纺织品 草甘膦及其盐残留量的测定 编制说明

《纺织品草甘膦及其盐残留量的测定》国家标准编制说明一、工作简况1、任务来源和起草单位国家标准化管理委员会2021年8月下达了制修订国家标准计划《纺织品草甘膦及其盐残留量的测定》，计划项目编号为20213121-T-608，由中国纺织工业联合会提出，全国纺织品标准化技术委员会(SAC/TC209)归口，全国纺织品标准化技术委员会基础标准分会(TC209/SC1)执行，浙江省检验检疫科学技术研究院牵头起草。草甘膦(glyphosate，PMG)又称农达、镇草宁，分子式为C3H8NO5P，是1971年美国孟山都公司研发的一种有机磷除草剂，因其兼具内吸、传导性、灭生性及非选择性，同时不易在生物体内累积，故广泛应用于农业生产中一年生和多年生杂草防除，是目前世界上应用最广、生产量最大的除草剂。近几十年来，由于其传导性好、除草效果优异，以及抗草甘膦植物的迅猛发展而得到了广泛的应用。其除草机理是阻断5-烯醇丙酮莽草酸-3-膦酸(EPSP)盐合成酶的活性。该合成酶存在于芳香族氨基酸的生物合成中，即在绿色植物中产生，因此草甘膦对绿色植物的毒性更大。其在植物、土壤、水中的主要代谢产物为氨甲基膦酸(aminomethylphosphonicacid，AMPA，分子式为CH6NO3P)。虽然它属于低毒类的有机磷除草剂，但其不合理的使用也会导致某些农产品(如棉花)受损，将导致棉花及其棉布中草甘膦的残留超标，影响消费者的使用安全，甚至致病、中毒死亡，同时也会影响相关纺织产品的国际贸易。(Isopropylammonium-salt，CAS号38641-94-0)、草甘膦钾盐(Potassiumsalt，CAS号70901-12-1)、草甘膦铵(Ammoniumsalt，CAS号40465-66-5)，草甘膦及其盐类均极易溶于水，其功能性物质均为草甘膦，它们的主要代谢产物都为氨甲基膦酸(AMPA，CAS号1066-51-9)，因此，草甘膦及其盐残留量主要是测定草甘膦和它的主要代谢产物氨甲基膦酸(它们的分子结构式如图1~5)。草甘膦及其主要代谢物氨甲基膦酸均属于强极性、易溶于水的高沸点化合物，具有不易挥发、无紫外吸收等特性，因此用常规方法分析检测十分困难。目前，PMG和AMPA残留检测的方法主要有气相色谱法、液相色谱法、离子色谱法、气质联用法、液质联用法、和光谱法等。光谱法虽然操作简便，但其灵敏度不高，而离子色谱法只能适用于水样等简单基质，用于植物源样品检测时干扰太大；用气相色谱和气质联用技术检测时，需要将PMG和AMPA衍生转化为可气化物质，其引入试剂多、过程相对繁琐，效率较低；用LC-MS/MS法直接检测时，由于PMG和AMPA分子量(分别为169.07和111.04)均较小，其主要碎片离子的质荷比多在100以下，检测实际样品时受基质干扰严重，灵敏度较低，因此柱前衍生--液质联用法成为近年来国内外检测PMG和AMPA残留的主流方法。不共11页，第1页共11页，第2页过，以9-芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)作为衍生试剂，在硼酸盐缓冲溶液中与PMG和AMPA衍生化反应过程简单(如图6和图7)，其衍生产物水相容性好，在LC-MS/MS中响应信号高，碎片离子干扰小，非常适合定性定量分析。图1.草甘膦分子结构式图3.草甘膦钾盐分子结构式图2.N-(膦酰基甲基)甘氨酸异丙胺盐分子结构式图4.N-(膦酰甲基)甘氨酸铵盐分子结构式图5.氨甲基膦酸分子结构式图6.草甘膦在硼酸缓冲溶液中与9-芴甲氧羰酰氯衍生反应图7.氨甲基膦酸在硼酸缓冲溶液中与9-芴甲氧羰酰氯衍生反应草甘膦及其盐类在2017-2018年受到媒体大量关注，是世界上使用广泛的除草剂，孟山都和拜耳公司都涉嫌生产这种致癌的除草剂，在世界各地引发了激烈的争论。对于草甘膦的风险，世界卫生组织(WHO)认为这种物质“可能致癌”，OEKO-TEX®通过采取“受监测”行动，密切关注相关共11页，第3页纺织材料中的此类物质，以进行更详细地分析。