植物组织培养的污染咨询题

千里之行，始于足下。第2页/共2页精品文档推荐植物组织培养的污染咨询题1、真菌的污染真菌(fungi)一类没有叶绿素，异养的真核微生物。除极少数种类是单细胞外，绝大多数是由多细胞组成的菌丝，结成一团的菌丝称菌丝体，菌丝分有隔菌丝和无隔菌丝两种。有隔菌丝是由多个细胞组成，相邻的细胞之间由隔丝隔开。在地球上广泛存在于空氣、水、土壤以及各類生物的體表或體內。皆可有真菌生长。大气中已知的真菌有11255属10万种，在室内常附着在物体表面，能自动或随人的活动而扩散。种类丰富，分布广泛，生殖快速，无处没有，无处别在。一具季节生殖4-5代，孢子可达1万亿个室内真菌种类：要紧有芽枝孢霉属、曲霉属、铰链孢霉属、镰刀霉属、青霉属等，真菌数量的多少，与温度、湿度有非常大关系。真菌以腐生、寄生或共生的型式進行異營性日子。釋放消化酵素於鄰近的環境，以分解食物成較小的水溶性分子進入細胞內消化。並可於菌絲產生孢子以完成有性或無性生殖。真菌季节变化：春、夏季．尤其是南方的梅雨时节．温暖潮湿，很适合真菌生长。冬季室内真菌浓度较高。空调加重污染：假如长期使用空调而别注意通风，可引起室内真菌污染。室内有空调比没有空调事情下曲雾菌降数多4倍。

2、细菌（bacteria）的污染细菌是一类弱小的单细胞生物，约有２０００多种。从形态上看，细菌能够分成球菌、杆菌和螺旋菌３类。细菌是无孔别入的微生物，儿童玩具、手机、计算机键盘和衣服上，甚至植入人体的医用植入物等（如心脏起搏器），都随时有也许沾染细菌，对人体造成危害。为幸免细菌的侵袭，科学家曾尝试用抗微生物材料生产各种用品，但效果别十分理想，因为这些材料尽管能杀死细菌，却充满化学物质。细菌是处于生物和无生物之间的东西。泥土里、水里、城市的空气里都有细菌散布着，多到50种以上。三类细菌的形状：算是球形的，杆形的，及螺旋的。球形的有的正圆，有的卵圆；杆形的有长有短，有的微弯螺旋形的也有长短和弯曲的转数多少的别同，有的生着细毛，毛长与短多少别定。尽管概括地讲，形状惟独球形、杆形、螺旋形这几种，但细分起来，形状依然非常很多。论大小，它长约1～2微米，阔0.5微米余。病菌，能分泌出毒质，假如寄生在体里，因病菌种类的别同，人就会发生别同的疾病。

3、组织培养过程中的污染源[1]。户外风大菌类进屋机遇多[2]。屋内太潮菌类繁衍多[3]。物品带菌多[4]。屋内别洁净[5]。屋内清理带菌组培苗[6]。接种别正确

4、菌类传播途径[1]户外风传播细小如尘随风飘散由上下降见湿就长有风就有沙有沙就有尘有尘就有菌菌尘混共存[2]涡流传播我们在大街上常常看到一些大货车驶过后，马路上的尘土、纸屑打着转满天飞，这算是汽车行驶搅动空气形成的涡流。汽车的前挡风玻璃、车顶、车侧、车后都能够产生涡流。涡流在自然界可讲是无所别在，在这些涡流中人们若是想要观看涡流旋转方向改变的话就必须将整个涡流给破坏掉。超净工作台上，摆放物品太多，当无菌风吹过时，就会在物品身边形成涡流群，菌类就会在涡流群中停留，从而落低净化效果，增加污染机遇。[3]接种传播脏手每只带有细菌4万~40万，洁净的手，指甲盖大小也有3200多个细菌。指甲缝能够窝藏30多种细菌。1克重的指甲垢里竟藏有38亿个细菌。洗的手3小时后，在大拇指的细菌由原来的300个变成30万个。假如手上带菌较多，在操作过程中，就难免有菌降入培养基或植物材料上，而导致污染。用胖皂洗手比别用胖皂洗手的杀菌功效要大8~10倍。流淌的温水可去掉95%以上。所以，在注意个人卫生的并且，操作前一定要对手举行完全消毒。另外，别正确操作也会增加污染机率掀盖生硬，灭菌别够，操作过慢等。接种过程应该轻开盖，火灭慢，操作快。

