质粒琼脂糖凝胶电泳 质粒dna的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

本文格式为Word版，下载可任意编辑——质粒琼脂糖凝胶电泳质粒dna的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告一、测验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳二、测验原理：

1.质粒DNA的提取：

质粒是一类存在于几乎全体细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分开纯化出质粒DNA。分开制备质粒DNA的方法好多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和布局等特点以及质粒DNA的用途举行选择。本测验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分开提取质粒DNA.其原理如下。

（1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分开质粒DNA，达成分开提纯质粒DNA的目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋布局解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大片面氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分开。当参与pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其自然构象，以可溶状态存在于液相中；

而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、布局繁杂而相互缠绕形成不溶性网状布局。与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的概括作用和原理如下。

（2）四种溶液作用及原理：

①SolutionI的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中参与EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制DNA酶对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。

②SolutionII的作用：供给碱性条件，pH高达12.6，使大肠杆菌瞬间裂解，促使染色体DNA和质粒DNA变性。所含离子型外观活性剂十二烷基酸钠（SDS）可使细胞膜、核膜发生破碎，充分溶解膜蛋白。同时，磺酸基与蛋白质形成复合物而变形沉淀。

③SolutionIII的作用：为KAc-HAc缓冲液。该溶液所含有的高浓度钾离子与溶液体系中的十二烷基磺酸钠发生回响形成十二烷基磺酸钾，从而将与之结合的绝大片面大肠杆菌蛋白质以及很长的基因组DNA一起沉淀，与质粒分开开来；

另外溶液III所含有的醋酸中和溶液Ⅱ的强碱性，使pH降至中性，由于长时间的碱性条件会打断DNA；

基因组DNA一旦发生断裂，只要是50-100kb大小的片段，就没有手段再被PDS共沉淀，这样就跟质粒DNA共存了。而且在整个质粒DNA的提取过程中，沉淀DNA时用无水乙醇及在高盐、低温条件下举行都是为了用化学或物理手段将基因组DNA分子和蛋白质发生变性、在体系中的溶解度降低，较充分的分开提纯出测验所需的质粒DNA④无水乙醇的作用：是测验中最常用的沉淀DNA的方法。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当参与乙醇时,乙醇会夺DNA周边的水分子,使DNA失水而易于聚合.一般测验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的最终含量占67%左右。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学回响,对DNA很安好,因此是梦想的沉淀剂。

也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。

2.质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳：

利用DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时的电荷效应和分子筛效应而达成分开、鉴定DNA的目的。DNA分子在高于等电点的pH溶液环境中带负电荷，在电场中向正极移动。在确定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的构型和大小。不同的分子由于所带电荷、分子质量或者构型的不同，在同一电泳系统中的泳动速度不同，因而可以彼此分开，并检测起分子量大小。未切割的质粒DNA在其泳道上可能会展现几个条带，之所以这样是由于质粒DNA在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及