不同温度对细胞骨架的影响

不同温度对细胞骨架的影响【摘要】细胞骨架是维持细胞生命活动非常重要的结构成分,狭义上主要是指细胞质骨架，其装配和解聚受酸碱度、温度和钙离子浓度等多种因素的影响。本文使用显示细胞骨架最常用的考马斯亮蓝染色法初步探讨了酸碱度和温度对细胞骨架的影响程度。试验结果表明，不适当的酸碱度和温度都会导致细胞骨架的解聚，光镜下呈现不同程度的云雾状和空泡状，云雾状多出现在酸碱处理组，而空泡状多出现在温度处理组。【作者单位】龙岩学院生命科学学院；10生物技术【关键词】细胞骨架考马斯亮蓝酸碱度温度目的原理，材料，方法，预测结果，参考文献，设计依据一、 实验目的通过本实验的学习，了解在体外，温度对细胞骨架系统装配的影响，训练学生如何设计实验步骤来验证书本的知识点，使知识点掌握得更牢固，从而培养学生动手操作能力，独立思考问题，并通过查阅资料解决问题的能力，为今后遗传学的学习、毕业论文的完成等奠定基础。1•学握芳马斯薨藍n250对權■细胞骨衆集色的方法.通独对洋急内皮蜩熬的理，：鲫胸骨架的制*方法与9M形态观氯二、 实验原理细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管、中间纤维。一些细胞骨架系统的装配和去装配在时间和空间上是髙度有序的，在体外，它们在温度因素的作用下，可进行装配或去装配过程。考马斯亮蓝法显示细胞骨架的原理1、蛋白质的细胞化学:蛋白质是细胞中重要的结构和功能成分，某些染料能与蛋白质的氨基酸残基结合，产生颜色反应，借以对蛋白质进行显示。这种对蛋白质直接染色的细胞化学方法并不多，特异性也不强。目前，应用最广泛的方法是利用免疫标记技术对蛋白质进行特异性显示，通过荧光标记细胞骨架成分的单克隆抗体对细胞骨架蛋白进行显示。2、细胞中的细胞骨架成分：、细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构。其概念具有狭义和广义之分：狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同包括微丝、微管和中间纤维；广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。、细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。温度对细胞骨架影响的原理；温度处理导致解聚的骨架蛋白分布于胞质边缘，解聚后微丝蛋白重排，胞质内出现大面积，大小不一的空泡。经过一段时间不同温度的处理，细胞核有变小的趋势，从何细胞骨架也有影响。三：主要仪器、试剂实验用品(1)材料 洋葱内表皮(2)器材 显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、PH计。普通冰箱、低温冰箱、培养箱，恒温水浴锅。四个培养皿，刀片，镊子(3)试剂0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)0.2mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液(PB，PH7.3) 50ml0.15mol/LNaCl双蒸馏水加至1000mlPB77ml0.2mol/LNa2HPO4

77ml0.2mol/LNaH2PO4M-缓冲液咪唑（PH6.7）KClMgC12EGTAEDTA巯基乙醇甘油用1mol/LHCl调pH至7.2。1%的TrtonX-100/M-缓冲液0.2%考马斯亮蓝R250染液甲醇冰醋酸蒸馏水3%戊二醛-PB溶液（PH7.3）23ml50mmol/L50mmol/L0.5mmol/L1mmol/L0.1mmol/L1mmol/L4mmol/L23ml50mmol/L50mmol/L0.5mmol/L1mmol/L0.1mmol/L1mmol/L4mmol/L46.5ml7ml46.5ml步骤一：温度处理方法撕取洋葱鳞茎上的鳞叶，置于4个培养皿中,分别在-18°C冰箱、4°C冰箱、50°C培养箱和20°C（对照）中处理1h。步骤二：细胞骨架的制片与观察首先将洋葱片放入装有pH值6.8磷酸缓冲液的小玻璃瓶中，使其下沉；然后吸去磷酸缓冲液，用1%TritonX-100处理25min（抽提骨架以外的蛋白质）；吸去TritonX-100后，用M-缓冲液洗3次，每次3min,洗涤的同时可以稳定细胞骨架；再用3%戊二醛固定15min;吸去戊二醛后，用PBS洗3次，每次3min;用0.2%考马斯亮蓝R250染色15min;用蒸馏水洗涤2次；取出洋葱鳞茎内表皮，展平在载玻片上，空气干燥；最后镜检。（1）、洋葱表皮细胞取材后，用PBS液轻轻漂洗。（3次，3min/次）、用l%TritonX-100/M缓冲液处理15min(30min),室温或者37C均可。、M缓冲液轻轻洗细胞3次(3-5min/次)，M缓冲液有稳定细胞骨架的作用。、3%戊二醛-PBS液固定细胞5-15min(不制备永久装片，甲醇-冰醋酸混合液。固定15-20min)。、PBS液洗涤细胞若干次(3次，3-5min/次)，用滤纸吸干。、0.2%考马斯亮蓝R250染色30min,小心用水漂洗，空气干燥，封片，观察。(蒸馏水洗2次，滴加二甲苯透明，制成水装片)、用普通光学显微镜观察，可见到深蓝色的纤维束，粗细不等，基本上平行排布，张力纤维是一种动态结构，在充分贴壁铺展的细胞中纤维挺直、丰富，形态比较典型，当将贴壁培养的细胞从基质表面除下时，细胞变圆，张力纤维随之消失。取洋葱内皮1cm左右置于含PBS液的载玻片上

