《实验动物学课件》word版

/第一章实验动物学概述一、实验动物科学的概念和研究范畴二、实验动物科学的诞生三、中国现代实验动物学的诞生四、实验动物科学应用范畴五、动物实验研究的现状及发展趋势六、动物实验研究的优越性和欠缺一、实验动物科学的概念和研究范畴（一）、实验动物科学的基本概念1、实验动物科学（LaboratoryAnimalScience)是一门研究实验动物及其培育和应用的学科，是生命科学的一个分支。它是现代科学技术的重要组成部分，是生命科学研究的基础条件，是衡量一个国家或一个地区科研水平的重要标志。2、实验动物：指经人工饲育的，对其携带的微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检定的动物。特点：生物学特性明确、遗传背景清楚、表型均一、对刺激敏感和反应一致等3、实验用动物：指能够用于科学实验的所有动物。（哺乳类、鱼类、两栖类、爬行类的蛇、昆虫类的果蝇等。它们不具有实验动物的特点、又达不到生产和检定所要求的那样精良。）二）、实验动物科学研究的范畴1、实验动物育种学：主要研究实验动物的遗传改良、遗传控制、新型实验动物的开发和野生动物的实验动物化。2、实验动物医学：研究实验动物的疾病诊断、治疗和预防。3、实验动物生态学：研究如何为实验动物提供适于生存的环境条件，使实验动物健康无病，生理指标稳定。4、比较医学：研究包括人体在内的所有实验动物的基本生命现象，并将各种正常构造和生理机能，以及疾病的发生发展的规律进行比较，研究人与其他动物的相同点与不同点，从而揭示生命的奥秘。5、动物实验技术：研究动物实验的设计、选择试验方法、选择恰当的实验动物等，也包括胚胎工程学、细胞工程学等动物实验技术。二、实验动物科学的诞生1、公元前4世纪至公元3世纪公元前4世纪，杰出的生物学奠基人Aristotle首先开展了多种动物解剖，但都是在死亡的动物和人尸体上进行的。Erasistratus可能是进行活体动物实验的创始人，他在猪体内确定了气管是吐纳空气的通道，肺是呼吸空气的器官。之后，Galen对猪、猴及其他多种动物都施行了活体解剖检查，以此推论人体的生理功能。2、公元3世纪至16世纪初从Galen之后，直到16世纪初，科学发展被教条主义所取代。动物实验技术的发展受到的影响尤为严重。当时即使是对死亡的动物和人的尸体施行解剖，也会被基督教会所禁止。他们阻止人们获取有关认识世界的知识，否则就被认为亵渎神明的行为。3、16世纪初至19世纪末这一时期是动物实验技术方法发展得辉煌时期。1538年，现代解剖学奠基人AndreasVesal利用犬和猪进行了公开的解剖学示范教学。1682年，WilliamHarvey采用20多种动物进行解剖与生理研究，揭开了血液循环的秘密，使生理学成为了一门学科。1796年，EdwardJenner研究牛痘疫苗，征服了天花，并开辟了免疫疗法。1859年，CDarwin发表了《动物起源》奠定了进化论和比较医学的基础，从而为通过动物来研究人提供给了理论基础。1865年，ClandBernard做了大量的动物实验，在其发表的《实验动物序说》中详细阐述了实验动物和动物实验的理论。1882年，RobertCoch对牛羊等动物研究，发现了结核菌和结核菌素，并研制了狂犬疫苗，奠定了微生物学和传染病学基础。后来Lister受到Coch启发，创立了无菌手术理论。1885年，Nuttall培育了无菌豚鼠。1890年，Behring用豚鼠进行实验，研制出白喉抗毒素。1897年，Baflof用狗做了大量实验，在消化生理和高级神经活动的研究中取得了巨大成就。4、20世纪初至今20世纪初，孟德尔遗传学定律发现以后，动物实验技术方法的发展进入了突飞猛进的时期。1909年，Little培育出第一株近交小鼠。1910年，Morgan用果蝇发现了染色体在遗传上的作用。1914年，山极和市川用沥青抹兔耳，诱发出皮肤癌。1929年，Fleming通过动物实验发现了青霉素。1937年，Krebs发现了三羧酸循环。1944年，美国纽约科学院召开会议，专门讨论实验动物与医学发展的关系，提出实验动物标准化势在必行。1947年，英国成立了实验动物管理署。1950年，美国成立了实验动物管理小组。1952年，日本成立了实验动物中央研究所。1953年，Crick提出DNA的双螺旋结构。1956年，联合国创立国际实验动物科学委员会（InternationalCouncilLaboratoryAnimalScienceICLAS)ICLAS的成立是实验动物学成为独立学科的标志，也是实验动物走向现代化的起点。故一般认为实验动物学是20世纪50年代诞生的。上个世纪80年代以来，通过实验动物与动物实验研究获得三次诺贝尔医学奖：（1）、1980年度诺贝尔医学奖：GeorgeSnell的组织相容性基因的发现；（2）、1984年度诺贝尔医学奖：G.Kohler和C.Milstein单克隆抗体的发现；（3）、1996年度诺贝尔医学奖：Koherty和ZinkermagelT淋巴细胞识别微生物的发现三、中国现代实验动物学的诞生1918年，中央防疫处从国外引进小鼠、豚鼠进行饲养、并进行动物实验。1919年，谢恩增医师等扑捉野生地鼠（后来公认为中国地鼠）作肺炎双球菌检定。1946年，从印度引进小白鼠，后繁育成昆明小鼠。1948年，蓝春霖教授从美国引进金黄地鼠。1949年，新中国成立，北京、上海、长春、兰州、成都成立了生物制品研究所，从此开始了大量饲养实验动物。1966年—1977年，文化大革命动乱使实验动物事业遭受严重的摧残。1982年，文革结束后，确立了改革开放的方针，经学者到国外考察实验动物情况，发现我国已落后20~30年。国家科委在云南西双版纳召开了第一次实验动物工作会议，我国实验动物现代化研究拉开了序幕。1983年，钟品仁主编的《哺乳类实验动物》出版，为我国实验动物学第一部专著。1985年，京沪两地实行实验动物合格证制度，推动了实验动物的标准化。1985年，国际小鼠命名委员会正式承认我国培育的TA1、TA2、615近交系小鼠。1988年，我国加入国际实验动物科学委员会并出版了《中国实验动物学杂志》。1988年，国家科委发布2号令即《实验动物管理条例》，为我国第一部有关实验动物的法律。四、实验动物科学应用范畴1、生命科学方面基础医学理论，疾病的病因、治疗和预防的研究；新的治疗方法、新的检查和治疗仪器的研制；分子生物学研究；基因工程研究；老年学研究；生育控制研究等。2、药学方面药理学的研究；新药开发研究；诊断用血清、疫苗、免疫血清的整理；药品的安全性评价试验；药效试验等。3、化工业和环境保护方面职业性中毒的预防研究；食品及食品添加剂的安全性评价；服装、面料、皮毛、化纤的安全性评价；化妆品、卫生纸等的安全性评价；环境条件的检测和评价等。4、重工业方面废水、废物、废气等公害的鉴定和防治；光辐射、噪声的有害性的鉴定和污染的防治等。5、农业科学方面化学肥料、农药的残毒的检测；新品种安全性检测等。6、畜牧科学方面家畜疾病的病因学诊断、治疗和预防研究；疫苗的制造和鉴定；新品种的培育研究；SPF蛋的生产和使用研究；饲料的营养学、安全性分析和鉴定。7、军事科学方面如武器杀伤效果、化学、辐射、生物激光等武器的防护研究等。8、航天科学方面如宇宙射线、失重状态等对生物的影响及航天医学的研究等。9、国际贸易方面如疯牛病、口蹄疫等不合格肉类及食品的化学残毒等都需实验动物检疫和检测。10、行为科学方面如灾难事故的处理、汽车撞击的耐受度、建筑物耐受震动的允许度的检测等。五、动物实验研究的现状及发展趋势（一）、动物实验研究的现状1、国外动物实验方面的现状在美国，每年用于实验动物研究的非人灵长类动物、犬、豚鼠、兔、地鼠和其他动物（大、小鼠和禽鸟类除外）约150~200万只。大鼠、小鼠和禽鸟类，估计每年用1700万只动物。非人灵长类动物的使用基本上保持恒定，猫和犬的使用数量正在下降，逐渐被猪、小牛和其他家畜所取代。在加拿大，所使用的动物数量每年月200万只左右徘徊。在许多领域，特别是毒理学方面，鱼已取代哺乳动物。在英国，医学上每年使用的实验动物数量约263万只。