生物化学教学课件：第三章 酶与催化反应

第三章

酶与催化反应

ENZYMESANDCATALYTICREACTIONS酶学研究简史公元前两千多年，我国已有酿酒记载。1833年，AnselmePayen提纯了麦芽淀粉糖化酶（淀粉酶）。

1878年，Wilhelm

Kühne首次提出enzyme一词。1894年，EmilFischer证明了酶的专一性，酶与底物之间作用的锁钥关系。1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。

1913年，LeonorMichaelis和MaudMenten推导出酶反应的动力学方程式。1926~1930年，JamesSumner和JohnH.Northrop分别将脲酶和胃蛋白酶、胰蛋白酶制成结晶，确定了酶的蛋白质本质。1941年，GeorgeBeadle和EdwardTatum的“一个基因一个酶”假说首次将蛋白质与基因联系在一起，推动了生物化学与遗传学的结合。

1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。1995年，JackW.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。第一节

酶和酶促反应

EnzymesandEnzymaticReactions

一、化学反应具有热力学和动力学特性

（一）热力学性质涉及反应平衡和能量平衡1．反应平衡可用平衡常数来描述

反应平衡（reactionequilibrium）

任何一个化学反应在正向反应与逆向反应速率相等时，反应便不再有新的产物生成,这时的化学反应称为反应平衡。

平衡常数（equilibriumconstant,Keq）

平衡常数是指化学反应达到平衡时，反应产物浓度积与剩余底物浓度积之比。

S1+S2P1+P2Keq=[P1]eq[P2]eq[S1]eq[S2]eq一定的温度下，Keq与反应的初始浓度无关，它反映化学反应的本性。Keq越大则反应越倾向于产物的生成，即正向反应进行得越完全；Keq越小则逆反应的程度越大。Keq是化学反应可能进行的最大限度的量度。

2．自由能的变化是化学反应的动力

自由能（freeenergy）

自由能是能够用于做功的能量。

反应物的自由能（G）与其焓、温度（T）和熵（S）相关，等于其焓减去绝对温度和熵的乘积，即G=H

TS

。在生物系统中，生物分子在等温、等压条件下，在化学反应中能量的变化可以用自由能变（

G）来量度。

G=H

TS

自由能的变化是化学反应的动力，影响化学反应的方向。

G<0

反应为释能反应（exergonicreaction）可以自发进行

G>0

反应为吸能反应（endergonicreaction）不能自发进行

G=0

反应正逆向速率相等，反应处于平衡状态

反应方向与H、S和T的关系

H

S

G=HTS<0放热>0熵增在任何温度下，

G<0，反应自发向右进行<0放热<0熵减反应仅在温度低于H/S时，

G<0，反应自发向右进行>0吸热>0熵增反应仅在温度高于H/S时，

G<0，反应自发向右进行>0吸热<0熵减在任何温度下，

G>0，反应均不能自发向右进行

G/S

=H/ST3．标准自由能变与平衡常数有关

标准自由能变（G’）是指在标准状态下的自由能变

标准状态:

压力=1大气压（101.3kPa）

温度=298K（25C）

pH=7.0

[S]=[P]=1mol/lG=G’+RTln

[P1][P2][S1][S2]反应达到平衡时即

G=0

G’=

RTlnK’eq

在S1+S2P1+P2中（二）动力学性质是对反应速率的描述

动力学是研究化学反应速率及其影响因素的科学。

反应速率是单位体积内反应进度随时间的变化率,任何反应速率均由底物浓度和速率常数（rateconstant,k）所决定。

一级反应（first-orderreaction）:单底物反应

二级反应（second-orderreaction）：双底物反应

V仅依赖于一个底物浓度[S]；

V=k[S]

k的单位是秒1V依赖于两个底物浓度和反应速率常数V=k[S1][S2]

k的单位是Lmol1s1

二、酶的化学本质是蛋白质

（一）单纯酶仅含有氨基酸组分有些酶其分子结构仅由氨基酸残基组成，没有辅助因子。这类酶称为单纯酶（simpleenzyme）。如脲酶、一些蛋白酶、淀粉酶、酯酶和核糖核酸酶等。（二）结合酶既含有氨基酸组分又含有非氨基酸组分结合酶（conjugatedenzyme）是除了在其组成中含有由氨基酸组成的蛋白质部分外，还含有非蛋白质部分

蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)辅助因子(cofactor)

金属离子小分子有机化合物全酶(holoenzyme)决定反应的特异性及其催化机制

决定反应的性质和反应类型

辅助因子分类（按其与酶蛋白结合的紧密程度）

辅酶

(coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。

辅基

(prostheticgroup):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。一些化学稳定的小分子有机化合物是重要的辅酶或辅基。

辅酶在反应过程中可与多种酶蛋白结合，作为底物在不同的酶之间传递电子、质子或化学基团。辅基在反应中不能离开与其结合的酶蛋白。

辅酶或辅基缩写转移的基团所含的维生素尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶INAD+H+、电子尼克酰胺（维生素PP）尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶IINADP+H+、电子尼克酰胺（维生素PP）黄素腺嘌呤二核苷酸FAD氢原子维生素B2焦磷酸硫胺素TPP醛基维生素B1磷酸吡哆醛氨基维生素B6辅酶ACoASH酰基泛酸生物素二氧化碳

