电泳技术 医学生物化学课件

2第一节电泳技术的发展及基本原理电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，在电场的作用下，向电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱的方法。

31电泳的发展简史1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后正极玻璃管中水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动。1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了过氧化氢酶的电泳移动和等电点。1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行研究。从20世纪50年代起，Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂糖凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。4目前，聚丙烯酰胺凝胶电泳是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）。由20世纪80年代发展起来的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。5按电泳的原理（或是否有支持介质）来分，可分为二类：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术，是在Ｕ形管中进行电泳，无支持介质，因而分离效果差。区带电泳：是指有支持介质的电泳。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。目前电泳一般特指区带电泳。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。2电泳的分类6①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。③琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。④聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。聚丙烯酰胺电泳和琼脂糖电泳是目前最常用的。按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：73.1水平式电泳凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，将凝胶直接浸入缓冲液中。常用于琼脂糖电泳分离核酸。3.2垂直板式电泳电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，在玻璃平板中间制备电泳凝胶。垂直板式电泳常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。3电泳的基本装置电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。84电泳的基本原理生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。此外，分子量不同也会影响其电泳速度（阻滞力不同）。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。95影响电泳分离的因素1）缓冲液的pH

溶液的pH决定被分离物质的解离程度、带电性质及所带净电荷量。若溶液pH＜pl，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。若溶液pH＞pl，则蛋白质带负电荷，向正极移动。溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的pH值缓冲液。10DNA是两性解离分子，在pH8.0-8.3时,由于磷酸基团全部解离,使DNA分子带负电荷,在电场的作用下向正极迁移。不同大小和构型各异的DNA分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各分子的迁移率区别很小。但在采用适当浓度的凝胶介质（琼脂糖）作为电泳支持物时，因其具有分子筛的功能，使得分子大小和构型不同DNA分子迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。蛋白质电泳的缓冲液一般pH6.7，此时蛋白质都带负电，同样都向正极移动。常用核酸和蛋白质电泳缓冲液pH值112）离子强度电泳缓冲液通常要保持一定的离子强度；离子强度过低，则缓冲能力差，不易维持pH恒定离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛,ionicatmosphere），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。12电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。会造成电泳过程热量增大，导致：

①样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；②如果样品对热敏感，会引起变性失活；降低电场强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离物的扩散。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。4）电场强度：135）支持介质的筛孔支持介质的筛孔大小对的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快。具体表现为电泳胶浓度不同。琼脂糖聚丙烯酰氨2第二节琼脂糖凝胶电泳对于分子量较大的样品（如大分子核酸、病毒等），一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。琼脂糖电泳的优点（1）琼脂糖凝胶含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。（2）电泳速度快。（3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（4）样品易回收，常用于制备。3DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。从而分出不同的区带。琼脂糖分离原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围4琼脂糖凝胶电泳的基本过程材料：电泳缓冲液（常用TAE或TBE）、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶液（核酸显示剂）、加样缓冲液（保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳时间的指示系统）、水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统。基本过程：制胶放入电泳槽中并加入电泳缓冲液取出梳子将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中一定电