在荷兰，每年使用实验动物约100万只左右。2、我国动物实验研究方面的概况（1）、80年代前的情况：80年代前，我国实验动物的饲养管理水平很低，动物实验发展水平也较低，没有法规和标准。（2）、80年代的情况：1982年国务院责成国家科委负责实验动物科技工作，启动了我国是实验动物与动物实验科技领域现代化工作进程。1988年11月14日经国务院批准由原国家科委颁布第2号令，即《实验动物管理条例》，条例对推动我国实验动物科学事业的发展，确保实验动物的质量起了重要作用。（3）、90年代的情况：1994年1月由国家技术监督局发布施行实验动物管理的国家标准，为我国实验动物标准化工作开创了新局面。随着实验动物质量逐步标准化，科学研究水平明显提高。（4）、目前的现状：据国家科技部统计，实验动物生产使用单位有2100多家，工作人员近9500余人，其中专业技术人员占39.5%，已形成地区性生产基地。年生产各类实验动物约1321万余只，并已开始向生产规模化、供应社会化方向发展。年使用动物1045万余只，动物实验也在向技术服务社会化方向迈进。3、我国动物实验研究方面存在的问题（1）、研究人员缺乏必要的动物实验知识和训练。（2）、用于实验的动物种系少。（3）、用于实验的动物质量和笼器具质量差。（4）、动物使用率低。（5）、动物实验方面技术人员缺乏，国际交流少，信息不灵。二）、动物实验的发展趋势1、使用动物的数量不断下降2、使用动物的质量在不断的提高3、使用实验动物的种系不断增加4、实验动物模型走向商品化5、动物替代物和替代方法不断的应用六、动物实验研究的优越性和欠缺（一）、动物实验研究的优越性1、可以把临床研究中的复杂问题简单化，对各种因素可以进行细微的探讨。2、动物的各种条件可以进行严格控制，便于得出科学的结论。动物作为实验对象，可以在同一时间选择年龄、性别、环境条件、营养状况、遗传特点、微生物等条件相同的若干动物，而以人为研究对象是办不到的。3、可以缩短实验周期，短期内可观察多次。动物的寿命短，一个研究者可观察动物几十代、甚至几百代，而以人为研究对象是办不到的。4、可以在动物身上进行在人体上不能进行的高危险度的试验。从法律和道德上看，凡对人身安全构成威胁的试验在人身上都不能做（如烧伤、致癌等试验）。5、可按研究者的设计要求进行实验。动物实验中，可按时、按量、按次数、按种类、按方式施加任何条件，而人则不会给以配合。6、可随时取材，取任何材料，甚至处死后取材。（二）、动物实验研究的欠缺1、动物在遗传特性、生理、解剖特性上即使与人有相似之处，但毕竟不同于人，所以动物实验数据只能用作参考，不能直接应用于人。2、动物模型与临床疾病相比在病因、病理、外在表现等方面不完全相同，只能相似，所以复制的动物模型必须进行科学的分析和讨论。3、动物实验多在麻醉状态下进行，与人在清醒状态下的反应是不一样的。4、离体器官（或组织）实验与整体实验的情况是不一样的。5、动物缺少思维和语言，不能诉说内心感受，有些实验无法在动物身上进行。（一）、实验动物福利的概念及内涵1、实验动物福利的概念实验动物福利是在其整个生命过程中对其实施保护的具体体现，其实质和基本原则是为了保证实验动物的康乐（Welfare),通俗地说，就是让实验动物在康乐的状态下生活，在无痛苦状态下死亡，内容包括无任何疾病，行为无异常、无心理紧张、压抑和痛苦等。2、实验动物福利的内涵（1）、提供适当清洁饮水和保持身体健康需要的食物，使动物免受饥渴之苦（享受不受饥渴的自由）；（2）、提供适当的栖息场所，能舒适的休息，使动物免受困顿劳累之苦（享受生活舒适的自由）；（3）、做好卫生防疫、预防疾病和给患病的动物及时诊治，使动物免受病痛之苦（享受不受痛苦伤害和疾病威胁的自由）；3、实验动物饲养过程中的福利要求1）、对饲养设施、设备和饲育生活环境的要求；（2）、对待实验动物的态度和饲养管理的要求；（3）、对饲料和饮水的要求；（4）、特殊情况下对实验动物的照料。4、实验动物应用过程中的福利要求（1）、对科研人员素质的要求；（2）、对动物实验设备和手术器械的要求；（3）、对实验设计的要求；（4）、对保定和麻醉技术的要求；（5）、对术后护理的要求；（6）、对实验结束后，对实验动物的处理。1、实验动物工整理和研究者应树立爱护动物的观念。2、研究者应懂得正确的动物实验方法。3、试验中不许恐吓动物，不许造成动物肉体的痛苦，故进行使动物痛苦实验时，必须实施麻醉，处死动物时要施行安乐死、尸体要焚烧。4、要给牺牲的动物树立“慰灵碑”，表示对动物的感谢，唤起人们对动物的爱护和尊重。5、建立健全法规、用法律约束人们的行为。6、遵守3R原则、既代替（Replacement）减少（Reduction）优化（Refinement）。7、为动物设计舒适、有利于动物生存的环境。三）重视实验动物福利的意义1、有助于培养人类热爱自然、热爱生命、保护动物的意识。2、有利于从动物的身体上获得更加准确的数据。3、有利于非动物实验（代替法）的研究推广。4、有利于人类社会及人类社会和动物界的和谐，从而有利于科学的进步和社会的进步。四）、3R原则的内涵1、实验动物的代替（Replacement)（1）、生命系统包括离体培养的器官、组织、细胞等。在单克隆抗体生产、病毒疫苗研制、效力安全试验等研究项目中广泛应用。（2）、非生命系统包括物理、化学方法代替动物。医学基础教学已有用物理学系统和机械系统者（如心肺复苏等病理过程）。免疫化学可用结合力很高的抗体来搜寻抗原或鉴定毒素存在。减少实验动物使用量（Reduction（1）、合用动物；（2）、改进统计学设计；（3）、使用低等动物代替高等的实验动物；（4）、使用高质量动物。3、动物实验的优化（Refinement（1）、改良仪器设备；（2）、减少对动物的侵扰。改善实验室条件，提高实验质量；（3）、进一步控制痛苦；（4）、改进动物保定技术。二、实验动物的法规（一）、管理机构与社会团体国家科技部：主管全国实验动物工作。实验动物学会：负责学术交流、技术咨询、人员培训。实验动物管理委员会：由科技部门出领导、学会出专家组成，负责各行业、各系统实验动物管理工作、法规落实、业务指导和业务协调。（二）、政策和法规第一部法规：1988年科委报请国务院批准颁布的《实验动物管理条例》国家科委2号令1997年又颁布了多项法规：《实验动物质量管理办法》〈实验动物国家种子中心管理办法〉〈国家实验动物质量检测机构技术〉现执行的是2001年国家科技部联合六部委颁布的〈实验动物许可证管理办法〉（四）、质量保证体系1、检测网络：国家的、系统的、地方的。负责检测方法、技术、试剂的研究人员培训和仲裁。2、种子中心：国家有啮齿类中心和上海分中心，云南灵长类中心，哈尔滨SPF鸡中心。3、生产、繁殖、供应中心：由各行业、各地区、各单位设施合格技术较好的单位负责生产和供应。五）、实验动物从业人员1、从业人员：是指从事实验动物的科技人员、专业管理人员和技术工人，以及利用动物进行教学、研究、药品和生物制品生产及检定等人员。国家规定从业人员实行岗位资格认可制度，所有人员必须持证上岗。2、人员素质要求：⑴遵守法律、法规、遵守生产和实验要求。⑵了解实验动物知识、科学管理和操作。⑶有饲养和实验操作技能。⑷善待动物。六）、科学教育：1、普及教育（相关人员培训上岗）2、大学教育（生物、医学、农业、林业等大学授课）3、硕士和博士学位的专业教育（一）、实验动物品种、品系1、种:动物“种”(species)是生物学分类的最基本单位,而在实验动物中,种是指可以相互交配且后代有繁殖能力的同一种类的动物。2、实验动物品种(stockbreed):一般指具有一些容易识别和人们所需要的性状，而且是可以稳定遗传的动物群体。通常把封闭群动物称为品种,如新西兰白兔、KM小鼠等。3、品系(strain):实验动物学上把基因高度纯合的动物称为品系动物,通常指近交系、突变系动物。vv二）、作为一个品种、品系应具备的条件1、相似的外貌特征：例如小鼠C57BL/6品系的毛色是黑色的,DBA/2品系的毛色是灰色的,KM品种的毛色是白色的。当然,相似的外貌特征只是品系、品种应具备的条件之一。