方血红蛋白的提取和分离

关于方血红蛋白的提取和分离第一页，共五十四页，编辑于2023年，星期一第二页，共五十四页，编辑于2023年，星期一根据课题背景回答下列问题：第三页，共五十四页，编辑于2023年，星期一2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了________和——————时代。人类基因组：———————————————————蛋白质组：__________________________主要是对____________________________后基因组蛋白质组指DNA分子所携带的全部遗传信息。生物个体表达的蛋白质分子的总和蛋白质功能的研究血红蛋白质的主要功能是：______________________________。负责血液中O2和CO2的运输第四页，共五十四页，编辑于2023年，星期一思考1分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的——————的方法，分离具有不同—————————的生物大分子。思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种______________，如___________、和————、——————————————、3、溶解度、4、吸附的性质和—————————————等等，可以用来分离不同蛋白质。特性的差异1、分子的形状大小物理或化学物理或化学性质2、所带电荷的性质和多少5、对其他分子的亲和力第五页，共五十四页，编辑于2023年，星期一思考3高温灭菌和酒精消毒分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性思考4人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有________，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无_______，结构简单，__________含量丰富便于提取血红蛋白。变性空间结构细胞核细胞核血红蛋白第六页，共五十四页，编辑于2023年，星期一一、基础知识：㈠凝胶色谱法（也叫分配色谱法）：

2、凝胶：一些微小多孔的球体分子筛（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）

根据被——————————————————————，利用具有网状结构的_____（分子筛）的作用，来进行分离。

1、概念：分离物质的蛋白质相对分子质量的大小凝胶第七页，共五十四页，编辑于2023年，星期一3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对__________________的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程_____，移动速度_____，而_________________的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在_________移动，路程______，移动速度_____，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4、具体过程相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快第八页，共五十四页，编辑于2023年，星期一洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子

第九页，共五十四页，编辑于2023年，星期一第十页，共五十四页，编辑于2023年，星期一也称：洗脱瓶第十一页，共五十四页，编辑于2023年，星期一1、概念：由————————溶解于水中，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。㈡缓冲溶液：2、缓冲作用：在一定范围内，能够抵制———————————对溶液—————的影响，维持PH基本不变。外界的酸、碱或稍加稀释PH值1~2种缓冲剂调节缓冲剂的———————就可以制得—————————————使用的缓冲液。使用比例在不同PH范围内第十二页，共五十四页，编辑于2023年，星期一3、缓冲溶液的正确配制和PH的准确测定的重要性生物体进行的各种生物化学反应都是在一定的PH下进行的，为了能够在实验条件下—————————————的过程，就必须保持———————————————————————的基本一致。

思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3准确模拟生物体内体外溶液的PH与体内环境中第十三页，共五十四页，编辑于2023年，星期一㈢电泳：1、概念：____________________________________________思考：在血红蛋白提取和分离的整个实验中使用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是_________，目的是利用缓冲液模拟_____________，保证血红蛋白的____________。）磷酸缓冲液细胞内的PH环境正常结构和功能只有血红蛋白_________才能保证的材料的科学研究；材料为____色便于_____。指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。仍具有活性观察红第十四页，共五十四页，编辑于2023年，星期一2、原理：许多重要的生物大分子，如____________等都具有_____________

在

_________下，这些基团会带上_________。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其____________________移动。电泳利用了待分离样品中各种分子_______________以及分子本身的______、_______的不同使带电分子产生不同的__________，从而实现样品中各种分子的分离。多肽、核酸可解离的基团正电或负电所带电荷相反的电极带电性质的差异大小形状的迁移速度一定的PH第十五页，共五十四页，编辑于2023年，星期一第十六页，共五十四页，编辑于2023年，星期一电泳方法分类：①琼脂糖凝胶电泳①琼脂糖凝胶电泳：是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。②聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)第十七页，共五十四页，编辑于2023年，星期一②聚丙稀酰胺凝胶电泳：测定____________________通常用：（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂（N,N´-亚甲基双丙烯酰胺）在引发剂(过硫酸铵）和催化剂（四甲基己二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶第十八页，共五十四页，编辑于2023年，星期一电泳方法分类：SDS是一种蛋白质变性剂——十二烷基硫酸钠SDS的作用是什么呢？第十九页，共五十四页，编辑于2023年，星期一为了消除_______对迁移率的影响可以在凝胶中加入_____，它能使________________。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是__________________。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量____________蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的________，使电泳迁移率完全取决于_____________。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它_______________以及____________等因素。SDS单条肽链的分子量分子的大小所带静电荷的多少分子的大小静电荷蛋白质发生完全变性大大超过了电荷差别第二十页，共五十四页，编辑于2023年，星期一二实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（）两个a－肽链两个β一肽链样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定共四条肽链90％第二十一页，共五十四页，编辑于2023年，星期一第二十二页，共五十四页，编辑于2023年，星期一血红素基团第二十三页，共五十四页，编辑于2023年，星期一每个肽链环绕____________________，此基团可携带________________________。血红蛋白因含有________而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳血红素(1)红细胞的洗涤血液100mL3g柠檬酸钠红细胞血浆

红细胞

搅拌10min重复洗涤3次，直至————————————表明：——————————————红细胞已洗涤干净上清液没有黄色低速短时间离心2min吸出血浆5倍体积生理盐水第二十四页，共五十四页，编辑于2023年，星期一①洗涤目的：去除____________②洗涤方法：___________离心（洗涤速度过高和时间过长会使_________________等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的__________，将下层_________的红细胞液体倒入_____再加入用_________的_________质量分数为______________溶液洗涤。杂质蛋白低速短时间黄色血浆暗红色烧杯白细胞和淋巴细胞五倍体积生理盐水0.9％的氯化钠洗涤次数过少：——————————————无法除去血浆蛋白第二十五页，共五十四页，编辑于2023年，星期一(2)血红蛋白的释放

