgG1-PE”，点击“OK”；点击图标，在FL1/FL2图中沿细胞群边缘做十字象限；2、3、4、5FL1/FL2荧光点图，单击图标，在弹出的框中定义文件名（2CLymANA.PRO）,点击“Save”保存实验方案；创建FLO⑴．选择或者菜单栏“Insert”→“BlankFlo⑵．点鼠标左键选中以上绘制好的参数图，拖到新建的FloGE上，FloGE会直接显示统计结果；单击“SaveProtocol”，保存方案。如需打印报告，单击“File”→“Print”，在注意注意：FloGE上的图形和工作区中的图形是同步LMDData到工作区时，打印页中的图形也会随之更分析下一个数据时，将下一个标本的第一管数据拖入“Proocol”图中，然后按住“Ctrl”键分别将第、、、管数据拖到第、、、中，“Flo GE”中的图直接显示数据结果；更改相关信息，打印报告。单色&多色样本获取和分析单按实验要求进行适当的样本按实验要求设计Protocol。画两个图SS/FS②第二个图是相应荧光参数的直方图（，保存上样本管①先看第一，调整FS、SS电压和FS阈值，使细胞群位于图中合适位置，作门A，圈②再看第二，让第二显示A门内的细胞群，调整相应荧光电压，使得细胞峰位于左侧荧光表达区域内，设阳性门B，阳性门内细胞%在1～2%左右，保存实验条件。③记录样本管数据3.所有条件保持不变，依次记录所有实验组样本管数据，分析统计结果多记样本需分别进行FITC、PE、PC5的单色标记管，进行补偿调节时用。按实验要求设计Protocol。一个SS/FS点图，其余图形按所需荧光参数两两做图（如：（FL1）、PE（FL2、PC5（FL4）FITC/PE（FL1/FL2），FITC/PC5（FL1/FL4），PE/PC5（FL2/FL4）三个荧光图，其它多色实验以此类推Protocol。上样本管先看第一，调整FS、SS电压和FS阈值，使细胞群位于图中合适位置，作门A，圈目Protocol。选中每一个单阳补偿管，脱机调节补偿，分析统计结果HLA-B27【实验目的和原理HLA-B27与强直性脊柱炎（AS）之间的强相关引人瞩目，AS患者中96%具有HLA-B277%HLAHLAB27FITC/HLAB7PEHLA-B7与抗HLA-B27抗体之间的【实验试剂1、荧光单克隆抗①Isotypecontrol（IgG2a-FITC/IgG1-PE）,2、红细胞裂解液(OptiLyseC,PN:A11895):即用型，室温保存（18-3、0.01MPBS4、EDTA抗凝【实验步骤取出试管，每管加入500μl红细胞裂解液OptiLyseC，涡旋混匀，室温避光10分钟（约1200rpm）离心5min，弃去上每管加入2ml的PBS，涡旋混匀，300g离心5min每管加入0.5mlPBS混匀，4℃避光1h内上机检测；若不上机，加入0.5ml含1-2%多聚【注意事项 弃掉试管中上清液时，一定保证垂直倒掉，不能反复倾倒，防止细胞丢失2~8℃保存，抗体试剂在保质期内稳定，不能冻存。抗体保存期间或与细胞孵育时注意避 任何试剂的外观改变，如沉淀、变色，都表明试剂已不稳定，这时试剂不能使用。④为得到理想结果，血样应在静脉穿刺后6h 操作时如未按指定的孵育时间、离心次数或温度进行，容易发生错误。 抗体试剂虽含有叠氮钠保护剂，仍需注意微生物污染，以免导致错【流式细胞仪上机检测（共两个选择“File”→“NewNew选择参数：单击中的“CytometerControl”，选择“Acq.Setup”选项卡，点击①SS/FS双参数点图：单击 中的（ColorDotPlot）键，X轴参数选择“SS：SSLin”,Y轴参数选择“FS：FSLin”，Gate参数选择“Ungated”，如下图。单击OK。单击②FL1/FL2双参数点图：单 中的（ColorDotPlot）键，X轴参数选择FL1LOG”,Y轴参数选择“FL2:FL2LOG”，Gate参数选择“A”，如下图左，单击OK。在 ③将鼠标移至该图左下角，出现“∑”时，单击鼠标左键，显示统计。单击“∑”图X-Mean、Y-Mean，并在“ReportOptions”下面的“CurrentFilename”和“Mean Mathod”选项前打“√”，如图设定对应坐标轴：单击菜单栏“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在弹出的对话框中选择“Parameters”栏中的“FL1Log”,在对应的“Name”栏中输入“IgG2a-FITC”；选择“FL2Log”，在对应的“Name”栏中输入“IgG1-PE”，单击“OK”；单 图标，保存实验方案单击菜单栏“File”→“EditFCSHeaderAttributes…”，在弹出的框中选择单击菜单栏“File”→“SaveProtocolAs…”，在弹出的框中输入“HLA-B27-B7”，单击“Save二、建立实验组合1、单击菜单栏“File”→“New”→“NewPanel…”，在弹出的框中“PanelName”栏中输入组合名称“HLA-B27”，在“NoofTest”栏中输入“2”，单击“Next”；2、在新的窗口中选中“Useplotsandgatesfromprotocol”，并在其下方选项栏中选中“HLA-B27Isotypecontrol.PRO”，选中“Useregionsfromprotocol”，单击3、在新的窗口中选中“Useplotsandgatesfromprotocol”,并在其下方选项栏中选中“HLA-B27.PRO”，选中“Carryregionsfromprevioustest”,选中“Useinstrumentsettingsfromprevioustest”（如下图）,单击“Finish”。