不同品系、品种的动物也有外貌相似的,例如A、KM等十几个品种、品系动物的毛色都是白色，但它们在其他的条件上是有区别的。2、独特的生物学特性3、稳定的遗传性能：一个品种或品系有一定的育种价值，杂交F1代繁殖后代时，性状发生分离不能成为一个品系。4、具有共同的遗传来源和一定的遗传结构按培育的程度分为广义和狭义实验动物1、广义实验动物：泛指用于科学实验的各种动物2、狭义实验动物：指经人工饲育的，对其携带的微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检定以及其它科学实验的动物。远交种的命名：（1）、一般用2~4个大写字母表示，如ICR、NIH小鼠。（2）、习惯用法，如Wistar大鼠、NewZealandWhite兔。（3）、在大写字母之前加上一个大写字母和几个小写字母构成的培养者或保留者的符号，并且与品系名称用冒号隔开，如Lac:LACA是由英国实验动物中心保持的LACA小鼠，N:NIH是由美国国立卫生研究院保存的NIH小鼠。一、实验动物科学的概念和研究范畴二、实验动物科学的诞生三、中国现代实验动物学的诞生四、实验动物科学应用范畴五、动物实验研究的现状及发展趋势六、动物实验研究的优越性和欠缺1、实验动物育种学：主要研究实验动物的遗传改良、遗传控制、新型实验动物的开发和野生动物的实验动物化。2、实验动物医学：研究实验动物的疾病诊断、治疗和预防。3、实验动物生态学：研究如何为实验动物提供适于生存的环境条件，使实验动物健康无病，生理指标稳定。1、公元前4世纪至公元3世纪公元前4世纪，杰出的生物学奠基人Aristotle首先开展了多种动物解剖，但都是在死亡的动物和人尸体上进行的。Erasistratus可能是进行活体动物实验的创始人，他在猪体内确定了气管是吐纳空气的通道，肺是呼吸空气的器官。之后，Galen对猪、猴及其他多种动物都施行了活体解剖检查，以此推论人体的生理功能。4、20世纪初至今上个世纪80年代以来，通过实验动物与动物实验研究获得三次诺贝尔医学奖：（1）、1980年度诺贝尔医学奖：GeorgeSnell的组织相容性基因的发现；（2）、1984年度诺贝尔医学奖：G.Kohler和C.Milstein单克隆抗体的发现；（3）、1996年度诺贝尔医学奖：Koherty和ZinkermagelT淋巴细胞识别微生物的发现三、中国现代实验动物学的诞生四、实验动物科学应用范畴1、生命科学方面基础医学理论，疾病的病因、治疗和预防的研究；新的治疗方法、新的检查和治疗仪器的研制；分子生物学研究；基因工程研究；老年学研究；生育控制研究等。2、药学方面药理学的研究；新药开发研究；诊断用血清、疫苗、免疫血清的整理；药品的安全性评价试验；药效试验等。五、动物实验研究的现状及发展趋势3、我国动物实验研究方面存在的问题（二）、动物实验的发展趋势六、动物实验研究的优越性和欠缺（二）、动物实验研究的欠缺第二章实验动物的法规和伦理一、实验动物福利2、实验动物福利的内涵3、实验动物饲养过程中的福利要求4、实验动物应用过程中的福利要求（二）、正确对待实验动物福利（三）重视实验动物福利的意义（四）、3R原则的内涵2、减少实验动物使用量（Reduction)3、动物实验的优化（Refinement)二、实验动物的法规（一）、管理机构与社会团体国家科技部：主管全国实验动物工作。实验动物学会：负责学术交流、技术咨询、人员培训。实验动物管理委员会：由科技部门出领导、学会出专家组成，负责各行业、各系统实验动物管理工作、法规落实、业务指导和业务协调。（二）、政策和法规第一部法规：1988年科委报请国务院批准颁布的《实验动物管理条例》国家科委2号令1997年又颁布了多项法规：《实验动物质量管理办法》〈实验动物国家种子中心管理办法〉〈国家实验动物质量检测机构技术〉现执行的是2001年国家科技部联合六部委颁布的〈实验动物许可证管理办法〉（三）许可证内容1、不同等级、不同种动物的生产、繁殖、供应合格证。2、不同等级的实验设施许可证。3、从业人员许可证。（四）、质量保证体系1、检测网络：国家的、系统的、地方的。负责检测方法、技术、试剂的研究人员培训和仲裁。2、种子中心：国家有啮齿类中心和上海分中心，云南灵长类中心，哈尔滨SPF鸡中心。3、生产、繁殖、供应中心：由各行业、各地区、各单位设施合格技术较好的单位负责生产和供应。（五）、实验动物从业人员1、从业人员：是指从事实验动物的科技人员、专业管理人员和技术工人，以及利用动物进行教学、研究、药品和生物制品生产及检定等人员。国家规定从业人员实行岗位资格认可制度，所有人员必须持证上岗。2、人员素质要求：⑴遵守法律、法规、遵守生产和实验要求。⑵了解实验动物知识、科学管理和操作。⑶有饲养和实验操作技能。⑷善待动物。（六）、科学教育：1、普及教育（相关人员培训上岗）2、大学教育（生物、医学、农业、林业等大学授课）3、硕士和博士学位的专业教育第三章实验动物分类一、自然分类法分类（二）、作为一个品种、品系应具备的条件)实验动物在生物学分类中的位置二、按培育的程度分类按培育的程度分为广义和狭义实验动物1、广义实验动物：泛指用于科学实验的各种动物2、狭义实验动物：指经人工饲育的，对其携带的微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检定以及其它科学实验的动物。（一）、封闭群普通近交系（二）、近交系——→重组近交系同源近交系（三）、杂交一代动物同源导入系（四）、突变系分离近交系1、定义：一个有效群体在固定场所，五年以上不从外部引入新个体、以非近亲交配方式繁育生产的实验动物群体称为封闭群，亦称远交群。（1）、远交种：一个长时期于外界隔离，雌雄个体之间能够随机交配的动物群。其遗传组成比较接近于自然状态下的动物群体结构。常见的远交种动物有KM、ICR、NIH小鼠、SD大鼠、新西兰兔、Wistar大鼠等。（2）、突变种：携带个别突变基因的封闭群，这些突变可能以纯合或杂合形式存在于封闭群中。2、封闭群的命名3、封闭群动物的特点及应用1、普通近交系（Inbredstrain)概念：是通过至少（或相当）连续20代以上兄妹或亲子交配培育而成，品系内所有个体都可以追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先，近交系数大于98.6%的动物群体。近交系特点：基因高度纯合；表现型一致；对外界刺激敏感而反应一致；生命力差、抗病力低。普通近交系的命名近交系动物的应用2、重组近交系3、同源突变、同源导入、分离近交系1、概念：杂交群动物（HybridAnimals）指两个近交系之间进行有计划交配所获得的第一代动物（也叫F1代动物）。实验动物所说的杂交群通常指杂交F1代动物。1、定义：遗传基因发生突变具有某种特殊表型的动物，称为突变系动物。2、特点：多为病态，生活能力差，对饲养管理要求严格，繁殖保种较为困难。3、应用：作为人类疾病动物模型如：糖尿病鼠（diabetesmice)、肥胖症鼠（obesemice）、自发性高血压大鼠（spontaneoushypertension）（SHR）、裸鼠（nudemice或rats）、联合免疫缺陷小鼠（SCID）等。按照微生物控制程度，目前我国将实验动物分为四个等级：普通级动物（Ⅰ级）清洁级动物（Ⅱ级）无特定病原体动物（Ⅲ级或SPF级）无菌动物和悉生动物（Ⅳ级）1、普通级动物（Conventionalanimal，CV也叫一级动物）定义：未经严格的微生物学和寄生虫学控制，饲养在开放的环境中的实验动物，不携带所规定的人兽共患病病原和动物烈性传染病病原。特点：敏感性、一致性差，只能用于教学示教或科研预实验。国外没有这个等级的啮齿类动物。2、清洁级动物（Cleananimal，CL也叫二级动物）定义：除普通动物应排除的病原体外，还不许携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原体，肉眼观察无病外，尸体解剖时主要脏器、组织无论是宏观还是病理组织切片均不应有病变。