核糖体与核酶

关于核糖体与核酶第一页，共三十一页，编辑于2023年，星期一第一节核糖体的类型与结构核糖体是细胞内蛋白质合成的细胞器，唯一功能是按mRNA指令由氨基酸合成多肽链。核糖体几乎存在于所有细胞,从原核细胞到真核细胞均含有大量核糖体,线粒体和叶绿体中也含核糖体,仅红细胞等少数特化细胞中没有核糖体是一种颗粒状结构,没有被膜,主要是核糖体RNA(rRNA),占60%,核糖体蛋白(r蛋白),占40%还有其它功能的核糖核蛋白颗粒,常是小分子RNA(snRNA)与蛋白组成的颗粒,参与RNA的加工、RNA编辑、基因表达调控等.第二页，共三十一页，编辑于2023年，星期一一、核糖体的基本类型与成分1、基本类型(1)70S的核糖体:由50S和30S两个亚基组成；原核细胞的核糖体,叶绿体和线粒体核糖体也接近70S(2)80S的核糖体:由60S和40S两个亚基组成大小两个亚基常游离于细胞质基质中,只有在合成蛋白质时才结合在一起，胎链合成完毕后，大小亚基解体，又游离于细胞质中第三页，共三十一页，编辑于2023年，星期一2、核糖体的化学组成核糖体大小亚基都是由rRNA和核糖体蛋白组成(1)原核细胞的70S核糖体中:50S大亚基含33种蛋白质和两种rRNA：23SrRNA和5SrRNA。30S小亚基含有21种蛋白质和一个16SrRNA(2)真核细胞的80S核糖体中60S大亚基含49种蛋白质及3种rRNA：28SrRNA、5.8SrRNA和5SrRNA。40S小亚基含33种蛋白和一种18SrRNA第四页，共三十一页，编辑于2023年，星期一原核生物与真核生物核糖体成分的比较第五页，共三十一页，编辑于2023年，星期一第六页，共三十一页，编辑于2023年，星期一第七页，共三十一页，编辑于2023年，星期一二、核糖体的结构（一）核糖体结构与功能的分析方法离子交换树脂可分离纯化各种r蛋白；纯化的r蛋白与纯化的rRNA进行核糖体的重组装，显示核糖体中r蛋白与rRNA的结构关系双向电泳技术可显示出E.coli核糖体在装配各阶段中，与rRNA结合的蛋白质的类型双功能的交联剂和双向电泳分离可用于研究r蛋白在结构上的相互关系

电镜负染色与免疫标记技术结合，研究r蛋白在核糖体的亚单位上的定位。70S核糖体小亚基16SrRNA结构及与全部r蛋白关系第八页，共三十一页，编辑于2023年，星期一(二)原核细胞的核糖体结构1、核糖体蛋白E.coli核糖体小亚基含21种蛋白质,分别命名为S1-S21;大亚基含33种蛋白质,分别命名为L1-L332、核糖体rRNAE.coli小亚基含16SrRNA，共有1542个核苷酸，不同来源的16SrRNA的序列组成具保守性。含四个结构域，每个结构域都有46%碱基配对，形成螺旋的柄状结构。每个柄状结构都很短，不到8bp，且并不都是完全配对。第九页，共三十一页，编辑于2023年，星期一核糖体小亚单位rRNA的二级结构(a)E.coli16SrRNA；（红色为高度保守区）(b)酵母菌18SrRNA，它们都具有类似的40个臂环结构，其长度和位置往往非常保守；P、E分别代表仅在原核或真核细胞中存在的rRNA的二级结构。第十页，共三十一页，编辑于2023年，星期一3、细菌核糖体模型在该模型中确定了一些重要的功能区。如在小亚基中确定了mRNA和tRNA结合位点，并确定了催化肽键形成的位点位于大亚基。确定了小亚基中部突出的平台部分含有16SrRNA的3‘端，此部位有与mRNA结合的序列。与蛋白质合成起始相关的tRNA、蛋白质因子结合位点位于相邻小叶中。