OEKO-TEX®Standard100的2020版本中新增了草甘膦及其盐的残留限量，婴幼儿服装中限量为0.5mg/kg，其他纺织品限量为1.0mg/kg。目前，我国还没有检测纺织品中草甘膦及其盐的残留量的国家标准，因此尽早制订纺织品中草甘膦及其盐的残留量的测定国家标准意义重大。3、主要工作过程2021年9月，成立起草小组，调研行业对此标准的需求，查阅国内外有关文献和标准。2021年10月-2021年12月，对国内外的分析检测标准进行对比分析，与合作单位进行技术交流，确定实验方案，对方法可行性进行论证。2022年1月-2022年8月，根据实验方案，进行有关试验方法的条件选择和系统试验工作。2022年8月-2022年9月，根据实验方案，进行协同验证试验。2022年10月-2023年2月，经各方的共同努力，对相关实验数据和验证结论进行整理并形成标准征求意见稿和编制说明征求意见稿。2023年3月，发委员征求意见。二、标准编制原则本标准严格按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》和GB/T20001.4-2015《标准编写规则第4部分：试验方法标准》中的各项规定进行编写，本标准按照先进性、科学性和实用性相结合的原则进行编制，在对纺织产品特性了解的基础上，广泛参考相关行业标准及文献资料，建立适用的分析测试方法，征求行业内专家、学者以及技术人员的意见和建议，密切联系实际，注重科学性和可操作性的充分结合，力求编写的标准符合规范化和标准化的要求，以便于本标准颁布后推广应用。三、主要内容的确定(包括主要试验分析)重点内容1方法原理采用水超声波提取样品中草甘膦及其盐残留量，与芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)衍生反应后，采用液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)测定，内标法定量。2前处理条件的选择纺织样品的取样按照GB/T10629-2009中成品取样的相关规定执行，无特殊规定。由于没有找到阳性面料样品，选用阳性棉花样品来进行以下实验。2.1提取方法的选择目前生态纺织品检测的常用的样品前处理方法有：快速溶剂萃取法、超声萃取法、振荡提取法、溶剂回流萃取法等方法，考虑到快速溶剂萃取法需要使用昂贵的仪器，不便于实际的推广，因此没有考虑此方法。考虑到方法的普遍适用性和标准的继承性，本标准前处理方法采用了超声萃取法。共11页，第4页超声萃取的结果(mg/kg超声萃取的结果(mg/kg)化合物30min60min90min草甘膦15.8815.8915.93氨甲基膦酸0.180.180.19草甘膦及其主要代谢物氨甲基膦酸均属于强极性、易溶于水、不易溶于有机溶剂的高沸点化合物，因此选用水作为提取溶剂。本标准方法制订试验期间由于没有获得实际阳性纺织面料样品，采用实验室现有的阳性皮棉样品作为供试样品。2.3超声萃取条件的选择(1)超声萃取温度的选择选取阳性皮棉样品，剪成至约5mm×5mm碎片，混匀。准确称取1g上述剪碎样品，精确至0.01g，放入50mL带螺旋盖的塑料离心管中，准确加入125μL浓度均为1.0μg/mL的草甘膦-13C2,15N和氨甲基膦酸-13C15N的同位素内标溶液和25mL水，置于超声萃取仪，分别设置常温(不设置温度)WKHz的超声波浴中，对阳性样品进行超声提取30min，每个温度进行3次平行试验，提取结果见表1。可以看出，在相同的输出功率与工作频率下，常温(不设置温度)与60℃的水浴温度超声提取，萃取效果没有明显差异，因此，采用常温超声提取。表1.不同水浴温度超声萃取的结果化合物超声萃取的结果(mg/kg)常温60℃草甘膦5.61889873045.99氨甲基膦酸(2)超声萃取时间的选择分别取1.0g剪碎的皮棉阳性样品，在输出功率为500W，频率为37KHz，常温(不设置温度)的超声波水浴中进行超声萃取时间选择试验，对样品分别进行超声提取30min、60min和90min，其萃取结果见表2。表2.