种子来源于剖腹产或SPF动物、饲养在屏障系统内。特点：可靠性、重复性好，适用于大多数科研和教学实验。3、无特定病原体动物（Specificpathogenfreeanimal，SPF也叫三级动物）定义：除清洁级动物应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病病原和对科学实验干扰大的病原。种子来源于剖腹产或无菌动物，饲养在屏障系统内。特点：国际通用的标准科研用实验动物。4、无菌动物（Germfreeanimal，GF）和悉生动物（Gnotobilticanimal，GN也叫四级动物）定义：用现有的科学知识和检测手段，在动物体内外不能检出一切外来生命的动物称为无菌动物；悉生动物是指在无菌动物体内植入已知微生物的动物。根据体内植入菌落种类不同，又可以分为单菌动物、双菌动物和三菌动物。种子来源于剖腹产，饲养在隔离器内。无菌动物的特点：盲肠薄，肠粘膜绒毛增多；肝脏重量下降，心脏、脾脏、肾脏缩小；白细胞增多，数值恒定；免疫功能低下；代谢周期和寿命延长；无菌豚鼠和家兔繁殖和生长机能下降。多用于特殊实验。第四章人类疾病的动物模型第一节人类疾病动物模型的概念、意义及分类一、人类疾病动物模型的概念人类疾病的动物模型（animalmodelofhumandisease）是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象和相关材料。动物模型主要用于实验生理、实验病理和实验治疗学（包括新药筛选）研究。二、人类疾病动物模型在生物医学研究中的意义1、可复制临床上一些不常见的疾病，如放射病、毒气中毒、烈性传染病、外伤、肿瘤等2、可按需要选择动物模型作为人类疾病的“复制品”，可按研究者的需要随时采集各种样品或分批处死动物收集标本，以了解疾病的全过程，这是临床难以办到的。3、可比性一般疾病多为零散发生，在同一时期内，很难获得一定数量的定性材料，而动物模型不仅在群体数量上容易得到满足，而且可以在方法学上严格控制实验条件，从而提高实验结果的可比性和重复性，使所得的实验结果更准确更深入。4、有助于全面认识疾病的本质在临床上研究疾病的本质难免带有一定的局限性。许多病原体除人以外也能引起多种动物的感染，其症状体征表现可能不完全相同。但是通过对人畜共患病的比较，则可以充分认识同一病原体给不同的机体带来的各种危害，使研究工作上升到立体的水平来揭示某种疾病的本质。三、好的人类疾病动物模型应具有的特点1、再现性好：应能再现所要研究的人类疾病，动物疾病的表现应与人类疾病相似；2、动物背景资料完整，生命周期满足实验要求，复制率高；3、专一性好：即一种方法只能复制出一种模型。四、人类疾病动物模型的分类1、自发性动物模型（naturallyoccurringorspontaneousanimalmodels）是取自动物自然发生的疾病，或由于基因突变的异常表现通过定向培育而保留下来的疾病模型。2、诱发性动物模型（experimentalartificialorinducedanimalmodels）是通过物理、生物、化学等致病因素的作用，人为诱发出的具有类似人类疾病特征的动物模型。第二节常见自发性人类疾病的动物模型2、神经系统疾病3、循环系统疾病4、呼吸系统疾病5、消化系统疾病6、泌尿系统疾病7、血液与造血系统疾病8、新陈代谢疾病9、内分泌系统疾病第三节诱发性动物模型的复制方法简介1、神经系统疾病2、循环系统疾病3、呼吸系统疾病4、消化系统疾病5、泌尿系统疾病6、血液与造血系统疾病7、新陈代谢疾病8、寄生虫2动物实验技术三、分类：1.按机体水平：整体实验和离体实验。具体分为亚细胞、细胞、组织、器官、整体动物和无损伤动物等水平的实验。2.时间：急性实验（2天以内）、亚急性实验（1~4周）、慢性实验（2~6个月或更长时间甚至整个生命期）四、方法：生理学、病理生理学、药理学、病理解剖学、组织学、微生物学、免疫学的动物实验方法等等。第二节动物实验前的准备（二）实验单位随机分为三组分组情况（二）耳缘剪孔法：是在动物的耳边缘剪出不同的缺口或打成不同的小孔进行标记的方法。为防止孔、口愈合，一般在打孔后用消毒的滑石粉涂抹在孔、口局部。由打孔或剪切的位置和孔数代表编号，一般在耳内按上、中、下打孔，分别代表1、2、3，在相应位置剪缺口代表4、5、6，剪两个缺口代表7、8、9，无孔或缺口为10。本法规定右耳代表个位数、左耳代表十位数。（三）烙印法：用烙印钳将号码烙印在犬等大中型动物无体毛或明显部位。大、小鼠等小动物可用刺针在动物耳上刺号，然后用棉签蘸着溶在酒精中的黑墨在针刺处涂抹。烙印前,最好对烙印的部位预先用酒精消毒，操作时要注意防止感染。（四）号牌法：用特制的金属号牌固定在实验动物的耳上，大动物可系于颈项部，固定号牌时要注意避开血管。（五）笼子编号法：不在动物身体上作标记而把装动物的笼子进行编号，也叫替代法。第三节动物实验的基本操作一、实验动物的抓取与固定二、实验动物被毛去除法三、实验动物的麻醉四、实验动物给药途径与方法五、实验动物采血和采液方法3、手术固定法：用乙醚等麻醉药品麻醉后，用长20~30cm的线绳分别系在四肢上，再把系在四肢的线绳分别系在固定板四角的钉子上，并且在头部上颚切齿的地方牵一根线绳达到完全固定。4、在尾静脉给药时，先根据小鼠的大小选择合适的固定器，打开鼠筒盖，把小鼠放在里面，只露出尾巴；或者用倒放的烧杯将鼠扣住，尾巴自烧杯凹口处露出，并压住，即可进行操作。（二）、大鼠的抓取与固定1、抓取方法：4~5周龄以内的大鼠同小鼠；周龄较大的大鼠其尾部皮肤容易被剥脱，所以用左手从背部中央到胸部捏起来抓住。抓取时最好带防护手套，但手套不宜过厚。2、手固定法：抓取大鼠的方法类似小鼠，即用左手的拇指、食指和中指抓住颈背部皮肤，小指和无名指挟住尾部牢牢固定；或左手按住抓起大鼠的时候，把食指放在颈背部，拇指及其他三指放在肋部，食指和中指挟住左前肢，分开两前肢带起来，右手按住后肢固定；还有一种方法，张开虎口，迅速将拇指、食指插入腹下，虎口向前，其余三指及掌心握住大鼠身体中段，并保持仰卧体位，然后调整左手拇指位置，紧抵在下颌骨上进行实验操作。3、手术固定法：同小鼠。4、尾静脉给药或采血时同小鼠。（三）、豚鼠的抓取与固定1、抓取方法：抓取幼小豚鼠时，用手捧起来；成熟的大豚鼠，用手大把抓起胸肋部即可。注意不能粗野，更不能抓取腰腹部，这样容易造成肝破裂而死亡。2、手固定法：⑴将左手的食指和中指放在豚鼠颈背部两侧，拇指和无名指放在肋部，分别用手指夹住左右前肢抓起来。⑵反转左手，用右手的拇指和食指夹住右后肢，用中指和无名指夹住左后肢是豚鼠整体伸直成一条直线。⑶一个人固定操作时，坐在椅子上，用右手拿着豚鼠的后肢夹在两腿之间，用大腿代替右手夹住。3、手术固定法：同大、小鼠。（四）、家兔的抓取与固定1、抓取方法：用一只手大把抓住颈背部皮肤提起来，另一只手托住其臀部，让其重心落在托其臀部的手上，运送时，可抓住颈肩部皮肤抱着兔子运送。2、手固定法：在灌胃给药时，人坐在椅子上，用一只手抓住颈背部皮肤，另一只手抓住两后肢放在两腿之间，大腿夹住兔子的下半身，用空着的手抓住两前肢固定之，抓住颈背部的手同时捏着两只耳朵，不让头部转动。3、固定器固定法：耳静脉给药或采血时用盒式固定法；从颈动脉采血或手术实验时用此固定法。（1）盒式固定法：把兔子放在盒子里，只露出头部，用转扭拧固定器固定家兔。（2）台式固定法：将麻醉的兔子仰卧，用纱布条依次将四肢捆绑固定于固定台的两侧，然后把头部放在金属制的首枷和咀环上固定。（五）、犬的抓取与固定1、抓取方法：先给犬带上系有铁链条的脖套，对于性情凶猛的犬，要用特制的钳式长柄犬夹夹住犬颈部将犬按倒后，再系脖套和链条。2、手固定法：首先绑住犬嘴，方法是饲养员或犬主人从侧面靠近并轻轻抚摸其颈部皮毛，然后迅速用布带绑住犬嘴，布带从下颌绕到上颌打一个结，再绕到下颌打一个结，然后将布带绕到头后颈，在颈后部再打一个结，最后打一个活结，对于未经驯服的犬，可用长柄犬夹夹住犬颈部按倒后强制绑嘴。3、手术台固定法：麻醉后，松开布带，将犬仰卧在手术台上，先固定四肢，再固定头部。