大亚基还具有催化肽键形成和GTP水解的功能区。第十一页，共三十一页，编辑于2023年，星期一E.coli（a）核糖体小亚单位中的部分r蛋白与rRNA的结合位点）（b）及其在小亚单位上的部位第十二页，共三十一页，编辑于2023年，星期一（三）核糖体的装配1、rRNA的转录与加工(1)真核生物:18S、5.8S和28S基因是串联在一起,每个基因被间隔区隔开。该基因在RNA聚合酶Ⅰ作用下，首先转录成一个45S的前rRNA，然后被加工成41S前rRNA，再被切割成20S前rRNA和32S前rRNA，20SrRNA加工为成熟的18SrRNA，32SrRNA加工为28S和5.8SrRNA5SrRNA基因位于不同染色体上,由RNA聚合酶Ⅲ转录,仅进行简单加工或不加工第十三页，共三十一页，编辑于2023年，星期一(2)原核生物:细菌中5SrRNA基因与16S和23S组成一个转录单位:16S-23S-5S在RNA聚合酶的作用下,转录单位转录成一个rRNA前体,经核酸酶Ⅲ的切割,生成16S、23S和5.8S的前体,经其它酶进一步加工生成成熟的三种rRNA。第十四页，共三十一页，编辑于2023年，星期一2、核糖体的装配核糖体是自我装配的细胞器，当r蛋白和rRNA合成加工完成后即开始装配大小亚基。在原核生物小亚基装配时，一些蛋白能独立地与16SrRNA结合，装配成的中间体为其它蛋白的结合提供位点。在真核生物，45SrRNA、5SrRNA与蛋白结合形成80S颗粒，随后降解成两种颗粒，大颗粒含32S和5SrRNA，小颗粒含20SrRNA。小颗粒中20SrRNA降解成18SrRNA，大颗粒中的32SrRNA被加工成28S和5.8SrRNA,并与5S装配成大亚基第十五页，共三十一页，编辑于2023年，星期一E.coli核糖体小亚单位中rRNA与r蛋白的相互关系示意图线条表示相互作用及作用力的强（粗线）与弱（细线）

第十六页，共三十一页，编辑于2023年，星期一三、核糖体的功能-蛋白质的合成在核糖体上合成的蛋白质的一级结构，即多肽链。合成是从多肽链的N端开始，到C端结束。对于mRNA，合成的方向是5’-3’，蛋白质的合成涉及核糖体的一些功能位点和RNA作用第十七页，共三十一页，编辑于2023年，星期一（一）核糖体的功能位点原核生物有4种与RNA结合的位点，一个是与mRNA，另3个是与tRNA结合位点A位点：氨酰基位点，是新掺入氨酰tRNA结合的位点，主要位于大亚基；B位点：肽酰tRNA位点，位于大亚基P位点：脱氨酰tRNA结合位点；mRNA结合位点：位于小亚基，原核生物位于16SrRNA的3’端，mRNA中与16SrRNA结合的序列称SD序列，位于起始密码AUG上游5-10个碱基。真核生物主要依赖5’端甲基化帽结构第十八页，共三十一页，编辑于2023年，星期一第十九页，共三十一页，编辑于2023年，星期一（二）蛋白质合成的基本过程1、链的起始：（1）30S亚基与mRNA的结合：在原核生物，mRNA依靠SD序列只和游离的30S小亚基结合；真核生物，小亚基识别mRNA5’端甲基化帽结构，然后沿mRNA滑动，直到遇到识别序列，典型的识别序列为5’-CCACCAUGC-3’，含AUG小亚基与mRNA结合还需要起始因子(initiationfactor,IF)的帮助.原核生物命名为IF,有IF1,IF2和IF3,IF3帮助mRNA与核糖体结合;真核生物为eIF,至少有10个,eIF4帮助mRNA与核糖体结合.