生物素四氢叶酸FH4一碳单位叶酸辅酶B12氢原子、烷基维生素B12小分子有机化合物辅酶（辅基）的种类与作用

金属离子的作用：①作为酶活性中心的组成部分参加催化反应，使底物与酶活性中心的必需基团形成正确的空间排列，有利于酶促反应的发生；②作为连接酶与底物的桥梁，形成三元复合物；③金属离子还可以中和电荷，减小静电斥力，有利于底物与酶的结合；④金属离子与酶的结合还可以稳定酶的空间构象，稳定酶的活性中心。金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。

金属激活酶(metal-activatedenzyme)金属离子为酶的活性所必需，却不与酶直接结合，而是通过底物相连接。

金属酶金属离子金属激活酶金属离子过氧化氢酶Fe2+丙酮酸激酶K+、Mg2+过氧化物酶Fe2+丙酮酸羧化酶Mn2+、Zn2+谷胱苷肽过氧化物酶Se2+蛋白激酶Mg2+、Mn2+己糖激酶Mg2+精氨酸酶Mn2+固氮酶Mo2+磷脂酶CCa2+核糖核苷酸还原酶Mn2+细胞色素氧化酶Cu2+羧基肽酶Zn2+脲酶Ni2+碳酸酐酶Zn2+柠檬酸合酶K+金属酶和金属激活酶

（三）单体酶仅含有一条肽链而寡聚酶含有两条或两条以上的肽链单体酶（monomericenzyme）

由一条多肽链组成，只具有三级结构的酶。

如核糖核酸酶、一些肠道蛋白水解酶、溶菌酶。

寡聚酶（oligomericenzyme）

由多条相同或不同的亚基组成的酶。

多酶复合物（multienzymecomplex），或称多酶体系（multienzymesystem）

由催化不同化学反应的多种酶组成的寡聚酶如：丙酮酸脱氢酶复合物

多功能酶（multifunctionalenzyme）或称串联酶（tandemenzyme）

多种催化功能融合于一条多肽链的酶

如：哺乳动物脂肪酸合成酶三、按酶所催化反应的类型将酶分为六大类（一）催化氧化还原反应的酶属于氧化还原酶类

氧化还原酶类（oxidoreductases）包括催化传递电子和氢、以及需氧参加反应的酶。例如，脱氢酶类、加氧酶类、过氧化物酶和过氧化氢酶等。

（二）催化分子间基团转移或交换的酶属于转移酶类转移酶类（transferases）包括将磷酸基从ATP转到另外底物的激酶、加无机磷酸使化学键断裂的磷酸化酶，以及糖基转移酶、转氨酶等。

（三）催化底物发生水解反应的酶属于水解酶类水解酶类（hydrolases）

按其所水解的底物不同

根据它们的作用部位

蛋白酶、酯酶、磷酸酶、糖苷酶、核酸酶

外切酶、内切酶

（四）催化从底物移去一个基团并形成双键的反应或其逆反应的酶属于裂合酶类

裂合酶或裂解酶类（lyases）是指催化一分子非水解地分裂成两个分子并留有双键，或相反的酶。

如：脱水酶、脱羧酶、醛缩酶。

合酶（synthases）

催化反应方向相反，一个底物去掉双键，并与另一底物结合形成一个分子的酶。（五）催化同分异构体相互转化的酶类属于异构酶类

异构酶类（isomerases）：催化分子内部基团的位置互变、几何或光学异构体互变、以及醛酮互变的酶类。

如：变位酶、表构酶、异构酶。（六）催化两种底物形成一种产物同时偶联有高能键的水解并释能的酶属于合成酶类DNA连接酶、氨基酰-tRNA合成酶、谷氨酰胺合成酶属于连接酶或合成酶类。合成酶类（synthetases）又称连接酶类（ligases）。四、酶可按其所催化的反应类型予以命名

（一）酶的系统命名法可反映出酶的多种信息但比较繁琐

习惯命名法，一般是按酶所催化的底物命名，在其底物英文名词上加后缀“ase”作为酶的名称。

如：蛋白酶（protease）、磷酸酶（phosphatase）

系统命名法根据酶所催化的整体反应，按酶的分类对酶命名，每个酶都有一个名称和一个编号。编号中4个数字中第1个数字是酶的分类号，第2个数字代表在此类中的亚类，第3个数字表示亚-亚类，第4个数字表示该酶在亚-亚类中的序号。