（六）、猫的抓取与固定1、抓取方法：先轻声呼唤，慢慢将手伸入猫笼，轻轻抚摸猫头、颈及背部，然后一只手抓住其背部皮毛，另一只手抓其腰背部。如遇凶暴的猫不让接触时，可用网套抓取。2、固定方法：同兔台式固定法。猫头可用一根粗棉绳，一端拉住猫的两只门齿，另一端捆绑在实验台的铁柱上。（七）、蛙的抓取与固定1、抓取方法：左手将动物背部贴紧手掌固定，以中指、无名指、小指压住其左腹侧和后肢，拇指和食指分别压住左、右前肢，右手操作。注意：不要挤压其耳部两侧突起的毒腺，以免毒液射进眼中。2、固定方法：用探针破坏其脑脊髓或麻醉后用大头针固定在蛙板上。（八）、鸡的抓取与固定1、抓取方法：一只手从鸡的前方，另一只手绕到鸡的背后悄悄接近，两只手迅速将鸡抓住。2、手固定法：把鸡朝向持者方向，以右手的食指与中指夹住鸡的两脚，以左手掌紧握从腹部到翼部的位置。3、手术台固定法：用毛巾将动物裹住固定，放在实验台上。（九）、羊的抓取与固定1、抓取方法：通常只需在羊脖子上带上项圈，用绳牵着，便可抓取。2、固定方法：将羊蹄捆绑，使其侧卧在地，以手固定其头部防止挣扎翻滚；也可以采用特制的羊固定架固定。此种方法常应用于采血。（十）、猪的抓取与固定1、抓取方法：小猪常采用双手提起后肢，两膝夹住猪背倒立固定；成猪可采用站立固定。2、固定方法：可将猪仰放在“V”字型槽内固定，也可用木制三角固定架和帆布吊兜固定（挖四个孔使其四肢下伸）。如没有三脚架，也可以用犬固定台。（十一）、猴的抓取与固定1、抓取方法：从笼内抓取时，饲养人员应右手持短柄网罩，左臂紧靠门侧，以防止笼门敞开时猴逃出。右手将网罩塞入笼内，由上而下罩捕。当猴被罩住后，应立即将网罩翻转取出笼外，罩猴在地，由罩外抓住猴的颈部，清掀网罩，再提取猴的手臂反背握住。2、固定方法：（1）徒手固定：将猴两前肢反背其背后，操整理用一只手握着，用另一只手将猴两后肢捉住即可固定。（2）固定架固定：使用“猴限制椅”或“猴固定架”进行固定。二、实验动物被毛去除法1.拔毛法：在各种动物做后肢皮下静脉注射或采血，特别是兔耳缘静脉注射或采血时常用。动物固定→拇指和食指拔去所需部位毛→涂一层凡士林。2.剪毛法：动物固定→水湿润剪毛部位→将局部皮肤绷紧→用弯头手术剪紧贴皮肤剪毛。3.剃毛法：动物固定→肥皂水浸润剃毛部位→顺被毛方向剃毛（若用电动剃刀则逆被毛方向剃毛）。4.化学脱毛法：常用于大动物无菌手术、局部皮肤刺激性实验、观察动物局部血液循环或其它各种病理变化。⑴方法：动物固定→剪短脱毛部位被毛→用棉球或纱布沾取脱毛剂→在脱毛部位涂成薄层→2~3分钟后用温水洗涤脱下的被毛→干纱布擦干→涂一层油脂。⑵常用脱毛剂：硫化碱、硫化钠、硫化钙、硫化锶、硫化钡、三硫化二砷。⑶配方：Ⅰ、硫化钠:肥皂粉:淀粉=3:1:7加水适量调成膏状。Ⅱ、硫化钠:淀粉:糖:甘油;硼砂:水=8:7:4:5:1:75调成糊状。Ⅲ、8%的硫化钠溶液以上脱毛剂配方适用于家兔、大鼠、小鼠等小动物脱毛。Ⅳ、硫化碱10g、生石灰15g，加水至100ml，溶解即可。此配方适用于犬等大动物的脱毛。三、实验动物的麻醉（一）、常用的麻醉剂1、挥发性麻醉剂包括乙醚、氯仿等。2、非挥发性麻醉剂包括苯巴比妥钠、戊巴比妥钠、硫喷妥钠、氨基甲酸乙脂、水合氯醛。3、中药麻醉剂包括洋金花、氢溴酸东莨菪碱等。（二）、动物的麻醉方法

1、全身麻醉（1）、吸入麻醉：多采用乙醚做麻醉药。把带有乙醚的棉球放入玻璃容器内，挥发后将动物放入容器内4~6分钟，动物失去运动力后立即取出动物以避免麻醉过深致死。此法多用于短期操作性实验，乙醚麻醉的优点是苏醒快，但是对呼吸道刺激性大，长时间容易窒息死亡。（2）、注射麻醉：大、小鼠和豚鼠常采用腹腔注射法进行全身麻醉，犬、猫、兔等既可腹腔注射也可静脉注射给药。注射时，先用麻醉药总量的2/3，密切观察动物生命体征的变化，如已经达到所需麻醉的程度，余下的麻醉药则不用，避免麻醉过深抑制大脑呼吸中枢导致动物死亡。各种动物常用的全身麻醉剂的剂量及途径注:i.p指腹腔注射,i.m指肌肉注射,s.c指皮下注射,i.v指静脉注射2、局部麻醉（1）、表面麻醉:利用局部麻醉药的组织穿透作用，透过粘膜，阻滞浅表的神经末梢，称为表面麻醉。常用利多卡因，眼部用药点滴、鼻内用药涂敷、咽喉气管用药喷雾、尿道灌注给药。（2）、区域阻滞麻醉：在手术区内四周和底部注射麻醉药阻断疼痛的向心传导，称为区域阻滞麻醉。常用普鲁卡因。（3）、神经干(丛)阻滞麻醉：在神经干(丛)的四周注射麻醉药，阻滞其传导，使其所支配的区域疼痛感觉消失，称为神经干(丛)阻滞麻醉。常用利多卡因。（4）、局部浸润麻醉：沿手术切口逐层注射局部麻醉药，阻滞组织中的神经末梢，称为局部浸润麻醉。常用普鲁卡因。3、麻醉注意事项（1）有些麻醉药，如乙醚挥发性很强，易燃，使用时应远离火源，平时应妥善保存。（2）应特别注意各种麻醉药的剂量和给药途径，切莫因药量过大而引起中毒或死亡。（3）注射时，一般要求缓慢注入，并随时观察动物肌肉的紧张性、角膜反射、呼吸频率、疼痛反射等指标。（4）注意保温，采取实验桌内装灯、电褥、台灯照射等。（5）万一麻醉过量，根据不同情况采取措施，如施行人工呼吸、给予苏醒剂或注射强心剂、咖啡因、肾上腺素、可拉明等，也可以静脉注射5%温热的葡萄糖溶液。四、实验动物给药途径与方法（一）、注射法给药3.肌肉注射：一般选择肌肉发达而且无大血管经过的部位，犬、猫、兔多选臀部，大、小鼠多选股部。注射时针尖穿过皮肤后，再往深部刺入肌肉，此时针尖不能自由活动，回抽注射器无回血，即可注射。一般小动物选择5或5.5号针头，大动物选用6或6.5号针头。注意，注射时针头与肌肉成60。角，一次性刺入，小鼠每次注入量不超过0.1ml。4.腹腔注射：将动物固定，然后在左或右下腹皮下，将针头向前推0.5~1.0cm，再以45。角斜穿腹肌，缓慢注入药液。注药之前有落空感，回抽无肠液、尿液后方可注药。小鼠一次注射量为0.1~0.2ml/10g(体重)，大鼠为1~2ml/100(体重)。5.静脉注射：实验动物不同所选静脉注射部位也不同。大、小鼠一般选用尾静脉，兔选用耳缘静脉，犬选用后肢小隐静脉或前肢内侧皮下静脉注射。一般只限于液体药物，若是悬浊液，可能引起血管栓塞。⑴大、小鼠尾静脉注射：尾静脉有3条，左右两侧和背侧各有1条，由于两侧静脉比较容易固定，所以常被采用。操作时，先将动物固定在暴露尾部的固定器内（烧杯等），除毛后，将尾部置于45℃~50℃的温水中浸泡1~2分钟或用75%酒精棉反复擦拭使血管扩张，以左手拇指和食指捏住尾两侧，使静脉充盈，注射时针头尽量采取与尾部平行的角度进针，完毕后把尾部向注射侧弯曲止血。一次注射量为0.05~0.1mg/10g(体重)⑵兔耳缘静脉注射：兔耳缘静脉表浅易固定而常被采用。操作时，先固定兔子，而后用75%酒精棉球反复擦拭使血管充盈，左手食指、中指夹住静脉近心端，拇指绷紧静脉远心端，无名指和小指垫在耳下边，针从静脉末端刺入并顺血管方向平行刺入1cm左右，回抽有血后再用拇指固定针头，放开食指和中指将药液注入，拔针后用酒精棉球压迫几分钟，防止流血和消毒。⑶犬的静脉注射：多采用前肢内侧皮下静脉或后肢小隐静脉，在静脉血管近心端用橡皮带扎紧，使血管充盈，从静脉的远心端平行进针，回抽有血后松开橡皮带，将药液缓慢注入。⑷豚鼠的静脉注射：同犬的静脉注射方法，也可以象兔一样采用耳缘静脉注射。6.淋巴囊注射：主要用于蛙类。腹部淋巴囊和头背部淋巴囊常作为蛙类给药途径。采用腹部淋巴囊给药时，将针头从蛙大腿上端刺入，经大腿肌层入腹壁肌层，再进入腹壁皮下，然后注入药物；采用胸淋巴囊给药时，将针头刺入口腔，使穿过下颌肌层入胸淋巴囊内注射药物，一次最大给药剂量为1ml。蛙全身分布为咽、胸、背、腹侧、腹、大腿和脚等七个淋巴囊。