第二十页，共三十一页，编辑于2023年，星期一(2)第一个氨酰tRNA进入核糖体:携带甲酰甲硫氨酸的tRNA同GTP、IF2结合,形成GTP-IF2-tRNAfMet复合物,然后通过反密码子与mRNA中AUG识别进入核糖体.(3)完整起始复合物装配:tRNA与AUG结合后,大亚基加入,形成完整的核糖体-mRNA起始复合物,该过程伴有GTP水解,IF1、IF2和IF3释放，fMet占据P位点2、多肽链的延伸：复合物形成后蛋白质合成开始。延伸涉及4个重复的步骤，这4个步骤的循环，使肽链不断延长第二十一页，共三十一页，编辑于2023年，星期一①氨酰tRNA进入A位点：第二个氨酰tRNA与GTP及延伸因子EF-Tu结合，密码子相配的tRNA进入A位点，GTP水解，EF-Tu-GDP释放②肽键形成(延伸第二步)：当P位和A位点都被tRNA占据后，在肽酰转移酶催化2个aa形成肽键，P位点tRNA卸去氨基酸，A位点tRNA形成二肽③转位(延伸第二步)：第一个肽键形成后,核糖体沿着mRNA从5’→3’移动3个核苷酸,此时,A位点tRNA-二肽移到P位点,P位点tRNA进入E位点.移位需结合有GTP的移位酶EF-G参与④脱氨酰tRNA释放:脱氨酰tRNA离开核糖体E位延伸反应,每次循环消耗2个GTP,耗时0.05s.第二十二页，共三十一页，编辑于2023年，星期一3、蛋白质合成的终止：核糖体沿mRNA移动，当进入A位点的是终止密码子UAA、UAG、UGA，由于没有与之配对的反密码子，蛋白质合成终止。该过程需要释放因子（releasefactor，RF），细菌有3种RF，RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA和UGA，RF3能增加其它因子活性。RF与A位点的结合，活化了肽链转移酶，水解P位的多肽与tRNA之间的连接，多肽链离开核糖体第二十三页，共三十一页，编辑于2023年，星期一蛋白质的合成第二十四页，共三十一页，编辑于2023年，星期一（三）多聚核糖体（polyribosome）在蛋白质合成时，同一条mRNA能同多个核糖体结合，同时合成多条肽链，结合在同一条mRNA上的核糖体称多聚核糖体。在蛋白质合成过程中，核糖体不断向mRNA的3’端移动。当第一个核糖体离开起始密码子后，空出的位置能与另一核糖体结合，并合成蛋白质多聚核糖体中，每个核糖体相隔约80个核苷酸这种蛋白质合成方式，大大提高了合成效率，也减轻了细胞核进行基因转录和加工的压力第二十五页，共三十一页，编辑于2023年，星期一多聚核糖体第二十六页，共三十一页，编辑于2023年，星期一（四）蛋白质合成抑制剂是研究蛋白质合成机制有用的工具1、抗生素(antibiotic)：是主要的蛋白质合成抑制剂，不同抗生素作用机制不同，如链霉素主要是抑制tRNA与核糖体的结合，导致肽链合成提前中止。链霉素还可引起密码子错读。2、嘌呤毒素(puromycin)：它具有与tRNA分子末端类似的结构，能同氨基酸结合，代替氨酰化的tRNA同A位点结合，并掺入到生长的肽链中。但不能参与随后的反应，导致蛋白质合成的终止并释放出C端含有嘌呤毒素的不成熟的多肽。通过嘌呤毒素抑制作用发现P和A位点是独立第二十七页，共三十一页，编辑于2023年，星期一四、核酶Cech1981在研究四膜虫核糖体大亚基26S前rRNA加工去除内含子时发现:在没有任何蛋白质参与下,26S前rRNA进行自我加工切除了前体分子中的内含子，产生成熟的rRNA。这种现象称自剪接(selfsplicing)。这是人类第一次发现RNA具催化活性,将这种具催化活性的RNA序列称为核酶Riboz