酶的分类系统名称编号催化的反应推荐名称1.氧化还原酶类(S)-乳酸：NAD+-氧化还原酶EC1.1.1.27(S)-乳酸+NAD+

丙酮酸+NADH+H+L-乳酸脱氢酶2.转移酶类L-丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶EC2.6.1.2L-丙氨酸+-酮戊二酸丙酮酸+L-谷氨酸丙氨酸转氨酶3.水解酶类1,4--D-葡聚糖-聚糖水解酶EC3.2.1.1水解含有3个以上1,4--D-葡萄糖基的多糖中1,4--D-葡糖苷键-淀粉酶4.裂合酶类D-果糖-1,6-二磷酸D-甘油醛-3-磷酸裂合酶EC4.1.2.13D-果糖-1,6-二磷酸磷酸二羟丙酮+D-甘油醛-3-磷酸果糖二磷酸醛缩酶5.异构酶类D-甘油醛-3-磷酸醛-酮-异构酶EC5.3.1.1D-甘油醛-3-磷酸磷酸二羟丙酮丙糖磷酸异构酶6.连接酶类L-谷氨酸：氨连接酶（生成ADP）EC6.3.1.2ATP+L-谷氨酸+NH3ADP+Pi+L-谷氨酰胺谷氨酸-氨连接酶

酶的分类与命名举例

（二）推荐名称简便而常用

由于系统名称较烦琐，国际酶学委员会还同时为每一个酶从常用的习惯名称中挑选出一个推荐名称（recommendedname）

系统名称

L-乳酸：NAD+氧化还原酶推荐名称

乳酸脱氢酶

五、同工酶催化相同的化学反应

（一）同工酶是催化相同化学反应而结构不同的一组酶

定义:同工酶(isoenzyme)是指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。同工酶主要由于基因倍增（duplication）和趋异（divergence）所致。HHHHHHHMHHMMHMMMMMMMLDH1

(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5

(M4)乳酸脱氢酶的同工酶*举例：乳酸脱氢酶(LDH1～

LDH5)（二）同工酶在生物体中的表达分布具有时空特异性

同工酶存在于同一种属的不同个体，同一个体的不同组织、同一细胞的不同亚细胞结构，以及同一组织、细胞的不同发育阶段。

LDH同工酶红细胞白细胞血清骨骼肌心肌肺肾肝脾LDH1

（H4）431227.10731443210LDH2

（H3M）444934.70243444425LDH3（H2M2）123320.95335121110LDH4

（HM3）1611.7160512720LDH5

（M4）005.7790120565人体各组织器官LDH同工酶谱（活性%）

（三）检测组织器官同工酶谱的变化有重要的临床意义

在代谢调节上起着重要的作用；用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征；同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断；同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化1酶活性心肌梗死酶谱正常酶谱肝病酶谱2345第二节酶的工作原理MechanismofEnzymaticReactions

、酶具有与一般催化剂相似的工作原理（一）酶与一般催化剂一样能降低反应的活化能1．活化能是化学反应的能障

活化能：指在一定温度下一摩尔底物（substrate）从低自由能的初始态转变成能量较高的过渡态所需要的自由能，即过渡态中间产物比基态底物高出的那部分能量。酶和一般催化剂加速反应的机制都是降低反应的活化能(activationenergy)。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。反应总能量改变

非催化反应活化能

酶促反应活化能

一般催化剂催化反应的活化能

能量

反应过程

底物产物

酶促反应活化能的改变

结合能2．活化能的降低可使反应速率呈指数上升

化学反应速率与自由能变化的关系

d[S]kBT

V=

=[S]e

G*/RTdth[S]代表底物（substrate）浓度kB是玻尔茨曼常数（Boltzmannconstant）（1.3811023JK-1）h是普朗克常数（Planckconstant）（6.6261034J.s）G*代表反应的活化能

在标准状态下反应活化能降低1倍，反应速率可提高约5000倍，呈现指数上升一般讲，酶的催化效率比非催化反应高1051017倍

（二）酶与一般催化剂一样能加速化学反应而不改变反应的平衡点酶与一般催化剂一样，只能加快反应速率，使其缩短到达反应平衡的时间，而不能改变反应的平衡点。

反应达到平衡时自由能的变化仅取决于底物与产物的自由能之差。

任何催化剂都不能改变底物和产物自身的自由能。

二、酶具有不同于一般催化剂的显著特点

酶的催化效率通常比无催化剂时的自发反应高108~1020倍，比一般无机催化剂高107~1013倍。（一）酶对底物具有极高的催化效率酶与一般催化剂催化效率的比较底物催化剂反应温度（℃）速度常数苯酰胺H+522.4×10-6OH-538.5×10-6α-胰凝乳蛋白酶2514.9尿素H+627.4×10-7脲酶215.0×106H2O2Fe2+5622过氧化氢酶223.5×107酶的特异性或专一性（specificity）

酶对其所催化的底物和反应类型具有严格的选择性，一种酶只作用于一种化合物，或一类化学键，催化一定的化学反应并产生一定结构的产物的现象。

（二）酶对底物具有高度的特异性或专一性1.有的酶对其底物具有极其严格的绝对专一性

有的酶仅对一种特定结构的底物起催化作用，产生具有特定结构的产物。酶对底物的这种极其严格的选择性称为绝对特异性（absolutespecificity）。

脲酶仅水解尿素，对甲基尿素则无反应。

2.多数酶对其底物具有相对特异性

多数酶可对一类化合物或一种化学键起催化作用，这种对底物分子不太严格的选择性称为相对特异性（relativespecificity）。

脂肪酶不仅水解脂肪，也可水解简单的酯。

胰蛋白酶水解由碱性氨基酸（精氨酸和赖氨酸）的羧基所形成的肽键。

各种蛋白酶对肽键的专一性

人体内有多种蛋白激酶，它们均催化底物蛋白质丝氨酸（或苏氨酸）残基上羟基的磷酸化

蛋白激酶共有序列蛋白激酶A-X-R-(R/K)-X-(S/T)-X-蛋白激酶C-X-(R/K1-3,X0-2)-(S/T)-(X0-2,R/K1-3)-X蛋白激酶G-X-(R/K)2-3-X-(S/T)-X-Ca2+/钙调素蛋白激酶Ⅱ-X-R-X-X-(S/T)-X-3.有些酶对其底物表现出立体异构专一性酶对空间构型所具有的特异性要求称为空间异构特异性（stereospecificity）