（二）、经口给药法1.自动口服法：将药物放入饲料或饮水中，让动物自动摄入，方法简单不费工夫，也不会给动物造成损伤。但很难掌握给药量，有时药物在常温下还会分解。这种方法一般适用于动物疾病的防治、药物的毒性观察、某些与食物有关的人类疾病动物模型的复制等。2.强制灌胃给药：就是用灌胃器将药品直接强制灌入胃内。这种方法能准确掌握给药量、给药时间，并能发现和记录症状出现的时间及经过。缺点是费时、同时给动物带来一定的损伤和心理影响。因此，如果操作技术熟练对动物的不良影响就可以减少一些。⑴大、小鼠、豚鼠的灌胃法：左手抓住鼠背颈部皮毛将动物固定，右手持灌胃器，将灌胃针从口腔插入，沿咽后壁插入食道，使其前端达到膈肌水平，为防止插入气管，应回抽注射器针栓，如无空气被抽回，即可将药液注入。小鼠进针约3~4cm、大鼠、豚鼠为4~6cm，常用灌胃量小鼠为0.2~1.0ml、大鼠为1~4ml、豚鼠为1~5ml。⑵兔、犬、猫的灌胃法：先固定动物，然后将开口器固定在动物口中，压住舌头，然后将灌胃管从开口器小孔插入食道，将另一端浸入水中，如有气泡逸出，说明误入气管需拔出重插，插好后将药液推入，为避免药液残留需再注入5ml生理盐水。兔、猫插入为15cm左右，犬为20cm左右。一次耐受量兔为80~150ml，犬为200~500ml。各种动物一次灌胃能耐受的最大容积（三）、其他途径给药法⒈直肠给药：多用于家兔，将药物通过肛门直接注入动物直肠内，经直肠壁吸收，注意不要误入阴道。⒉呼吸道给药：以粉尘、气体、蒸汽、雾等状态存在的药物或毒气，均通过动物呼吸道给药。⒊皮肤给药：为了鉴定药物或毒物经皮肤的吸收作用、局部作用、致敏作用和光感作用等，均采用皮肤给药。⒋脊髓腔内给药：此法主要用于椎管麻醉或抽取脑脊液。⒌关节腔内给药：主要用于大中型动物，给兔子注射时首先将兔仰卧固定，在膑韧带附着点外上方约0.5cm处进针，针头从前上方向下后方倾斜刺入，直至针头遇到阻力变小为止，然后针头稍后退，以垂直方向推进关节腔中。当有刺破薄膜的感觉时即可注入药液。⒍脑内给药：常用于微生物学试验。将病原体接种于被检动物脑内，然后观察接种后的变化。⒎小脑延髓池给药：此种给药方法都是在动物麻醉情况下进行，而且常用于大动物如犬等，小动物很少采用。四、实验动物用药量及计算方法㈠给药剂量的确定⒈先用小鼠粗略地摸索中毒剂量或致死剂量，然后用小于中毒的剂量，或取致死量的若干分之一为应用剂量，一般取1/10~1/5。⒉植物药粗制剂的剂量多按生药量折算。⒊化学药品可参考化学结构和作用都相似的药物剂量。⒋一般情况下，在适宜的剂量范围内，药物的作用常随剂量的加大而增强。所以有条件时，最好同时用几个剂量作实验，以便迅速获得关于药物作用的较完整的资料。如实验结果出现剂量与作用强度之间毫无规律时，则更应慎重分析。⒌用大动物进行实验时，开始的剂量可采用用于鼠类剂量的2/5~1/2，以后可以根据动物的反应调整剂量。⒍根据动物的年龄大小和体质强弱确定给药剂量，一般说确定的给药剂量是指成年动物的；如幼小动物，剂量应减少。如以狗为例：6个月以上的给药量为1份时，3~6个月的狗给1/2份，45~89日龄给1/4份，20~44日龄给1/8份，10~19日龄给1/16份。⒎根据给药途径不同确定给药剂量，如以口服量为100ml时，灌肠给药量为100~200ml，皮下注射为30~50ml，肌肉注射为25~30ml，静脉注射为25ml。㈡实验动物间用药量的计算方法动物实验所用的药物剂量，一般按mg/kg体重或g/kg体重计算，应用时须用已知药液的浓度换算出相当于每kg体重应注射的药液量(ml)，以便给药。㈢人与动物及各类动物间药物剂量的换算方法dB=dA×ＲＢ/ＲA×(WA/WB)1/3公式中:dA、dB是AB两种动物kg体重的剂量(mg/kg)ＲA、ＲＢ是动物的体形系数。R可由表查到。WA、WB是动物体重五、实验动物采血和采液方法（一）、采血（3）眼眶静脉丛采血：左手拇指、食指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部（防止动物窒息），轻轻压迫动物颈部两侧，使眶后静脉丛充血。右手持接7号针头的1ml注射器或长颈（3~4cm）硬质玻璃滴管（毛细管内径0.5~1.0mm），使采血器与鼠面成45°夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180°使斜面对着眼眶后界。刺入深度小鼠约2~3mm，大鼠约4~5mm。当有阻力时即停止推进，同时将针退出约0.1~0.5mm，边退边抽。若穿刺适当血液能自然流入毛细管内，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时将采血器拔出，防止术后穿刺口出血。体重20~25g的小鼠每次可采血0.2~0.3ml；体重200~300g大鼠每次可以采血0.5~1.0ml。（4）心脏采血：小鼠心脏小、心率快，采血困难；大鼠可以采用此法，仰卧固定，选择心跳最明显的部位，通常在胸骨左缘的正中作穿刺。（5）断头采血：左手拇指和食指以背部较紧地握住鼠颈部皮肤，并使动物头朝下倾的姿势。右手用剪刀猛剪鼠颈，约1/2~4/5的颈部全剪断，让血液自由滴入盛器。小鼠可采约0.8~1.2ml；大鼠约5~10ml。（6）颈动、静脉采血：动物仰卧固定，切开颈部皮肤，分离皮下结缔组织，充分暴露颈动、静脉用注射器吸出血液。（7）腹主动脉采血：动物麻醉、仰卧固定，腹正中线切开腹腔，清晰暴露腹主动脉，用注射器吸出血液。或用无齿镊子剥离结缔组织，夹住动脉近心端，用尖头手术剪刀剪断动脉，使血液喷入盛器。（8）股动（静）脉采血：由助手握住动物，采血者左手拉直动物下肢，使静脉充盈；或者以搏动为指标，右手用注射器刺入血管。体重15~20g小鼠采血约0.2~0.8ml，大鼠约0.4~0.6ml。2、豚鼠采血法（1）耳缘剪口采血:用锐器割破耳缘，在切口边缘涂抹20%柠檬酸钠溶液以阻止血凝，血可自切口自动流出。可采血0.5ml左右。（2）心脏采血：选择心跳最明显的部位，通常在胸骨左缘的正中作穿刺。在第三、四肋间左缘3mm处垂直进针刺入心脏，血液即流入针管。成年豚鼠每周采血不超过10ml。（3）股动脉采血：动物仰卧固定，剪去腹股沟区的毛，麻醉后，局部碘酒消毒。切开长约2~3cm的皮肤暴露股动脉。用镊子提起股动脉，远端结扎，近端用止血钳夹住，在动脉中央剪一个小孔。用无菌玻璃小导管或塑料管插入，放开止血钳，血液由导管口流出。一次可采血10~20ml。（4）背中足静脉采血：固定动物，将膝关节伸直，动物脚背面酒精消毒，找到背中足静脉，以左手的拇指和食指拉住其趾端，右手刺入静脉采血。3、兔采血法（1）耳静脉采血：常用采血法之一，可反复取血。方法同耳静脉给药，但需逆血流方向进针，最多一次采血5~10ml。（2）耳中央动脉采血：盒式固定，左手固定兔耳，右手持注射器，在动脉的末端，沿动脉平行向心方向刺入，取血完毕后注意止血。一次可达15ml。（3）心脏采血：仰卧固定，在第三、四肋间左缘3mm处垂直进针刺入心脏，血液即流入针管。一次取血20~25ml。（4）后肢胫部皮下静脉采血：仰卧固定，拔去胫部被毛，在胫部上端股部扎橡皮管，左手固定好静脉，右手持注射器与皮下静脉平行方向刺入血管，回抽有血后即可取血。一次可以取2~5ml。（5）股静脉、颈静脉采血：先作股静脉和颈静脉暴露分离手术，再采血。实验动物的血液采集采血部位及采血量（二）、实验动物的体液采集1.尿液的采集⑴代谢笼法：此法较常用，适用于大、小鼠、沙鼠、豚鼠、兔等中小动物。将动物放在特制的笼内，动物排便时，可以通过笼底的大小便分离漏斗将尿液与粪便分开，达到采集尿液的目的。有的代谢笼除可以采集尿液外，还可以收集粪便及二氧化碳。⑵导尿管法：此法适用于雄性兔、犬。动物轻度麻醉后，固定于手术台上，用导尿管（顶端用液体石蜡涂抹）经尿道插入膀胱，可采到无污染的尿液。⑶压迫膀胱法：将动物轻度麻醉后，用手在动物下腹部加压，手要轻柔而有力。当外加的压力足以使动物膀胱括约肌松弛时，尿液会自动由尿道排出。此法适用于猫、犬、兔等较大动物。⑷膀胱穿刺法：将动物麻醉后固定在手术台上，在耻骨联合上腹正中线剪毛，消毒后进行穿刺，入皮后针头应稍改变角度，以避免穿刺后漏尿。⑸反射排尿法：此法适用于小鼠，因小鼠被人抓住尾巴提起时排便反射比较明显，故需要采集少量尿液时，可采用此法。操整理应在提起动物的同时，迅速用容器接住尿液。⑹剖腹采尿法：剖腹暴露膀胱，用左手持小平镊夹住小部分膀胱壁，右手持针在该部位直接穿刺抽取尿液。2.