DB12T 1006-2020茄子黄萎病菌土壤带菌 PCR 检测技术规程

ICS65.020.01B16天津市地DB12方标准DBT1006—2020TechnicalregulationofPCRdetectionforverticilliumdahliaeinsoil天津市市场监督管理委员会发布前言GBT1.1-2009给出的规则起草。津市农业农村委员会提出并归口。草单位：天津市植物保护研究所。4.2主要试剂茄子黄萎病菌土壤带菌PCR检测技术规程用于土壤中茄子黄萎病菌的检测。范性引用文件凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修订版)均适用于本文件。GBT682分析实验室用水规格和试验方法GBT6197-2018土壤质量土壤采样技术指南GBT6199-2018土壤质量土壤采样程序设计指南定义菌verticilliumwiltofeggplant茄子黄萎病菌大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaKleb.)可以侵染多种植物引起一种土传的维管Averticilliumwiltofeggplantsoil-borne能够诱发侵染植株发病的病原菌。4仪器和试剂4.1主要仪器涡旋振荡仪、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、聚合酶链式反应仪(PCR仪)、水浴锅、电子天平(感g和0.1mg)、电泳仪、凝胶成像仪。DNA子量标准(DNAMarker，能够区分100bp~1000bp的DNA片段)。(pH8.0)，1.4mol/L氯化钠。待测土壤取样TGBTm与鉴定土壤样品预处理将采集的土壤样品送回实验室后，打开采样袋在室内自然风干(自然风干时间不能超过24h)，然ngmin上清液。取上清液，加入等体积的三氯甲烷:异戊醇(24:1)，4℃14000g离心10min。继续三氯甲烷:异戊醇(24:1)抽提，直至有机相和水相之间无蛋白层为止。弃去上清液，70％冷乙醇，漂洗DNA沉淀2次~3次，充分风干后溶解于适量去离子水中。1μL，加入到PCR反应体系中进行扩增反应。同时，设置阴性对照和阳性对照(阴性对照为不含茄子黄1g土壤提取的DNA，阳性对照为含茄子黄萎病菌1g土壤提取的DNA)，空白对照为未加入DNA模PCR见附录B。立，反之不成立。子黄萎病菌，否则则说明不存在黄萎病菌。土样及资料保存检测判定完成后，土壤样品保存方法按照GB/T36197-2018有关要求执行。检测判定过程及有关数格要进行详细记录并归档保存。A(资料性附录)黄萎病菌的分类地位、病原特征及发病症状A.1病原及其分类地位从梗菌科(Moniliaceae)，轮枝菌属(Verticillium)。已报道的茄子黄萎病的病原菌为黑白轮枝菌 (V.albo-atrum)和大丽轮枝菌(V.dahliae)。而我国国内对于茄子黄萎病的病原鉴定结果均为大丽轮枝菌(V.dahliae)。A.2病原特征等多200多种农作物，其形成的微菌核在无寄主的土壤中可存活10年以上，是主要的初侵染源。A.3症状及危害田间症状如图A.1所示。(规范性附录)B子黄萎病病原特异性引物Vd-ITS1-45-F：5’-CCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’Vd-ITS2-379-R：5’-ACTCCGATGCGAGCTGTAAC-3’ITSFCCGGTCCATCAGTCTCTCTGVd-ITS2-379-R：5’-ACTCCGATGCGAGCTGTAAC-3’列信息：taaaacttttaacaacggatctcttggctctagcatcgatgaagaacgcagcgaaacgcgattgcagaattcaggaatcatcgaatctttgaacgcacatggcgcctgaggcatgcctgtccgagcgtcgtttcaaccctcgagccccagtggc241ccggtgttggggatctacgtctgtaggcccttaaaagcagtggcggacccgcgtggccct301tcctatgcgtagtagttacagctcgcatcggagtPCR体积(μL)EeraldAmpMaxPCRMasterMix(2×MasterMix)(CodeRR320)111asefreedHOalB