延胡索酸酶仅对延胡索酸(反丁烯二酸)起催化作用，将其加水生成苹果酸，对顺丁烯二酸则无作用

乳酸脱氢酶仅催化L-乳酸脱氢生成丙酮酸，而对D-乳酸无作用。三、酶活性中心是酶与底物结合并将底物转化为产物的特定部位或称活性部位(activesite)，指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构、能与底物特异结合并将底物转化为产物的区域。酶的活性中心(activecenter)（一）酶分子上的必需基团与酶的活性密切相关

溶菌酶的活性中心

101Asp和108Trp是底物（N-乙酰氨基葡糖环）结合基团35Glu52Asp催化D环糖苷键的断裂酶的活性中心由许多必需基团组成

必需基团(essentialgroup)酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，与酶活性密切相关的化学基团。常见的必需基团

丝氨酸残基的羟基组氨酸残基的咪唑基半胱氨酸残基的巯基酸性氨基酸残基的羧基

活性中心内的必需基团结合基团(bindinggroup)与底物相结合催化基团(catalyticgroup)催化底物转变成产物位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。活性中心外的必需基团底物活性中心以外的必需基团结合基团催化基团活性中心目录组成酶活性中心的必需基团在一级结构上可能相距很远，但在形成三级结构时相互接近，形成具有三维结构的区域，且多是酶分子中的裂隙或凹陷所形成的疏水口袋。

（二）酶的活性中心的构象有利于酶与底物结合及催化反应胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶活性中心“口袋”

酶的活性中心对底物具有高度的特异性

酶活性中心与底物结合时，发生构象改变，相互诱导契合，增加与底物的互补性

大多数情况下底物与酶活性中心最初的结合是非共价性的

氢键离子键疏水键vanderWaals力

酶与底物结合的力（一）酶与底物之间的相互作用表现有多种效应1．酶与底物结合时相互诱导发生构象改变

诱导契合假说（induced-fithypothesis）

酶-底物复合物

E+SE+PES

酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶-底物结合的诱导契合假说。四、酶对底物具有多种催化机制

羧肽酶的诱导契合模式底物2．形成酶-底物过渡态复合物过程中释放结合能

底物与酶的活性中心相互诱导契合形成过渡态化合物，过渡态与酶的活性中心以次级键(氢键、离子键、疏水键)相结合，这一过程是释能反应，所释放的能量称为结合能(binding

energy)。结合能可以抵消一部分活化能，是酶反应降低活化能的主要能量来源。酶不能使底物形成过渡态，则没有结合能的释放，也就不能催化反应的进行。3．邻近效应和定向排列有利于底物形成过渡态邻近效应（proximityeffect）和定向排列（orientationarrange）将分子间的反应变成类似分子内的反应，使反应速率显著提高。

底物B底物A酶酶-底物复合物在疏水环境中进行酶反应有很大的优越性，此现象称为表面效应（surfaceeffect）。

酶的活性中心多位于其分子内部的疏水“口袋”中，酶反应在酶分子内部的疏水环境中进行。疏水环境可使底物分子脱溶剂化（desolvation），排除周围大量水分子对酶和底物分子中功能基团的干扰性吸引或排斥，防止二者之间形成水化膜，利于底物和酶分子之间的直接密切接触和相互结合。

4.表面效应有利于底物和酶的接触与结合

（二）酶对底物呈现多元催化酶是两性解离的蛋白质，酶活性中心上有些基团是质子供体（酸），有些是质子接受体（碱）。

这些基团在酶活性中心的准确定位有利于质子的转移，这种一般酸-碱催化（generalacid-basecatalysis）可以使反应速率提高102105倍。

质子转移反应都包含一般酶-碱催化反应

氨基酸残基

酸（质子供体）碱（质子接受体）谷氨酸、天冬氨酸RCOOHRCOO赖氨酸、精氨酸半胱氨酸RSHRS组氨酸丝氨酸ROHRO酪氨酸RNHHH+RNH2..CHNHHNCCHR+CHN：HNCCHROHRO-R酶分子中具有酸-碱催化作用的基团

酶可与底物形成瞬时共价键

很多酶在催化过程中，与底物形成瞬时共价键，底物与酶形成共价键后被激活，并很容易进一步水解形成产物和游离的酶。这种催化机制称为共价催化（covalentcatalysis）。