胸、腹水的采集⑴胸水的采集：主要采用胸膜腔穿刺术。动物立位或侧卧固定→术部剪毛、消毒、局部浸润麻醉→左手将术部皮肤向侧方移动→右手持穿刺套管针沿紧靠肋骨前缘处皮肤垂直慢慢刺入→阻力消失或有落空感→抽取胸水⑵腹水的采集：主要采用腹膜腔穿刺术。动物自然站立固定→术部（耻骨前缘与脐之间，腹中线两侧）剪毛、消毒、局部浸润麻醉→左手拇指、食指紧绷穿刺部位的皮肤→右手控制穿刺深度做垂直穿刺→腹水流出→立即固定针头及注射器的位置连续抽吸注意：抽吸速度不要太快，腹水多时不要一次大量抽出，以免因腹压突然下降导致动物出现循环功能障碍等问题。3.唾液的采集⑴直接抽吸法：在急性实验中，可用吸管直接插入动物口腔或唾液腺导管抽吸唾液，不足在于从口腔抽吸的唾液会混入杂质。⑵制备腮腺瘘法：用手术方法将腮腺导管开口移向体外，即以腮腺导管开口为中心，切成一直径2~3cm的圆形粘膜片，将此粘膜片与周围组织分开，穿过皮肤切口引到颊外，将带有导管开口的粘膜片与周围的皮肤缝合，腮腺分泌的唾液就流出颊外，这种方法可以收集到比较纯净的唾液。四、实验动物的急救及处死方法（一）、实验动物的急救措施（二）、实验动物的处死方法（一）、实验动物的急救措施当实验进行中因麻醉过量、大失血、过强的创伤、窒息等各种原因，而使动物血压下降甚至测不到。呼吸极慢或无规则甚至呼吸停止、角膜反射消失等临床死亡症状时，应立即急救，急救的方法可根据动物的情况而定，对狗、兔、猫常用的急救措施有以下几种。1、针刺针刺人中穴对挽救家兔效果较好；对狗用每分钟几百次频率的脉冲电刺激膈神经效果较好。2、注射强心剂可以静脉注射0.1%肾上腺素1ml（增强心肌收缩力），必要时可直接心脏注射。当动物注射肾上腺素后，若心脏已经搏动但极为无力时，可静脉或心腔内注射1%氯化钙5ml(兴奋心肌紧张力）。3、注射呼吸中枢兴奋药可静脉注射尼可刹米(兴奋延髓呼吸中心）或山梗菜碱（颈动脉化学感应器)。每只动物一次注25%尼可刹米1ml或1%山梗菜碱0.5ml。4、动脉快速注射高渗葡萄糖液一般常采用动物股动脉逆血流加压、快速、冲击式注入40%葡萄糖液。注射量根据动物而定，如狗可按2~3ml/kg体重计算。这样可刺激动物血管内感受器，反射性地引起血压呼吸的改善。5、动脉快速输血、输液在作失血性休克或死亡复活等实验时采用。可在动物的股动脉插一软塑料套管，连接加压输液装置。当动物发生临床死亡时，即可加（180~200mmHg），快速从股动脉输血和输入低分子右旋糖酐。如实验前动物曾用肝素抗凝，由于微循环血管中始终保持畅通，不出现血管中血液凝固现象，因此就是动物出现临床死亡后数分钟，采用此种急救措施仍易救活。6、人工呼吸可采用双手压迫动物胸廓进行人工呼吸，如有电动人工呼吸器，可行气管分离插管后，再接人工呼吸器进行人工呼吸。一旦见到动物自主呼吸恢复，即可停止人工呼吸。有条件时，当动物呼吸停止，而心搏极弱或刚停止时，可用5%CO2和60%O2的混合气体进行人工呼吸，效果更好。采用人工呼吸器时，应调整其容量：大鼠为50次/分钟，每次8ml/kg（即400ml/kg/分钟）；兔和猫为30次/分钟，每次10ml/kg（即300ml/kg/分钟）；犬为20次/分钟，每次100ml/kg（即2000ml/kg/分钟）（二）、实验动物的处死方法处死实验动物应遵循动物安乐死的基本原则，即尽可能缩短动物死亡时间，尽量减少其疼痛、痛苦。1、化学致死法此法适用于各种动物，可吸入二氧化碳、乙醚、氯仿等致死。因乙醚易引起火灾，氯仿对人有较大毒性。而二氧化碳对人很安全，处死动物效果确切，故最好使用二氧化碳。也可静脉注射一定量的氯化钾溶液（心肌失去收缩力）、福尔马林溶液（蛋白凝固）、士的宁、DDT致死。2、脊椎脱臼法大、小鼠常用。将动物放在鼠笼盖或粗糙的表面上，用左手拇指与食指用力按住鼠头，右手抓住鼠用力向后上方拉，使颈椎脱臼，鼠立即死亡。3、空气栓塞法此法适用于犬、猫、兔、豚鼠等较大动物。向动物静脉内注入一定量的空气，使之发生栓塞而死。一般兔、猫等静脉内注入20~40ml空气即可致死。每条犬由前肢或后肢皮下静脉注入80~150ml空气，可很快致死。此法常出现动物长时间挣扎，从动物保护的角度出发，不提倡使用。4、急性失血法小鼠等小动物可采用颈总动脉大量失血而致死的方法。犬等大型动物先麻醉后放血，要使放血的切口保持通畅，一般在股三角区横切约10cm的切口，切断股静、动脉，使之大量失血而死亡。采用此方法，动物十分安静，对脏器无损伤，对活杀采集病理切片标本是一种较好的方法。5、击打法此法适用于大鼠、家兔等。抓住动物尾部，提起，用力摔击其头部，或用小木锤用力击打后脑部也可致死。6、断头法此法适用于大、小鼠等小型动物，具体方法与断头采血法相同。7、破坏脑脊髓法此法适用于蛙类。8、其他方法其他处死实验动物的方法还有破坏延脑法、开放性气胸法等。第四节影响动物实验的因素实验动物对动物实验处理的反应可用如下的公式表示：R=（A+B+C）×D±E其中：R为实验动物的总反应或演出型；A为动物种间的共同反应；B为动物品种、品系特有的反应；C为动物个体反应；D为环境因素（包括实验处理）；E为实验误差。可以看出A、B、C是实验动物的本身反应，是由遗传因素起决定性作用，被选择的实验动物，在严格控制环境因素D或改变其中某一条件后就可能得到一个理想的实验结果R。一、生物因素对动物实验的影响生物因素涉及同种生物因素和异种生物因素等。1、实验动物也存在社会地位和势力范围；2、实验动物要有一定的活动面积和空间，要有合理的饲养密度。3、异种动物之间可产生相互影响，因此不同种、品系的动物应分室饲养。4、病原微生物对实验动物的影响是明显的。普通动物、SPF动物和无菌动物特点的比较二、遗传因素对动物实验的影响1、不同种属的哺乳动物，其生命过程有一定的共性，这是科学实验中可以应用实验动物的基础。但另一方面不同种属的动物在解剖、生理生化特征和各种反应上又有个性。如犬、猫、猴对呕吐反应敏感，兔、豚鼠不敏感，大小鼠无反应。2、同种属不同品系的动物对同一刺激的反应有很大的差异。C3H小鼠乳腺癌97%，NOD易发糖尿病，C57BL低癌系。3、动物的解剖生理特征和反应性随年龄而明显变化，老年动物代谢能力低下，反应不灵敏，一般动物实验应选成年动物进行。慢性实验或观察动物的生长发育，应选择幼龄动物。在老年医学研究中，应选用老龄动物。论文设计要保证在动物生命周期内完成。4、不同品种和品系的实验动物的寿命各不相同，所以选用实验动物时应注意到实验动物之间年龄的对应，以便进行分析比较。犬与人的年龄对应（年）5、不同性别的动物对同一药物的敏感性不同，对同一刺激的反应也不一致。雌性动物在性周期的不同时期，怀孕和授乳时，机体的反应性差异很大。因此科研工作中一般选雄性动物或雌雄各半作实验。三、环境因素对实验动物的影响影响动物实验的环境因素很多，主要有温度、湿度、通风、光照、噪音、有害气体、笼具和垫料等，按国家或行业标准加以控制。1、应在标准的实验室中进行实验。特别在进行毒性实验时，室温应设定在22~24℃。用大、小鼠所作的急性毒性实验中，在不同的温度下所作的LD50有所不同，见下表：不同室温下几种药物对小鼠的半数致死量2、实验结果表明麻醉或固定后动物体温将下降，动物实验中应特别注意动物正常体温的维持。3、动物的许多机能，如体温、血糖、基础代谢率、各种内分泌激素的水平都呈昼夜性的节律性变化，动物实验时应注意动物的这些节律性变化，应选择在同样的季节，每日在同样的时间进行，才能得到正确的实验结果。四、实验操作对动物实验的影响1、动物实验要求按照实验室操作规范（GLP）和标准的操作程序（SOP）严格执行。这些法规对实验动物、实验室条件、工作人员素质、技术水平和操作方法都有明确的要求。2、实验动物的精神、神经因素对实验研究有影响。当动物遭受虐待、创伤、粗暴对待等外部刺激时，其内分泌系统、循环系统、机体代谢都与正常时不同。应养成日常善待动物，并熟练掌握捉拿、固定、注射、给药、手术等技能，减少对动物的不良刺激。3、给药途径也是影响实验的重要问题。如有些药品在胃内被破坏或在肝内分解，经口服给药就会影响其效果。有些中药制剂经静脉注射和口服其疗效相差很大。