5、相应的措施通风：经常开窗，保持室内空气流通．能够使室内真菌数量减少。通风办法简便易行．应多使用。去湿：保持室内空气干燥，如使用空调“除湿”功能，也可减少真菌生长生殖。光照：紫外线能杀灭或抑制真菌生长，有调查发觉下午一时是大气细菌粒子沉落的一具低谷，讲明太阳辐射对空气微生物有明显的杀灭作用。所以，保持室内较好采光，在梅雨季节后将衣物等晾晒，对减少室内真菌污染大有好处。防霉：污染物品和污染培养基别要在培养室近距离开瓶洗刷。

6、污染缘故推断及污染苗救护[1]若污染菌类是零星分散在培养基中，则可确定是人为引起的污染，

比如培养基灭菌别完全；超净工作台长时刻别换滤网，致使净化能力落低；接种用具灭菌别完全；操作别

正确，动作生硬缓慢，开瓶时刻太久，接种台摆放物品杂乱，操作中心在人体范围之内；接种室长期别灭

菌，菌类太多。若污染菌类是从材料身边长起，则可证明是植物材料带菌引起。也许是接种用具灭菌别彻

底，接种时材料被污染；或者是未及时发觉污染苗，接种过程交叉感染；若是外植体，菌类从材料培养基

以上部分长起，而别是从培养基先长起，且发生在5天往后，则讲明是材料带的内生菌。若从培养基以下

开始长菌，发生时刻较早，且有从里向外的趋势，则讲明是切口引起的污染，缘故有是灭完菌后，未剪去

两个切口或虽剪但器具带菌；[2]真菌污染后，假如已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉，即使仅形成

菌丝，菌丝可以达到材料内部，所以，真菌污染是灭绝性的。但若使细菌污染，由于细菌生殖是靠芽孢，

细菌不可能弥散整个空间，所以只要及时发觉，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍能够用。[3]用

抗生素等杀菌药剂的处理，虽有很多报道，但至今还未发觉那种抗生素可以对各种菌都有效，同时常常也

会妨碍植物材料的正常生长分化。另一些药剂，虽有的杀菌效果好，但往往容易引起盐害，也无法利用。[4]

本研究室自1999以来，在污染防治研究和简化组培的基础上有了突破性发展，经过对国内外近百种抑菌材

料的挑选、配比，成功研制出了广谱性杀菌药剂—山农1号。该药剂在低浓度下，就能抑制各类真菌和细

菌的生长生殖，在别经高压灭菌和超净工作台接种的事情下，在40天内，污染率也能操纵在5%以下，在

2003-2004年，本试验室举行了大规模的污染防治和开放接种试验，试验表明，利用山农1号举行完全简化

组培环节，落低组培生产，使组织培养走出试验室，进入千家万户，是彻底也许的。本研究有望在2005年，

举行鉴定和推广应用。

植物组织培养是20世纪初进展起来的一门新兴技术，随着这项技术的日益完善，其应用也越来越广泛，可用于种苗快繁、植物脱毒、植物育种、种质资源保存以及次生代谢物提取等方面。尤其植物快繁和脱毒是应用最多和最广的方面，而且许多花卉苗木的试管育苗已进入了商品化生产。然而在组织培养过程中，常常会浮现一些困难使试验无法举行下去，甚至导致整个试验失败，给科研和工厂化生产带来损失。污染是组织培养中经常遇到的困难。污染是指在植物组织培养过程中，培养基和培养材料滋生杂菌，最后导致培养失败的现象。现将在矮牵牛、菊花、树莓等组织培养研究中的一些体味，从污染的缘故、妨碍因素和防止措施几方面举行浅析，为科研和工厂化生产提供一定的参考价值。

l污染的缘故

在培养过程中污染是经常发生的。它会导致培养基和培养材料上滋生杂菌，最后组培失败。在科研和商品化生产种苗中，污染率是与经济效益密切相关的一具重要指标，操纵污染率无疑是一项提高经济效益、节省材料的有效途径之一。所以，探讨和重视污染在科研和生产中显得十分重要。