AB+E：

AE+BH2OAEA+E：+B

酶举例亲核基团共价结合中间产物丝氨酸蛋白酶丝氨酸OH酰基酶巯基酶半胱氨酸SH酰基酶ATP酶天冬氨酸COO磷酰基酶含吡哆醛的酶赖氨酸NH2Schiff碱磷酸甘油酸变位酶组氨酸磷酰基酶谷氨酰胺合成酶酪氨酸OH腺嘌呤酶酶的亲核基团与底物共价结合

酶可通过亲核催化或亲电子催化加速反应

酶活性中心有的催化基团属于亲核基团，可以提供电子给带有部分正电荷的过渡态底物，形成瞬间共价键。这种催化作用称为亲核催化（nucleophiliccatalysis）。

亲电子催化（electrophiliccatalysis）可使酶活性中心的阳离子亲电子基团与富含电子的底物形成共价键。

胰凝乳蛋白酶的亲核催化、共价催化和酸-碱催化机制

第三节酶促反应动力学TheKineticsofEnzymaticReactions

概念研究各种因素对酶促反应速率的影响，并加以定量的阐述。影响因素包括有酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。※研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。单底物、单产物反应；酶促反应速率（velocity，V）一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示；反应速率取其初速率，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速率；底物浓度远远大于酶浓度。研究前提一、采用酶促反应初速率来研究酶促反应动力学（一）酶活性是指酶催化化学反应的能力衡量酶活性的尺度是酶促反应速率的大小。酶促反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示。由于底物的消耗量不易测定，所以实际工作中经常是测定单位时间内产物的生成量。酶的活性:以国际单位（internationalunit,IU）表示。在规定的实验条件下（如温度、pH的限定和足够的底物浓度等），每分钟催化1mol底物转变成产物所需要的酶量为1个国际单位（IU）。

催量（Katal）

1IU＝16.67×10－9Kat

1催量是指在特定条件下，每秒钟将1mol底物转化成产物所需的酶量

比活性（specificactivity）：比较酶的纯度

比活性单位是每mg蛋白质所含酶的国际单位数，其单位是IUmg1蛋白（二）酶促反应初速率是反应刚刚开始时测得的反应速率酶促反应初速率是指反应刚刚开始，各种影响因素尚未发挥作用时的酶促反应速率，即反应时间进程曲线为直线部分时的反应速率。（三）有三类方法可用来测定底物或产物的变化量1．直接测定法是对底物或产物量的变化进行直接检测有些酶促反应可在反应进行一定时间后，不用任何辅助反应便可直接测定反应液中底物或产物的浓度。这类测定方法称为直接测定法（directassay）。

还原型（Fe2+）细胞色素c在波长550nm处有明显的吸收峰，而氧化型（Fe3+）则无；细胞色素C氧化酶对细胞色素C的氧化反应，可以直接在波长550nm处检测一定时间内还原型细胞色素C的减少过程。有些酶促反应的底物和产物不能直接进行检测，必须增加一些辅助试剂来达到检测的目的，这种方法称为间接测定法（indirectassay）

2．间接测定法利用非酶辅助反应对底物或产物量的变化进行间接检测

3．酶偶联测定法是间接反映初始反应的底物或产物量的变化量

许多酶促反应的底物和产物虽然不能直接检测，但可以与另外的酶反应相偶联，偶联的酶以第一个酶的产物为底物，或以此类推，以最后的酶反应产物可以直接检测为目的。这种通过偶联其他酶并对此酶促产物进行直接检测，间接地反映待测酶反应的底物或产物变化量的方法称为酶偶联测定法（enzymecoupledassay）

外加的酶称为工具酶或辅助酶（auxiliaryenzyme）

产物可直接检测的酶称为指示酶（indicatorenzyme）

丙氨酸转氨酶丙氨酸+-酮戊二酸

丙酮酸+谷氨酸乳酸脱氢酶丙酮酸+NADH+H+

乳酸+NAD+

（在340nm处有吸收峰）（在340nm处无吸收峰）二、酶促反应速率受底物浓度的影响（一）酶促反应速率对底物浓度作图呈矩形双曲线

在酶浓度和其他反应条件不变的情况下，反应速率V对底物浓度[S]作图呈矩形双曲线。

当底物浓度较低时反应速率与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax目录a随着底物浓度的增高反应速率不再成正比例加速；反应为混合级反应。[S]VVmax目录b当底物浓度高达一定程度酶被底物所饱和，反应速率不再增加，达最大速率；反应为零级反应。[S]VVmax目录c（二）反应速率与底物浓度的关系可用米-曼氏方程式表示

1．米-曼氏方程定量地描述底物浓度与反应速率的关系中间产物

酶促反应模式——中间产物学说E+S

k1k2k3ESE+P中间产物

酶促反应模式——中间产物学说E+S

k1k2k3ESE+P※1913年Michaelis和Menten提出反应速率与底物浓度关系的数学方程式，即米-曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelisequation)。[S]：单底物底物浓度V：不同[S]时的反应速率Vmax：最大反应速率(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]

Km+[S]＝──[S]：单底物底物浓度V：不同[S]时的反应速率Vmax：最大反应速率(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]

Km+[S]＝──当底物浓度很低时候，[S]可以忽略不计，反应为一级反应当底物浓度很高的时候Km可以忽略不计，反应为零级反应Km＝[S]∴Km值等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2（三）动力学参数可用来比较酶促反应的动力学性质