有些药的效果与给药次数和浓度关系很大，动物和人的用药剂量的换算也应准确。4、动物实验后对动物的管理也非常重要，应特别保证动物的有足够量的营养供给。营养缺乏或过剩都会影响实验结果。5、在动物实验中对照问题也很重要，对照的方法很多，有空白对照、实验对照、有效对照、配对对照等。6、肯定一个结果最好采用两种以上的动物进行比较观察，其中之一不应是啮齿类动物。常用选择顺序是小鼠、大鼠、犬、猴或小型猪。猴、犬、大鼠与人在药物代谢方面的相似性比较五、实验技术环节对动物实验的影响1、动物选择选择好适合研究需要的实验动物是获得正确实验结果和实验成功的重要环节。按照不同的实验要求选择合适的实验动物。2、实验季节生物体的许多功能随着季节产生规律性的变动。不同的实验季节，动物的机体反应性有一定的改变。3、昼夜过程机体的有些功能有昼夜规律形变动。4、麻醉深度动物实验中往往需要将动物麻醉后才能进行各种操作。要求麻醉深度要适度，而且在整个实验过程中要保持始终恒定。5、手术技巧动物实验中除了注意选择合适的实验动物，高纯度的试剂，灵敏的仪器，方法准确外，还必须注意手术技巧，即操作技术的熟练。手术熟练可以减少对动物的刺激，将会提高实验的成功率和实验结果的准确性。6、实验药物（1）动物实验中常常需要给动物体内注入各种药物以观察其作用和变化。因此给药的途径、剂量是影响实验中很重要的问题。（2）给药次数对一些药物的药效也有影响。（3）药物的浓度和剂量也是一个重要的问题，太高的浓度，太大的剂量都会出现错误的结果。（4）在动物实验中常遇到的问题是动物和人用药剂量的换算。动物和人用药的剂量的换算以体表面积计算比以体重换算好一些，但仍需慎重处理。7、对照问题动物实验中对照问题也是非常重要的，常有忽视或错误地应用对照的情况，从而造成实验失败。一般对照的原则“齐同对比”。对照的方法很多，有空白对照、实验对照、有效（或标准）对照、配对对照、组间对照、历史对照以及正常值对照等。（1）空白对照是指在不给任何处理情况下观察动物的自发变化的规律。（2）实验对照是采用与实验相同操作条件的对照，如给药实验中的药物溶剂、手术以及观察抚摸等都可以对动物发生影响。（3）有效（或标准）对照常用于药物研究。对一新药的疗效可用一已知的有效药或能引起标准反应的药物作对照，这样既可考核实验方法的可靠性，又可通过比较来了解新药的疗效和特点。(4)配对对照是同一个体在前后不同时间内比较对照期和实验期的差异，或同一个体的左右两部分作对照处理和实验处理的差异，这样可大大减少抽样误差。（5）组间对照是将实验对象分成两组或几组比较差异。这种对照个体差异和抽样误差比较大。组间可用交叉对照法以减少误差。如观察某药物的疗效可用两组犬分别做一次实验和对照，再互相交换，以原实验作为对照组，原对照组作为实验组重复第一次实验所观察的疗效或影响，而且检查的指标和条件要等同。（6）历史对照和正常值对照，这种对照要十分谨慎，必须要条件、背景、指标、技术方法相同才可以进行对比，否则将会得出不恰当的甚至错误的结论。（7）实验的重复和肯定选用动物一方面要数量合适，不造成浪费，另一方面也应做必要的重复实验。有些实验单做一种动物还不够，应当重复几种动物。这不仅可以比较不同动物的差异，而且可以在不同的动物实验中发现新问题，提供使用不同指标的线索。

动物实验技术三、分类：1.按机体水平：整体实验和离体实验。具体分为亚细胞、细胞、组织、器官、整体动物和无损伤动物等水平的实验。2.时间：急性实验（2天以内）、亚急性实验（1~4周）、慢性实验（2~6个月或更长时间甚至整个生命期）四、方法：生理学、病理生理学、药理学、病理解剖学、组织学、微生物学、免疫学的动物实验方法等等。第二节动物实验前的准备（二）实验单位随机分为三组分组情况（二）耳缘剪孔法：是在动物的耳边缘剪出不同的缺口或打成不同的小孔进行标记的方法。为防止孔、口愈合，一般在打孔后用消毒的滑石粉涂抹在孔、口局部。由打孔或剪切的位置和孔数代表编号，一般在耳内按上、中、下打孔，分别代表1、2、3，在相应位置剪缺口代表4、5、6，剪两个缺口代表7、8、9，无孔或缺口为10。本法规定右耳代表个位数、左耳代表十位数。（三）烙印法：用烙印钳将号码烙印在犬等大中型动物无体毛或明显部位。大、小鼠等小动物可用刺针在动物耳上刺号，然后用棉签蘸着溶在酒精中的黑墨在针刺处涂抹。烙印前,最好对烙印的部位预先用酒精消毒，操作时要注意防止感染。（四）号牌法：用特制的金属号牌固定在实验动物的耳上，大动物可系于颈项部，固定号牌时要注意避开血管。（五）笼子编号法：不在动物身体上作标记而把装动物的笼子进行编号，也叫替代法。第三节动物实验的基本操作一、实验动物的抓取与固定二、实验动物被毛去除法三、实验动物的麻醉四、实验动物给药途径与方法五、实验动物采血和采液方法3、手术固定法：用乙醚等麻醉药品麻醉后，用长20~30cm的线绳分别系在四肢上，再把系在四肢的线绳分别系在固定板四角的钉子上，并且在头部上颚切齿的地方牵一根线绳达到完全固定。4、在尾静脉给药时，先根据小鼠的大小选择合适的固定器，打开鼠筒盖，把小鼠放在里面，只露出尾巴；或者用倒放的烧杯将鼠扣住，尾巴自烧杯凹口处露出，并压住，即可进行操作。（二）、大鼠的抓取与固定1、抓取方法：4~5周龄以内的大鼠同小鼠；周龄较大的大鼠其尾部皮肤容易被剥脱，所以用左手从背部中央到胸部捏起来抓住。抓取时最好带防护手套，但手套不宜过厚。2、手固定法：抓取大鼠的方法类似小鼠，即用左手的拇指、食指和中指抓住颈背部皮肤，小指和无名指挟住尾部牢牢固定；或左手按住抓起大鼠的时候，把食指放在颈背部，拇指及其他三指放在肋部，食指和中指挟住左前肢，分开两前肢带起来，右手按住后肢固定；还有一种方法，张开虎口，迅速将拇指、食指插入腹下，虎口向前，其余三指及掌心握住大鼠身体中段，并保持仰卧体位，然后调整左手拇指位置，紧抵在下颌骨上进行实验操作。3、手术固定法：同小鼠。4、尾静脉给药或采血时同小鼠。（三）、豚鼠的抓取与固定1、抓取方法：抓取幼小豚鼠时，用手捧起来；成熟的大豚鼠，用手大把抓起胸肋部即可。注意不能粗野，更不能抓取腰腹部，这样容易造成肝破裂而死亡。2、手固定法：⑴将左手的食指和中指放在豚鼠颈背部两侧，拇指和无名指放在肋部，分别用手指夹住左右前肢抓起来。⑵反转左手，用右手的拇指和食指夹住右后肢，用中指和无名指夹住左后肢是豚鼠整体伸直成一条直线。⑶一个人固定操作时，坐在椅子上，用右手拿着豚鼠的后肢夹在两腿之间，用大腿代替右手夹住。3、手术固定法：同大、小鼠。（四）、家兔的抓取与固定1、抓取方法：用一只手大把抓住颈背部皮肤提起来，另一只手托住其臀部，让其重心落在托其臀部的手上，运送时，可抓住颈肩部皮肤抱着兔子运送。2、手固定法：在灌胃给药时，人坐在椅子上，用一只手抓住颈背部皮肤，另一只手抓住两后肢放在两腿之间，大腿夹住兔子的下半身，用空着的手抓住两前肢固定之，抓住颈背部的手同时捏着两只耳朵，不让头部转动。3、固定器固定法：耳静脉给药或采血时用盒式固定法；从颈动脉采血或手术实验时用此固定法。（1）盒式固定法：把兔子放在盒子里，只露出头部，用转扭拧固定器固定家兔。（2）台式固定法：将麻醉的兔子仰卧，用纱布条依次将四肢捆绑固定于固定台的两侧，然后把头部放在金属制的首枷和咀环上固定。（五）、犬的抓取与固定1、抓取方法：先给犬带上系有铁链条的脖套，对于性情凶猛的犬，要用特制的钳式长柄犬夹夹住犬颈部将犬按倒后，再系脖套和链条。2、手固定法：首先绑住犬嘴，方法是饲养员或犬主人从侧面靠近并轻轻抚摸其颈部皮毛，然后迅速用布带绑住犬嘴，布带从下颌绕到上颌打一个结，再绕到下颌打一个结，然后将布带绕到头后颈，在颈后部再打一个结，最后打一个活结，对于未经驯服的犬，可用长柄犬夹夹住犬颈部按倒后强制绑嘴。3、手术台固定法：麻醉后，松开布带，将犬仰卧在手术台上，先固定四肢，再固定头部。（六）、猫的抓取与固定1、抓取方法：先轻声呼唤，慢慢将手伸入猫笼，轻轻抚摸猫头、颈及背部，然后一只手抓住其背部皮毛，另一只手抓其腰背部。如遇凶暴的猫不让接触时，可用网套抓取。2、固定方法：同兔台式固定法。猫头可用一根粗棉绳，一端拉住猫的两只门齿