超声时间对提取效果的影响从以上结果可以看出，样品在常温(不设置温度)水浴中超声提取30min，60min和90min处理，草甘膦和氨甲基膦酸的含量每次均有微量的增加，但差异并不显著，考虑到样品提取的方便性，采用30min超声萃取。2.4衍生化反应衍生条件的优化：FMOC-C1的衍生机制是在碱性环境下(pH9.0)通过FMOC-C1基团取代目标化合物氮原子上的氢，从而生成较稳定的化合物FMOC-PMG和FMOC-AMPA。参照其他标准(SN/T共11页，第5页1923-2007为1.0g/LFMOC-Cl的丙酮溶液；SN/T4671-2016为20g/L的FMOC-Cl丙酮溶液；BSISO16308-2014为0.5g/L的FMOC-Cl乙腈溶液；HJ1071-2019为1.0g/L的FMOC-Cl乙腈溶液)及文献报道所选用的缓冲液浓度，本实验采用5%的硼酸钠水溶液缓冲液体系，设置的衍生试剂质量浓度为1、2、5、10、20g/LFMOC-Cl乙腈溶液，按照标准文本7.3步骤对PMG和APMA质量浓度为100ng/mL的纯水溶液进行衍生化反应2小时，结果见图8。结果表明，在纯水溶液中，FMOC-C1浓度为2g/L时，PMG和AMPA的峰面积已达到较大，随着衍生化试剂浓度的升高，其峰面积随衍生化试剂浓度增加而略有增加，但其峰面积无明显变化，浓度到达一定程度(10g/L)时，峰面积不再变化。研究还发现，当FMOC-Cl浓度为20g/L时，得到的PMG和AMPA色谱峰产生拖尾现象，可能是由于衍生试剂化学性质较活泼，其用量大时，过量的FMOC-Cl会迅速转化成FMOC-OH，干扰目标物峰形。在5%硼酸钠水溶液、10g/LFMOC-C1乙腈溶液条件下，考察不同时间(0.5h、lh、2h、4h、8h和12h)对衍生效果的影响，结果见图9。结果发现，2h后PMG和AMPA的测定值无明显增加。因此，本实验最终选定的衍生条件为5%硼酸钠水溶液、10g/LFMOC-C1乙腈溶液，室温下衍生2h。图8.衍生试剂浓度对水溶液中PMG和APMA衍生效率的影响共11页，第6页图9.衍生反应时间对水溶液中PMG和APMA衍生效率的影响3液相色谱-串联质谱分析3.1色谱条件的选择3.1.1色谱柱的选择草甘膦及其主要代谢物氨甲基膦酸与FMOC-Cl的衍生物均属于强极性、易溶于水的高沸点化合物，采用普通的色谱柱较难得到理想的色谱峰。本标准采用极性色谱柱：AcquityUPLC®HSST3，1.8μm，2.1mm×50mm。另外，超高效液相色谱(UPLC)系统使用了具有1.8μm的色谱柱颗粒，它提供的柱效是5μm颗粒的3倍。因为分离度与粒度的平方根成反比，1.8μm颗粒的分离度比5μm颗粒提高了70％。由于色谱峰变得更窄，峰高也就更高了从而获得了更高的灵敏度。3.1.2流动相的选择对比了酸性体系(0.1%甲酸水溶液)与碱性体系(5mmol/L氨水溶液)分别于甲醇、乙腈的流动相体系组合，结果发现两种分析物在酸性体系中分离效果欠佳，峰形拖尾严重，而在碱性体系中其色谱分离效果得到明显改善，峰形对称；乙腈比甲醇体系洗脱能力更强，可以有效缩短分析时间。故本标准采用5mmol/L氨水溶液+乙腈流动相体系。综合上面试验，确立的液相色谱条件如下：共11页，第7页013455.155405流动相B(013455.155405流动相B(%)959560202095b)流速：0.3mL/min；c)柱温：40℃；d)进样体积：5µL；e)流动相A：乙腈；流动相B：5mmol/L氨水溶液；梯度洗脱程序：参见表3。表3.草甘膦及其盐残留量的液相色谱-串联质谱法的梯度洗脱程序表3.2质谱条件的优化质谱的选择：PMG、AMPA、PMG-13C2,15N和AMPA-13C15N对应的衍生物PMG-FMOC、AMPAFMOCPMGCNFMOC和AMPA-13C15N-FMOC分子量分别为39l、333、394、335。