湿润后，吸去PBS

加2滴1%TritonX-100/M-缓冲液，15-30min吸去缓冲液，M缓冲液轻轻洗细胞3次，加3%戊二醛-PB溶液，固定30min?加PBS洗2次，共3min

加0.2%考马斯亮蓝R250染色30min

用PBS洗2次，共2min,吸干

镜检并绘图

图4-4细胞骨架标本制作过程五：依据：在真核细胞的细胞质中分布着一种纤维状的结构系统，即细胞骨架，它包括微管、微丝和中间纤维三种不同类型的纤维结构。这些骨架纤维是由不同的蛋白质亚单位以特定的方式聚合形成的。正是因为这种独特的蛋白质组成和结构特点，使得细胞骨架具有其特有的理化性质，一些能使蛋白质变性的化学试剂（如秋水仙素、SDS）还有物理因素都可以使其或多或少地发生变化。六、实验操作注意事项：（1） 、每一次加液或染色后，应用PBS洗2次，并用滤纸吸干。PBS冲洗应适度，否则洋葱表皮细胞吸收大量水分易使液泡过分涨大，影响实验结果的观察。（2） 、实验操作中，Triton的抽提是最关键的步骤，应注意抽提适度，建议应扌空制在30min左右。七：实验结果：:W做锻卜汴懑內表皮细也的辂丽S晰川见CisllfflL细'lUSS'l界叩W.10x10倍鳖下町粗略观察到细胞内粗细不胖的藍色低用块形威恼网状结构“冋一细胞内各处胃架的密集度不均匀，细胞核区域询歼堆相对酯集、蓝色旅■R-甚至分辨不出网络谿构，列外对见细腿壁区域有零圮蚯■&汁维门札相邻细胞的密集打度乩本一錢・{ll'fi少数细胞冇较九的此10X40倍（I下可清樂观卿軌蓝色的岡状蜻枸确实由线性针维交织咸，纤维间的结m稍膨九细咆边塚笫架较椅疏.卩川aihs胞壁相同匹【訶的野购艮成的细胞质膜何轮關打细胞内部的纤绯通过纵向的纤维相连。相邻细胞有纤维穿过胞同的细胞忆调节讪微覆焦血川观察到却1駁不同橫切丽的网络结构的变化.表明细胞骨架以二雉/tH.'i问的形式分祁在整亍细胞内"洋釐内皮绷脂中的妞胞骨鼻豁的洋釐内皮绷脂中的妞胞骨鼻豁的Z2温度对洋葱细脛骨架的影响結果温度对洋葱内表皮细胞骨架的影瞅400®如图2所示。山團2可见，在20C和4C处埋的洋葱鳞茎内丧皮细胞中骨架清曲浣整呈网络状外仏在-I池时鈿腕骨架几乎消先黒留有部分细胞核:然両在和€处埋后洋葱鳞茎内盍皮细胞中骨架有解聚现象,但仍能见到部分细胞骨架「所以播瀨1,洋翹鳞茎内表皮细胞的骨架助受温度影响，低温对其影响较.扎高温也有癒响，世不如低温的影晌剧烈。A.-瓦匸处理后的洋遞轴腕労架EL4匸扯磋店的洋葱鈿舱骨架tl50fA.-瓦匸处理后的洋遞轴腕労架EL4匸扯磋店的洋葱鈿舱骨架tl50f如理后的洋落細电带架实验心得整个实验做下来，感觉与其他那些照着实验讲义做的实验有很大不同，而这样的实验一做确实发现我们在实验上的不足。进大学2年以来做实验都养成了照着讲义按部就班的习惯，写起实验报告也有了自己一套惯用的格式，感觉实验不过如此。而探究性实验的实验拿到手，面对空无一字的讲义顿时傻了眼，一下子不知道从哪里入手，也不知道该做什么实验。所以觉得自己真的对一些生物知识的兴趣少了些敏感、