加_______到_______体积，再加40％体积的______，置于____________上充分搅拌10分钟,细胞破裂释放出血红蛋白.原血液甲苯磁力搅拌器蒸馏水目的分析：蒸馏水的作用是____________________________。加入甲苯的作用是__________________________。充分搅拌10分钟的目的是____________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂为什么加入甲苯而不是其他的无机溶剂？第二十六页，共五十四页，编辑于2023年，星期一

(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min，试管中的溶液分为4层:脂溶性沉淀层分离过程红细胞混合液离心管烧杯有机溶剂甲苯高速离心10min滤纸过滤血红蛋白第二十七页，共五十四页，编辑于2023年，星期一第1层（最上层）：（）甲苯层第2层（中上层）：（）的沉淀层，（）色薄层固体第3层（中下层）：

（）的水溶液层（）的液体

第4层（最下层）：其它杂质（）的沉淀层无色透明脂溶性物质白血红蛋白红色透明暗红色第二十八页，共五十四页，编辑于2023年，星期一用湿滤纸过滤，除去____________，于————————中静置片刻后，分出下层的红色透明液体,即为—————————。脂溶性沉淀层血红蛋白分液漏斗第二十九页，共五十四页，编辑于2023年，星期一取——ml的血红蛋白溶液装入—————中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的—————————中，pH为———，透析12小时，目的是————————————————————或用于更换样品中的——————。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。除去样品中小分子量的杂质透析袋磷酸缓冲液7.0缓冲液(4)透析1血红蛋白的粗分离第三十页，共五十四页，编辑于2023年，星期一第三十一页，共五十四页，编辑于2023年，星期一2.凝胶色谱制作————————1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米（不超过1m），内径1.6厘米（不超过2cm）的玻璃管，两端需用砂纸磨平②底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；b、在橡皮塞顶部切出锅底状的（），在0.5ml的（）头部切下（）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。凹穴移液管5cm纯化方法第三十二页，共五十四页，编辑于2023年，星期一底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则————————————，还会导致———————，蛋白质分离不彻底。c.剪—————小圆片覆盖在——————————上，用—————的尼龙纱将橡皮塞————包好，插到玻璃管一端。d、色谱柱下端用移液头部做———————，连接一细的——————，并用螺旋夹控制尼龙管的—————————，另一端放入收集——————————的收集器内橡皮塞的凹面100目上部出口部位尼龙管打开与关闭色谱流出液难以铺实尼龙网液体残留尼龙网第三十三页，共五十四页，编辑于2023年，星期一⑤安装其他附属结构。③顶塞的制作：插入—————————安装了玻璃管的橡皮塞④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装了玻璃管第三十四页，共五十四页，编辑于2023年，星期一2）凝胶色谱柱填料的处理（1）凝胶的选择：（）（G-75）：“G”表示凝胶的———————、——————及———————。

75表示凝胶的——————，即每克凝胶膨胀时吸水————。（2）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于——————（也可用洗脱缓冲液）中充分溶胀后，配成————————。蒸馏水凝胶悬浮液交联葡聚糖凝胶交联程度膨胀程度分离范围得水值7.5克第三十五页，共五十四页，编辑于2023年，星期一①固定：将色谱柱处置固定在支架上②装填：将（）一次性的缓慢倒入（）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。（3）凝胶色谱柱的装填方法凝胶悬浮液色谱柱注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。第三十六页，共五十四页，编辑于2023年，星期一立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱材料：交联葡聚糖凝胶G-7520mmol/L磷酸缓冲液“G”表示什么？75代表什么？2、凝胶色谱柱的装填第三十七页，共五十四页，编辑于2023年，星期一③洗涤平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在()高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分（）12小时。

洗涤平衡注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。50cm第三十八页，共五十四页，编辑于2023年，星期一

3）样品加入与洗脱①加样前

打开下端出口，使柱内凝胶面上的（）缓慢下降到与（）平齐，关闭出口缓冲液凝胶面50cm第三十九页，共五十四页，编辑于2023年，星期一②加透析样品第四十页，共五十四页，编辑于2023年，星期一①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：用（）将1ml（）的样品加到色谱柱的（）③样品渗入凝胶床：（）④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱⑤收集：待（）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（）收集一试管连续收集注意正确的加样操作：

①不要触及破坏凝胶面②贴壁加样

③使吸管管口沿管壁环绕移动吸管透析液顶端样品完全进凝胶层5ml红色的蛋白质第四十一页，共五十四页，编辑于2023年，星期一血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（）。思考样品的粗分离纯化纯度鉴定你能描述血红蛋白的提取和分离的完整过程吗？P70第4题第四十二页，共五十四页，编辑于2023年，星期一血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。思考第四十三页，共五十四页，编辑于2023年，星期一3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳判断（）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的纯度鉴定。纯化血红核蛋白纯度鉴定第四十四页，共五十四页，编辑于2023年，星期一

观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价

1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？

由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。

第四十五页，共五十四页，编辑于2023年，星期一

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？第四十六页，共五十四页，编辑于2023年，星期一回忆蛋白质的有关知识第四十七页，共五十四页，编辑于2023年，星期一(一）蛋白质占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物2、组成元素C、H、O、N一、基础知识1、含量3、相对分子质量高分子化合物第四十八页，共五十四页，编辑于2023年，星期一4、基本组成单位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH26、氨基酸连接方式脱水缩合第四十九页，共五十四页，编辑于2023年，星期一8、分子结构7、肽键CONH氨基酸肽链蛋白质脱水缩合盘曲折叠（一条或者多条）第五十页，共五十四页，编辑