用超纯水配置1mg/L混合衍生化标准溶液直接注射到质谱中，在正负离子模式下分别进行母离子全扫描，发现正离子模式下392、334、395、336具有很好的响应，然后分别以其母离子进行子离子全扫描，各得到两组丰度高、干扰小的子离子对进行MRM监测，确定的质谱条件如下(见表4)：a)离子源：电喷雾离子源；b)检测方式：正离子多反应监测(MRM)模式；c)毛细管电压：3.0KV(正离子)；d)离子源温度：110℃；e)脱溶剂气温度：380℃；f)脱溶剂气(N2气)流速：700L/h；g)锥孔反吹气(N2气)流速：50L/h；h)碰撞气(Ar气)流速：0.2mL/min。表4.草甘膦及其盐残留量质谱参数表化合物离子模式母离子子离子锥孔电压(V)碰撞能量(eV)草甘膦正离子391.9887.9*0.0825169.910.0825氨甲基膦酸正离子333.99155.83*0.08256111.920.0825草甘膦-13C215N正离子394.9290.7*0.0825172.780.0825氨甲基膦酸-13C15N正离子336.02157.79*0.08258113.740.0825注：*离子用于定量。共11页，第8页4液相色谱-串联质谱法线性关系将含有草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸标准储备溶液用水配制成浓度分别为1.17μg/L、5.88μg/L、11.7μg/L、35.3μg/L、58.8μg/L、82.3μg/L和117.6μg/L的混合标准工作溶液，其中内标草甘膦-13C2,15N和氨甲基膦酸-13C15N的浓度均为58.8μg/L。分别准确移取850μL各浓度的标准工作溶液，加入100µL硼酸盐缓冲溶液(5.10)和50µLFMOC-Cl溶液衍生反应2小时，将反应后的溶液过0.22µm水相针式过滤头过滤，衍生化混合标准溶液对应的浓度分别为：1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、30.0ng/mL、50.0ng/mL、70.0ng/mL、100.0ng/mL，内标物质草甘膦-13C2,15N和氨甲基膦酸-13C15N的浓度均为50.0ng/mL。在所选定的色谱与质谱条件下进样，每个浓度至少重复进样3次，得到峰面积的平均值，对进样浓度与检测器峰面积绘制标准工作曲线，峰面积与质量浓度成正比，其线性方程与相关系数r及参考保留时间见表5，草甘膦及其盐类化合物的液相色谱-串联质谱总离子流图及多反应离子监测(MRM)质谱图见图10和图11。表5.草甘膦及其盐类的LC-MS/MS校正曲线线性方程及相关系数表化合物保留时间(min)线性方程相关系数(r)草甘膦2.41Y=10.5618x+3.647380.998358氨甲基膦酸2.82Yx7760.998025图10.草甘膦及其盐类标准物质的LC-MS/MS总离子流色谱图共11页，第9页图11.草甘膦及其盐类的LC-MS/MS多反应离子监测质谱图5检测低限以3倍信噪比(S/N=3)确定最低检出浓度(LOD)，LC-MS/MS方法中草甘膦(MPG)的LOD为1.92μg/kg，氨甲基膦酸(AMPA)的LOD为1.55μg/kg；以10倍信噪比(S/N=10)确定最低定量浓度(LOQ)，草甘膦(MPG)的LOQ均为6.4μg/kg，氨甲基膦酸(AMPA)的LOQ为5.18μg/kg。考虑到纺织品实际样品中草甘膦及其盐类检测操作方便性，统一将LC-MS/MS方法对纺织品中草甘膦及其盐类的测定量限均定为0.05mg/kg。共11页，第10页7方法的回收率实验及精密度实验采用样品加标的方式进行回收率实验，试验了空白棉布和亚麻布中添加草甘膦和氨甲基膦酸的回收率试验，采用LC-MS/MS法测定其结果，见表10~15。表6.草甘膦和氨甲基膦酸在棉布中添加回收率试验结果(n=6)化合物添加0.05mg/kg添加0.5mg/kg添加1.0mg/kg RSD(%) 回收率(x±s)%RSD(%) 回收率(x±s)%RSD(%)草甘膦8772±3934488675±4795529134±740811氨甲基膦酸3.928.370.28表7.草甘膦和氨甲基膦酸在在亚麻布中添加回收率试验结果