DB15-T 2907-2023溶血性曼氏杆菌病诊断技术规范

ICS11.220CCSICS11.220CCSB41内蒙古自治区地方标准DB15/T2907—2023溶血性曼氏杆菌病诊断技术规范Technicalspecificationforthediagnosisofmannheimiahaemolytica2023-03-102023-03-102023-04-10内蒙古自治区市场监督管理局发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。本文件起草单位：内蒙古大学、内蒙古蒙微生物科技有限公司、金宇保灵生物药品有限公司。本文件主要起草人：王炜、王岩、赵丽霞、韩四娥、孟凯、胡薇。溶血性曼氏杆菌病诊断技术规范范围PCRELISA（GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T14926.43-2001实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂3术语和定义3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。Mh：溶血性曼氏杆菌（Mannheimiahaemolytica）LKTA：白细胞毒素蛋白A（LeukotoxinA）PCR（Polymerasechainreaction）DNA（Deoxyribonucleicacid）bp（Basepair）dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleosidetriphosphates）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）TSB：胰蛋白胨大豆肉汤（Trypticsoybroth）PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebuffersolution）ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay）5临床诊断流行病学由溶血性曼氏杆菌引起的牛、羊呼吸道疾病，一年四季均可发生，秋冬季多见。40℃～42除另有规定外，所用试剂均为分析纯。试验用水均符合GB/T6682-2008二级水规定。TSBA.1）0.01mol/LPBS75%5mL2mL3mLTSB5mL2℃～82℃～8℃条件752mL～5mL2℃～8试剂耗材绵羊血琼脂平板（配制方法见附录A.3）、革兰氏染色液、瑞氏染色液、生化鉴定管、细菌培养皿。仪器高压灭菌锅、恒温培养箱、光学显微镜、生物安全柜、组织匀浆器或研磨器。样品处理6.2.12mL802×2×3cm5mL2mL-80细菌分离TSB37℃、120r/min12h～16h37℃培养24h，使之形成菌落，以供纯化鉴定用。7.4.124h（BB.1）染色镜检按照GB/T14926.43-2001中3.1进行操作，可见革兰氏阴性短杆菌或球杆菌（参见附录B中图B.2）。液3～513min～5min中图B.3）8PCR试剂耗材DNA（）、DNADL2000（CVCC4091）gcp（B.4）、PCR（BB.1）1.5mL0.2mLPCR仪器PCR扩增仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统。细菌基因组DNA提取将7.4.1中增菌培养后菌液或7.4.2中纯培养菌落用商品化试剂盒进行基因组DNA提取。提取方法按试剂盒说明书进行。PCR扩增每次进行PCR扩增时，除检测样品外，均需设置阳性对照和阴性对照。8.4.1PCR12.50.5µL，ddH2O25µL。8.4.2PCR945min；9430s；5030s；7240s；3010min。PCR用1×TAE2%5µLPCR（DL2000），5V/cm，30minPCR227bp8.6.1PCR227bpPCR227bp（-）（B9间接ELISA抗体检测试剂耗材LKTAMhMh（A.4）（（TMB显色液（A.8）A.9）。仪器酶标仪、微量振荡器、恒温培养箱、洗板机。检测步骤Mh重组LKTA蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为0.5μg/mL，每孔100µL包被96孔酶标板，4℃包被16h。用洗涤缓冲液洗板5次，每孔200µL，每次3min，洗涤结束后拍干。然后按200µL/孔的用量加入封闭缓冲液，37℃封闭2h，用洗涤缓冲液洗板5次后拍干。ELISA1:200100µL/孔加入反应板，每个样品两个重复，37℃孵育2h，洗板同9.3.1。100µL3745min9.3.1。100µLTMB3715min。50µL450nmOD阳性对照OD450＞0.5，且阴性对照OD450＜0.2，试验结果有效；否则，应重新进行试验。O450＞.MhOD45≤0.，Mh10综合判定5Mh10.178Mh9Mh附录A（规范性）试剂的配制胰蛋胨 17.0g大豆白胨 3.0g氯化钠 5.0g磷酸二钾 2.5g葡萄糖 2.5gpH7.3±0.2（TrypticSoyBroth,1000mL12115min0.01mol/LPBS氯化钾磷酸二氢钾磷酸氢二钠0.2g氯化钾磷酸二氢钾磷酸氢二钠0.2g0.24g3.65gpH800mL100015min，室温保存备用。A.3绵羊血琼脂平板胰蛋白胨大豆胨氯化钠琼脂15.0g5.0g5.0g15.0gpH7.3±0.2准确称取胰蛋白胨大豆琼脂（TrypticSoyAgar,TSA）40g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，加入10%绵羊脱纤血充分混匀后倒平皿。A.4包被缓冲液（0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液）碳酸钠碳酸氢钠去离子水0.318g0.588g200mL用0.22μm滤膜过滤除菌，室温保存备用。A.5封闭缓冲液（含3%BSA的PBST）pH7.4PBS 1000mL吐温-20 0.5mLBSA 30g现配现用。—PBSTpH7.4PBS 1000mL吐温-20 0.5mL现配现用。1%BSAPBST）pH7.4PBS 1000mL吐温-20 0.5mLBSA 10g现配现用。TMBATMB（分纯） 200mg蒸馏水加至1000mLA.8.2底物液B（（蒸馏水加至1000mLA.8.2底物液B（（）0.7514.6g9.33g6.4mL加至1000mL，pH值调至5.0～5.4A.8.3将底物液A和底物液B按1:1混合，即成底物显色液，现配现用。A.9终止液111mL分析纯浓硫酸缓慢逐滴加入889mL去离子水中，分装保存备用。附录B（资料性）溶血性曼氏杆菌分离鉴定溶血性曼氏杆菌分离培养见图B.1。图B.1溶血性曼氏杆菌接种平板革兰氏染色见图B.2。图B.2革兰氏染色结果图B.2革兰氏染色结果革兰氏染色结果图B.3瑞氏染色结果GcpACTGGATTTCAGTTTCTCCGGTTTAAAAACCTTTGCTGCGAATACGATTAAAG。溶血性曼氏杆菌PCR扩增引物见表B.1。表B.1溶血性曼氏杆菌P