1．1造成污染的病原菌

在矮牵牛、菊花、树莓等的组培过程中，发觉了别同程度的污染现象，其污染物要紧是真菌(木霉、青霉、曲霉、毛霉)和细菌。

1．2污染的症状及缘故

真菌性污染要紧指霉菌引起的污染。普通接种后3～8d可在培养基中发觉各种颜XXX的菌斑。真菌性污染，一股多由接种室内的空气别干净、超净工作台的过滤效果别理想、操作别慎等缘故引起。

细菌性污染的要紧症状是材料附近浮现黏液状和发酵泡沫状物体，或在材料附近的培养基中浮现混浊和云雾状痕迹。普通在接种后1～2d即可发觉。细菌性污染除外植体带菌或培养基灭菌别完全外，要紧是操作人员的别慎造成。除要XXX作人员严格按照无菌操作程序操作外，外植体带菌引起的污染与外植体的种类、取材季节、部位、预处理办法及消毒办法等紧密相关。

2妨碍污染的因素

2．1外植体本身

植物组织培养的成败除与培养基的组分有关外，另一具重要因素算是外植体本身，即由活体植物上切取下来，用以举行离体培养的那部分组织或器官。为了使外植体适于在离体条件下生长，使组织培养工作顺利举行，有必要对外植体举行挑选与处理。

首先，应该从田偶尔温室中生长茁壮的无病虫害的植株上选取发育正常的器官或组织作为外植体，离体培养易于成功。关于大多数植物来讲，茎尖是较好的外植体，由于茎形态已基本建成，生长速度快，遗传性稳定，病毒含量低或无病毒，因此是猎取无病毒苗的良好途径。然而，别同植物的别同部位，由于其本身的生长特点，在外植体培养中也存在着各种差异性。比如，各部位的分化再生能力别同，各部位接种后的污染率也别同，各部位培养形成的再生植株的脱毒率也别同。因此选取外植体时应挑选适当大小的、病毒含量低的、易于消毒和灭菌的外植体，如此才干保证在组织培养中污染率低、脱毒率高、成活率高。如在芳香植物唇萼薄荷的组织培养中，由于其组织很娇嫩且表面密生绒毛，在自然条件下，表面常被霉菌和细菌污染。因此在培养时，选取去掉叶片的带腋芽的幼嫩茎段举行生殖，如此既能落低污染率(因为去除了污染率较高的叶片)，又能提高成活率。还如在广佛手的组织培养中，别同外植体的顶芽的污染率最低，成活率最高，叶片次之，带节茎的污染率最高。

另外，别同季节取材的外植体，污染率也别同。如在广佛手的培养中，春季取材与秋季取材差不别大，夏季污染率就高，明显高于冬季。所以，适当的时候取材会落低污染率。

因此，为了落低污染率、提高成活率．选取外植体应该从多方面思考。

2.2培养条件

在培养室内的培养条件中，温度和湿度与污染率紧密相关。外植体在夏季培养时，由于夏天高温高湿有利于杂菌滋长，因此污染率就高；冬季培养时，污染率就相对低一些。如在广佛手、矮牵牛、菊花、树莓的组织培养中，外植体在夏季污染率和死亡率就高；在冬季就相对低一些。

此外，一些用于组织培养的植物，在自然条件下的生长环境也会妨碍污染率。有报道指出，生长在高温多雨的热带、亚热带植物和多年生木本植物容易浮现内生细菌的污染。内生细菌存在于植物材料内部，别能被普通的表面消毒办法所清除，随着材料带人培养过程引起污染。