1．Km值等于即刻反应速率达到Vmax一半时的底物浓度

2．Km是酶的特征性常数

在酶的结构、溶液pH、温度等条件不变的情况下，酶促反应底物的Km不因反应中酶浓度的改变而不同。

同一酶对其所催化的不同底物有不同的Km；不同酶对同一底物也有其各自的Km

。Km的范围多在10-6～10-2mol/L之间。

6.0103己-N-乙酰氨基葡萄糖溶菌酶2.5102H2O2过氧化氢酶4.0103D-乳糖-半乳糖苷酶2.5103N-苯甲酰酪氨酰胺1.08101甘氨酰酪氨酰甘氨酸胰凝乳蛋白酶2.6102HCO3碳酸酐酶1.5103D-果糖5105D-葡萄糖4104ATP己糖激酶（脑）

Km（mol/L）

底物

酶

一些酶的底物的Km

3．Km在一定条件下可表示酶对底物的亲和力

k1Km

=k2

+

k3当k3<<k2时，Km

k2/k1。即相当于ES分解为E+S的解离常数（dissociationconstant,Ks）。此时，Km代表酶对底物的亲和力。

Km越大，表示酶对底物的亲和力越小；Km越小，表示酶对底物的亲和力越大。

4．Vmax是酶被底物完全饱和时的反应速率

当所有的酶均与底物形成ES时（即[ES]=[Et]），反应速率达到最大。即Vmax=k3[Et]。

5．kcat代表酶的转换数

kcat=Vmax/[Et]

kcat表示酶被底物完全饱和时，单位时间内每个酶分子（或活性中心）催化底物转变成产物的分子数。

kcat也称为酶的转换数(turnovernumber)，单位是s1

。多数酶的转换数在1104s1之间

酶底物转换数（s1）过氧化氢酶H2O240000000碳酸酐酶HCO3400000乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱14000-内酰胺酶苄青霉素2000延胡索酸酶延胡索酸800RecA蛋白ATP0.4一些酶的转换数

6．在低底物浓度时，kcat/Km代表酶的催化效率

[Et][S]KmV

=kcat当[S]<<Km时

kcat/Km是此二级反应的速率常数，也称特异性常数，其单位是L/(mol·

S)

。反应速率的大小取决于E和S由于相互渗透而相互碰撞的速率。.这种被渗透控制的碰撞速率(diffusion-controlledrateofencounter，DCRE)的上限是108L/(mol·

S)

。kcat/Km越接近此数据，酶的催化效率越高。

酶kcat/Km[L/(mol·

S)]

乙酰胆碱酯酶1.6108碳酸酐酶8.3107过氧化氢酶4107巴豆酸酶2.8108延胡索酸酶1.6108磷酸丙糖异构酶2.4108-内酰胺酶1108超氧化物歧化酶7109

一些kcat/Km值接近DCRE的酶

（四）采用作图法可求得酶促反应的动力学参数

1．林-贝氏作图法是求得

Vmax和Km的最常用方法

林-贝氏方程式（Lineweaver-Burkequation）

将米氏方程式两边取倒数，并加以整理，则得出米氏方程式的双倒数形式：V1=KmVmax[S]1+Vmax1直线在纵轴的截距等于1/Vmax，而在横轴上的截距为1/Km

2．其他一些作图法也可较准确地求得Vmax和Km

海涅斯-沃尔弗作图法（Hanes-Wolffplot）

双倒数方程式两边同时乘以[S]

[S]V=KmVmax[S]+Vmax1直线的斜率等于1/Vmax，横轴截距为-Km

伊迪-霍夫斯蒂作图法（Eadie-Hofsteeplot）

米氏方程式两边均除以[S]

V=[S]VmaxKmV直线的斜率为-Km，直线的纵轴截距为Vmax

三、在一定条件下酶促反应速率与酶浓度呈正相关

当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速率与酶浓度成正比关系式为：V=k3[E]A：底物浓度曲线，其中，[E]1>[E]2>[E]3。从图中可知，[E]的变化不影响酶促反应的Km。

B：反应速率对酶浓度作图，V与[E]呈直线关系。

四、酶促反应速率受反应系统温度的双重影响

双重影响温度升高，酶促反应速率升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速率降低。最适温度(optimum

temperature)酶促反应速率最快时的环境温度。哺乳动物组织中酶的最适温度多在35～40℃之间

TaqDNA聚合酶最适温度为72℃

*低温的应用一般的酶在低温下活性降低，但酶本身不被破坏，其活性可随温度的回升而恢复

低温保存酶和菌种等生物制品

低温麻醉

五、酶促反应速率受反应体系pH的影响

最适pH(optimumpH)酶催化活性最大时的环境pH。体内酶的最适pH多在6.5～8之间。

胃蛋白酶的最适pH为1.8

精氨酸酶的最适pH为9.8

pH对几种酶活性的影响

六、激活剂可加速酶促反应速率

酶的激活剂（activator）

使酶从无活性变为有活性或使酶活性增加的物质

必需激活剂（essentialactivator）为酶促反应所必需，如缺乏则测不到酶的活性

Mg2+为己糖激酶的必需激活剂

非必需激活剂（non-essentialactivator）可以提高酶的催化活性，但不是必需的

Cl-对唾液淀粉酶的激活作用

在酶促反应中，凡能与酶结合而使酶的催化活性下降或消失，但又不引起酶变性的物质称为酶的抑制剂（inhibitor，I）。七、抑制剂对酶活性可表现出可逆或不可逆性抑制作用