三、设置数据获取条1、单击菜单栏“View”→“CustomizeWorklistColumns”,在弹出的框中钩选“Panel、Protocol、RegionSource、InstrumentFilename、SampleID1、SampleID2、单击菜单栏“File”→“WorkspacePreferences”，在弹出的框中钩选“SampleID1、SampleID2、Y2KDate、TagNumber”，并选中“Starteachpanelat001”，其 B27.pnl”拖至“AcquisitionManager”区域中，在“SampleID1”栏中输入患者姓名，“SampleID2”栏中依次输入“Isotypecontrol、HLA-B27-HLA-B7”；4、单击图标，在“SetupMode”前打“√”，“BaselineOffset”前面的方框不打5、设定阈值：在“Acq.Setup”选项卡中设定阈值，扣除碎片。通常以FS为阈值6、获取停止条件设定：在“Acq.Setup”选项卡①设定获取时间：“Acquisitionlimits”中的Duration（获取时间）默认为300（S；)③门内细胞数：即设定某一群细胞满足一定数量时停止，如：设定获取2000个淋巴细Save”选项卡，在“UseStopCondiion”，并在“umEvents”注意：以上三个条件可根据实验要求进行更改，最先满足任一条件即停止数据获取。阈 A门内细获取停7、调双色淋巴细胞亚群实验条件：选择菜单栏“Cytometer”→“Get From…”，调色淋巴细胞亚群实验条件，必要调整FS、SS电压，并调整门圈定淋巴细胞，使SS/FS点图中细胞分布良好（如下图）；单击 注意：不要调整FL1、FL2电压，电压的变化会直接影响补偿条件8CytometerControl”窗口中去掉“SetupMode”选项前的“”，“BaselineOffset”前面的方框打“√A2000个细胞自动停止；按顺序上样，收集全部2管数据。四、实验数据分析及报告格式设置打开CXP分析软件，选择“File”→“NewNewProtocol”；选中出现的第一张点图，单击右键，在弹出的框内选择图标，在弹出的框中选中要分析的数据文件（wangqiangIsotypecontrol2010-04-25001.LMD），其余选项如下图左所示，点击“OK”；在图形上圈淋巴细胞为A门；单击图标，在弹出的框中选择图标，在弹出的框中选中要分析的数据文件（wangqiangIsotypecontrol2010-04-25001.LMD），“Gate”参数选择“A”，“XParameter”选择“IgG1-FITC”，“YParameter”选择“IgG1-PE”，点击“OK”；点击图标，在FL1/FL2图中沿细胞群边缘做十字象限；按上述步骤依次做第2管数据的FL1/FL2荧光点图，单击 图标，在弹出的对 结果判定：HLA-B27阳性且HLA-B7细胞的比例≥80%，平均荧光强度≥8.0断为阳性创建FLO⑴．选择或者菜单栏“Insert”→“BlankFlo⑵．点鼠标左键选中以上绘制好的参数图，拖到新建的FloGE上，FloGE会直接显示统计结果；⑷．单击“SaveProtocol”，保存方案。如需打印报告，单击“File”→ 注意注意：FloGE上的图形和工作区中的图形是同步LMDData到工作区时，打印页中的图形也会随之更将第2管数据拖到第3中，“FloGE”中的图直接显示数据结果；更改相关四色免洗淋巴细胞亚群绝对计数用已知总数的荧光微球Beads作标准内参，加入血中，再加入荧光抗体，应用流式细细胞

获取Beads总量【实验四色淋巴细胞亚群试剂：CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5(PN. )和CD45- FlowCount计数微球 Immunotrol质控血 ）或者EDTA抗凝血【实验245/4/8/3FC45/56/19/3FC，μl抗凝全血或质控血加入两试管中，注意不要将血加在管壁上分别在管中依次加入相对应的四色抗 10μl，注意不要碰到血将上述试管涡旋混匀，室温避光放置15-取出试管，每管加入OpitiLyseC，涡旋混匀，室温避光放置取出试管，每管加入500μlPBS，室温平衡5取出Flow-Count荧光微球，涡旋震荡混匀10-12以反向加样法在各管中加入100μl荧光微球（荧光微球的加样量与样本量一致充分涡旋混匀，2小时内上注意：⑴.样本使用EDTA抗凝全血，室温放置，24小时内处理，处理前【流式细胞仪上机检点击“”以清除管理器从“ResourceExplorer”中选择“”标签，从“”中将“LSATBNKFCAssay.PNL”拖至“Acquisition在“AcquisitionManager”中，点击，在弹出的框中,“ManualAbsoluteCountCalibrationValues”区，钩选“EnableF