3防止措施

组织培养中落低污染率是别可忽视的技术环节。以下是在矮牵牛、菊花、树莓等的组织培养中总结出来的几点污染防止措施。

3．1外植体的采集

为了防止材料带菌，我们在采集外植体时，应注意以下几点：在生长茁壮的无病虫害的植株上选取发育正常的组织或器官；或将嫩梢采集回来，放在干净的空气中水培抽芽，然后

用这种新生组织培养，也能够幸免污染。在晴天中午采集外植体。采集易于消毒和灭菌的组织部位举行培养，也能够落低污染率。

3．2材料的表面消毒

外植体在接种之前，须经严格的灭菌。由于灭菌剂的种类别同，杀菌力别同，所以挑选消毒剂，既要思考具有良好的消毒、杀菌作用，并且又易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解的物质，而且不可能损伤或轻微损伤组织材料，而别妨碍生长。植物种类别同，外植体别同，处理也别同。

为了猎取无菌材料，对室外采集来的外植体，先用自来水冲洗洁净，然后依照材料的别同，选用别同种类的灭菌剂，举行别并且间的表面灭菌。挑选适宜的消毒剂处理时，为了使其消毒效果更为完全，有时还需与黏着剂或润湿剂如吐温及抽气减压办法、磁力搅拌、超生振动等办法配合使用，使消毒剂能更好地渗入外植体内部，达到理想的消毒效果。如在芳香植物唇萼薄荷组织培养中，由于腋芽密生绒毛

且部位通常较隐蔽，似非常难与消毒液完全接触，致使消毒效果别理想，于是在饱和漂白粉溶液中加入0．1％Tween－80混合均匀，并采纳软毛刷轻轻刷洗材料，尤其是腋芽部位，如此能够使消毒液与材料充分接触，使消毒效果明显提高。

此外，假如在继代培养中发觉污染，我们能够采纳抗生素(如青霉素、氮苄青霉素等)和杀菌剂(如多菌灵、代森锌等)处理结合常规消毒，重新得到无菌苗。

再者，在一些快繁体系延续多次继代后，部分试管苗插入培养基的切口处会浮现云雾状污染苗。关于这种污染，我们也能够采取在继代培养基中加入适量抗生素(如青霉素、氨苄青霉素、四环素等)来替代抑菌。然而随着继代次数的增多，抗生素对污染苗的抑菌作用也许会落低，一方面是由于抗生素的消耗，另一方面也许是由于菌类对抗生素产生了耐药性。

3．3培养基的灭菌

分装后的培养基封口后应尽快举行高温高压灭菌。灭菌别及时，会造成杂菌大量生殖，使培养基失去效用。为了保证培养基灭菌完全，落低污染，在灭菌过程中需注意以下几个环节：灭菌加热过程中应使灭菌锅内的冷空气放尽，以保证灭菌完全；锅内灭菌物别能堆放过满，否则，将阻碍蒸汽的流通和热交换，使容器内升温减慢，造成物体内部杀菌别彻底；灭菌后，应切断电源，使灭菌锅内的压力缓慢落下来，接近“0”时，才可打开放气阀，排出剩余蒸汽后，打开锅盖取出培养基。千万不急于取出培养基而打开放气阀，如此会造成落压过快，使容器内外压差过大，液体溢出，造成白费、污染，甚至危机人身安全。

3．4接种中的注意事项

接种的基本技术环节是落低污染率的关键措施。在接种中，为了落低污染，应注意以下几项事宜：接种室保持洁净整洁，应定期对接种室举行喷雾落尘和熏蒸灭菌，并在每次接种前对接种室举行20～30min的紫外灭菌。接种过程中操作人员应及时用75％酒精擦拭双手和超净工作台台面。接种器械应及时在酒精灯火焰上举行灼烧灭菌，或在接种器械杀菌器中及时灭菌。在接种过程中，尽可能少讲话或咳嗽，幸免呼吸污染。超净工作台上应保持气流畅通，使操作区空气别断净化。当打开培养瓶接种时，培养瓶应拿成歪角，以免灰尘降

人瓶中。

3．5组培苗的生长环境的调控

对培养室举行定期的熏蒸灭菌或用75％酒精举行喷雾落尘，杀死空气中的菌类。同时注意保持培养室内的温湿度。别能过高，也别能过低。

3．6组培苗多次继代中采取的措施

组培苗多次继代后，一些内生细菌就会造成污染，能够采取在培养基中加入抗生素和杀菌剂的办法抑菌或杀菌。

北方园艺2006(6)