抑制剂可与酶活性中心内或活性中心外的必需基团结合，从而抑制酶的活性。

根据抑制剂与酶是否共价结合及抑制效果的不同，将抑制剂对酶的抑制作用分为可逆性抑制剂（reversibleinhibitor）和不可性逆抑制剂（irreversibleinhibitor）。可逆性抑制剂

一类抑制剂与酶的调节部位结合，使酶发生变构，从而对酶发挥抑制作用（别构抑制作用）。

一类抑制剂通过与游离酶或/和酶-底物复合物可逆地结合而影响酶的催化活性。

k1k2k3+kiEII+S+ESESE+PESI+Iki'可逆性抑制作用的抑制剂可以与游离酶结合，形成二元复合物EI；也可以与ES结合，形成三元复合物ESI。

（一）可逆性抑制剂与酶非共价结合

1．竞争性抑制剂与底物竞争酶的活性中心

定义：抑制剂与底物的结构相似或部分相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶-底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。

+++EESIESEIEP有竞争性抑制剂存在的米氏方程式

V

=Vmax[S]Km+

[S](1

+[I]ki)双倒数方程式是

VmaxKm[S]V1=1Vmax1+(1

+[I]ki)反应模式+E+SESE+PIEIkik1k2k3SI竞争性抑制作用V对[S]的双倒数作图

*特点抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及底物浓度；I与S结构类似，或部分相似，竞争酶的活性中心；动力学特点：Vmax不变，表观Km增大。[I]1V1[S]0Km1Km1(1+)[I]kiVmax1--*举例

丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶琥珀酸琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸磺胺类药物的抑菌机制与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶二氢蝶呤啶＋对氨基苯甲酸＋谷氨酸二氢叶酸合成酶二氢叶酸2．非竞争性抑制剂不影响酶对底物的亲和力

+

S－S+

S－S+ESIEIEESEPk1k2k3+kiEII+ESESE+P+Iki+SESI*反应模式非竞争性抑制剂与酶活性中心外的某个部位结合，表现为非竞争性抑制作用（non-competitiveinhibition）。非竞争性抑制的米氏方程式的双倒数形式

VmaxKm[S]V1=1Vmax1+(1

+[I]ki)(1

+[I]ki)*特点抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系；抑制程度取决于抑制剂的浓度；动力学特点：Vmax降低，表观Km不变。[I]1V1[S]Km1(1+)[I]kiVmax1Vmax0非竞争性抑制作用V对[S]的双倒数作图

3．反竞争性抑制剂只与酶-底物复合物结合

++ESESESIEPk1k2k3+ESESE+P+IkiESI*反应模式反竞争性抑制作用的米氏方程式的双倒数形式

VmaxKm[S]V1=1Vmax1+(1

+[I]ki)[I]1V1[S]Km1(1+)[I]kiVmax1Vmax0(1+)[I]kiKm反竞争性抑制作用V对[S]的双倒数作图

*特点：抑制剂只与酶-底物复合物结合；抑制程度取决于抑制剂的浓度及底物的浓度；动力学特点：Vmax降低，表观Km降低。各种可逆性抑制作用的比较（二）不可逆性抑制剂与酶共价结合不可逆性抑制作用的抑制剂

基团特异性抑制剂（group-specificinhibitor）底物类似物（substrateanalog）自杀性抑制剂（suicideinhibitor）

1．基团特异性抑制剂与酶分子中特异的基团共价结合

一些酶活性中心的催化基团是丝氨酸残基上的羟基，这些酶称为羟基酶。

如胆碱酯酶和丝氨酸蛋白酶

有机磷化合物羟基酶失活的酶酸CH3CHN+HONROPR'OOOE+NROPR'OOOCHCH3N++EOH

解磷定失活的酶有机磷-解磷定复合物活化的酶

半胱氨酸残基上的巯基是许多酶的必需基团。低浓度的重金属离子(Hg2+、Ag2+、Pb2+等)及As3+等可与巯基酶分子中的巯基结合，使酶失活。

路易士气巯基酶失活的酶酸失活的酶BAL巯基酶BAL与砷剂结合物2．底物类似物可共价地修饰酶的活性中心

与基团特异性抑制剂不同，底物类似物与底物的结构相似，可特异地与酶的活性中心共价结合，不可逆地抑制酶的活性。此类抑制剂可作为亲和标记物，用来定性酶活性中心的功能基团。

TPCK对胰凝乳蛋白酶活性中心组氨酸咪唑环的亲和标记

酶的自杀性抑制剂可以作为酶的底物与酶活性中心相结合，生成酶-底物复合物，并接受酶的催化作用。然而，经催化后的中间产物不游离出产物，而是转化为酶的抑制剂，进一步与酶活性中心共价结合，对酶产生抑制作用。

E+SESE·IE-I

3．自杀性抑制剂是经过修饰的酶的底物+

酶-底物复合物无活性酶中被修饰的FAD

N，N-二甲基丙炔酰胺自杀性抑制剂N,N-二甲基丙炔酰胺在被单胺氧化酶氧化后，由于填加1个质子，使之与酶的辅基FAD结合生成稳定的烷化物，从而酶被抑制。单胺氧化酶通过其辅基FAD氧化N,N-二甲基丙炔酰胺(N,N-dimethylpropargylamine)：

第四节酶活性的调节RegulationofEnzymeActivities

调节酶（regulatoryenzyme）

对环境因素的作用表现出催化活性增高或降低、或酶量的增多或减少，进而能影响和调整反应途径反应速率的酶。

机体通过改变调节酶的活性或诱导、阻遏酶的生物合成，可实现细胞代谢水平的调节；物质代谢的整体调节和激素水平的调节最终也都是通过影响酶促反应速率实现的。

一、调节酶的活性可受别构效应剂的调节（一）别构效应剂与别构酶结合引发酶的构象改变别构调节(allostericregulation)一些代谢物可与某些酶分子活性中心外的某部分可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称别构调节。别构酶（allostericenzyme）：能发生别构效应的酶别构效应剂（allostericeffector）：能引起酶发生构象改变的化合物调节部位（regulatorysite）：别构效应剂与酶结合的部位别构酶也有两种构象形式，紧缩态(tensestate,Tstate)和松弛态(relaxedstate,Rstate)。T态和R态对底物的亲和力或催化活性不同，别构效应剂就是通过引起酶R态与T态的互变，改变酶的催化速率。

（二）别构效应剂可引起别构酶分子中各亚基间的协同作用

亚基的构象改变可以相互影响，发生协同效应。（cooperativity）

正协同效应（positivecooperativity）

后续亚基的构象改变增加其对别构效应剂的亲和力，使效应剂与酶的结合越来越容易。

负协同效应（negativecooperativity）

后续亚基的构象改变降低酶对别构效应剂的亲和力，使效应剂与酶的结合越来越难。同种协同效应（homotropiccooperativity）

别构效应剂引起的构象改变增加或降低后续亚基对同种别构效应剂的亲和力。

异种协同效应（heterotropiccooperativity）

别构效应剂引起的构象改变增加或降低后续亚基对他种别构效应剂的亲和力。

别构效应剂引起的构象改变增加酶对底物的亲和力，这种现象（属于异种正协同效应）称为别构激活作用（allostericactivation）。此别构效应剂称为别构激活剂（allostericactivator）

引起酶对底物亲和力降低的现象（属于异种负协同效应）称为别构抑制作用（allostericinhibition）。此别构效应剂称为别构抑制剂（allostericinhibitor）（三）别构酶的动力学不遵守米-曼氏方程

正协同效应的底物浓度-反应速率曲线为S形曲线

负协同效应的底物-速率曲线外形类似矩形双曲线，但不是矩形双曲线

二、一些调节酶可在催化方向相反的两种酶的作用下发生共价修饰

（一）磷酸化与去磷酸化是最常见的共价修饰方式

共价修饰(covalentmodification)或化学修饰(chemicalmodification)

酶分子中的某些基团可在其他酶的催化下，共价结合某些化学基团；同时又可在另一种酶的催化下，将此结合上的化学基团去掉，从而影响酶的活性。

酶的共价修饰种类：

1.磷酸化（phosphorylation）和去磷酸化（dephosphorylation）

2.甲基化（methylation）和去甲基化（demethylation）

3.腺苷化（adenylation）和去腺苷化（deadenylation）

4.尿苷化(uridylation)

和去尿苷化（deuridylation）

磷酸化和去磷酸化修饰是最常见的共价修饰

酶的磷酸化与脱磷酸化-OHThrSerTyr酶蛋白H2OPi磷蛋白磷酸酶ATPADP蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-酶蛋白（二）共价修饰可引起级联放大效应

在一个连锁反应中，一个酶被磷酸化或去磷酸化激活后，后续的其他酶可同样的依次被其上游的酶共价修饰而激活，引起原始信号的放大，这种多重共价修饰的连锁反应称为级联反应（cascadereaction）。

级联反应的主要作用是产生快速、高效的放大效应。

三、酶原需经激活后才具有催化活性酶原(zymogen)有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。酶原的激活在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。

酶原激活的原理酶原分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心

一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽在特定条件下赖缬天天天天甘异赖缬天天天天缬组丝SSSS46183甘异缬组丝SSSS肠激酶胰蛋白酶活性中心胰蛋白酶原的激活过程酶原激活因子激活途径胃蛋白酶原H+或胃蛋白酶胃蛋白酶+六肽胰蛋白酶原肠激酶、胰蛋白酶胰蛋白酶+六肽胰凝乳蛋白酶原胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶+2个二肽弹性蛋白酶原胰蛋白酶弹性蛋白酶+几个肽段羧基肽酶原胰蛋白酶羧基肽酶+几个肽段消化蛋白酶原的激活

酶原激活的生理意义避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。第五节酶与医学