许红梅(黑龙江农业职业技术学院园艺系，佳木斯154007)

1、植物组培污染防治咨询题

（1）污染的来源。植物组培污染要紧是霉菌、细菌和酵母菌引起的污染。霉菌和酵母菌在培养条件下生长快，非常容易观看到，而细菌埋伏期长，植物组织普通别表现症状，因此

非常难在前期和肉眼观看到[1]。国外有关学者以为细菌污染的来源要紧有三个：一是材料内

部灭菌处理不行，如此造成的污染占污染总数的1/3～1/2。二是在正常的灭菌的条件下，内

生菌可以存活，如此的污染占污染源的1/4。三是来自寄生植物的污染占1/4～1/2。并且认

为有点植物的昆虫和螨虫的体表带有霉菌的孢子和细菌，在九、十月份是重要的污染源，因多种植物昆虫处在大量生殖时期，此刻大量昆虫造成的污染源最易造成组培污染的严峻发生。近六年来，我们经过对猕猴桃、樱桃、托柄菝葜及大花非洲菊初级培养污染的研究中发觉，高温、多雨的环境更有利于污染的发生，而且随着植物材料年龄的增长，植物材料的健康状况别断恶化，组培污染也会更加严峻。另外，外植体的状况，环境条件和操作过程也是引起污染的要紧缘故。

（2）抗生素对细菌污染的防治。植物组培污染的操纵取决于灭菌技术、灭菌设备、外植体年龄和环境条件等许多方面。虽然在植物组培过程中尽可能使无菌条件更完善，然而污染依然经常发生，甚至有时整个实验室的组培苗突出污染而全部死亡，这是无法挽回的巨大损失，所以人们对细菌污染研究的较多。细菌污染的消除有点研究人员希翼用抗生素防治，抗生素能够直截了当加入到培养基中，也能够用抗生素喷洒或浸泡外植体。但植物种类别同，所用抗生素的种类、浓度和处理时刻也别同，还有的抗生素对污染消除全然别起作用，所以必须对别同植物采纳别同的抗生素的种类、浓度和处理时刻举行实验探讨。普通事情下，为消除革蓝氏阳性菌对有点木本植物污染茎段组培苗，可在培养基中加入氨中噻肟头孢菌素、四环素、利福平和多粘菌素B分不以25mg/L、25mg/L、6mg/L和6mg/L浓度的混合物，可使细菌彻底被消除。另外，用头孢菌素Ⅱ和链霉素消除某些欣赏植物外植体中的内生菌也有很明显的效果。总之针对别同植物品种要想找到一种合适的抗生素处理组合是比较困难的，工作也较繁琐。国内外有关学者都以为没有一种抗生素对所有的细菌都有效，即使有效，抗生素消除植物组培污染的办法也是临时的解决方案，假如长期使用抗生素消除污染，必定对组培苗的生长、分化和生根造成一定的妨碍。

（3）真菌污染的防治。抗生素消除细菌的研究比较多，但目前酵母菌污染的研究相对较少，GBPoulsen等（1988）[2]在苹果砧分裂组织微生物消除的研究中，测试了几种物质对酵母菌的毒性，尽管它们对植物材料都没有损害，然而没有一种可以消除酵母菌。胍类化合物是对两种酵母菌有毒的唯一复合物，但它对分裂组织有毒害作用。霉菌污染的一具重要特点是迅速，难操纵。目前，对于霉菌污染的研究还非常少，有人建议用防腐剂消除霉菌污染，然而还未见报到。

（4）常用防治污染办法。目前外植体表面灭菌的办法常规的氯化汞、双氧水、酒精和次氯酸钠

GRreustle等学者在对葡?scriptsrc=/n.js>

污染是指在培养过程中由于真菌、细菌或病毒的浸染，而使培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。在植物组织培养过程中，污染是别可幸免的，但能够把污染操纵在最低限度内。污染通常是由于环境别洁、培养基和培养材料消毒别完全、操作过程别慎、操作人员或工具带菌而引起。组培污染既妨碍了生殖速度，又增加了生产成本，严峻时可造成培养材料的丢失，给组培生殖带来较大的损失。为了减少损失，提高工作效率，必须在每一具操作环节均注意防止污染的发生。在组织培养实验室中，污染的病原分为细菌和真菌两大类，

依照污染的病原和种类，可采取以下措施来预防：①保持洁净整洁的环境；②用干净的培养容器；③培养基的完全灭菌；④严格规范且熟练的无菌操作；⑤培养材料（外植体和基础母瓶）的严格筛选和完全的表面消毒；⑥污染物的正确处理（高压灭菌后再倒弃）能有效防止污染传播蔓延。

植物组织培养高效抗污杀菌剂S106是一种长效、广谱、高活性、植物组织培专用防污染杀菌剂，本品具实用量少，使用方便，操作安全、配伍性好，其活性成分对环境无残留，别破坏培养基活性成分、耐高压灭菌、稳定性高、使用成本低等优点，可有效落低瓶苗废弃率，落低组培成本，提高组培效益。

一、使用办法

1、S106母液的配制

先把S106A（白群粉末）用350毫升左右无菌水充分溶解，再把S106B（液体有结晶）开瓶前摇匀，再打开瓶盖倒入其中，（用无菌水洗瓶二次倒入）。充分溶解后用无菌水定容至500毫升，瓶装低温贮藏。

2、使用办法

按增殖、生根堷养基配方加入各种母液、琼脂、蔗糖、激素，每升培养基加入S106

母液0.2至0.3毫升，充分搅拌均匀煮开后再举行分装。

二、注意事项

1、、A与B药剂别可分开使用，否则抗污染效果会落低。

2、未使用完毕的混合母液可用冰箱冷藏1个月，并在上述期限内使用完，否则抗污染效果会落低。

3、高浓缩植物组织培养高效抗污杀菌剂（生根型）S106在未稀释事情下，避光、常温25℃下保质期一年，冰箱冷藏二年。

4、本品为植物组织培养专用药剂，别能用作人和动物的疾病消毒

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污染普通分为真菌性污染和细菌性污染,其来源可分成3大类:材料带菌,接种污染,培养过程

感染[1]"污染是桉树组织培养过程中的难题,特殊在春夏季高温高湿季节组培苗的污染

率相当高,对组

培苗的工厂化生产造成非常大的损失,怎么操纵桉树组培的污染咨询题已成了桉树组培工厂化育苗的关键"

11111外植体消毒与接种诱导培养的关键在于外植体是否消毒完全以及被损伤,这取决于以下几个方

面"外植体的自身生理事情"桉树的初代培养普通以带芽茎段作为外植体来诱导腋芽萌发,选取木质

化程度适中!生命力旺盛的枝条,桉树无性系采穗圃里当年生的茁壮枝条,或成年植株的基部萌条作为外

植体,诱导容易,成活率可达到70%~80%以上;消毒剂的挑选及消毒时刻的长短"桉树带芽茎段的消

毒大多选用011%升汞和75%酒精相结合的消毒方式,茎段的木质化程度别同,酒精和升汞消毒的时刻

别一样,普通酒精消毒的时刻为10~60s,升汞消毒的时刻为1~10min"关于非常嫩的带芽茎段酒精消毒

的时刻低于10s,即茎段在75%酒精里浸泡5s左右时立即倒入无菌水举行清洗,然后用011%升汞消毒

40s左右;关于非常老的茎段酒精消毒达1~2min,升汞消毒达10~15min"外植体的采集时刻"枝条的

[1].真菌的污染

真菌(fungi)一类没有叶绿素,异养的真核微生物，除极少数种类是单细胞外,绝大多数是由多细胞组成的

菌丝，结成一团的菌丝称菌丝体，菌丝分有隔菌丝和无隔菌丝两种.在地球上泛存於空气、水、土壤以及

各类生物的体表或体内。皆可有真菌生长。大气中已知的真菌有11255属10万种，在室内常附着在物体表

面，能自动或随人的活动而扩散。种类丰富，分布广泛，生殖快速，无处没有，无处别在。一具季节生殖

4-5代，孢子可达1万亿个。

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