Westernblotting 技术 实验室专用

/Westernblotting总蛋白的提取收集小鼠组织或是细胞入1.5ml离心管中。每管加一定量的蛋白裂解液。注：蛋白裂解液的多少以最后能得到的蛋白浓度达到10g/l左右为佳。用匀浆棒进行匀浆（冰中进行）。加入一定量的PMSF，使其终浓度为1mM。冰中放置30~60min。4℃、12000rpm离心30min，上清即为总蛋白。可放-30蛋白浓度的测定（BCA试剂盒）标准曲线的整理配不同浓度的标准液（见表2-1）表2-1BSA各浓度标准液的配制Table2.1PreparationofstandardsolutionwithdifferentBSAconcentration10mMTris-HCl（pH=7.5）FinalBSAConcentrationA700μl100μlBSA250μg/μlB400μl400μlA液125μg/μlC450μl300μlB液50μg/μlD400μl400μlC液25μg/μlE400μl100μlD液5μg/μlF400μl0μg/μl按50：1配SolutionA：SolutionB混合液，每个样本需2ml。在每个试管中加入2mlSolutionA：SolutionB混合液以及0.1ml样本，于60℃测OD562nm，空白对照为10mMTris-HCl（pH=7.5），绘制标准曲线。测样品浓度用10mMTris-HCl（pH=7.5）稀释样品100倍。加2mlSolutionA：SolutionB混合液+0.1ml稀释样本，60℃测OD562nm。调出标准曲线，读出对应浓度值，再乘以100，即为该样品浓度。SDS电泳PAGE胶的制备（5%浓缩胶、10%分离胶）。10%分离胶溶液的配制30%Acr-Bis（29：1） 1.32ml1.5MTris-HCl(pH=8.8) 1ml20%SDS 20μl加水至4ml，轻轻混匀，避免气泡产生。倒胶前加入20μl的10%过硫酸铵（APS）以及2μl的TEMED，轻轻混匀，缓慢注入两玻璃板之间（液面最高处应在梳子下方约0.5cm处）。然后缓慢加入1ml去离子水，37℃5%浓缩胶溶液的配制30%Acr-Bis（29：1） 0.34ml0.5MTris-HCl(pH=6.8) 0.5ml20%SDS 10μl加水至2ml，轻轻混匀，避免气泡产生。倒胶前加入10μl的10%APS以及2μl的TEMED，轻轻混匀，缓慢注入两玻璃板之间分离胶的上方，加满，插入梳子。室温放置待其凝固。蛋白样本制备取20~100μg的总蛋白，加入同样体积的2×蛋白上样缓冲液，于沸水中煮5min，然后6000rmp、2min，取上清待用。电泳把做好的浓缩-分离胶板放入电泳装置中，加入1×蛋白电泳缓冲液，轻轻拔出梳子。把蛋白样本加入加样孔。电泳：浓缩胶70V，分离胶140V，直至溴酚蓝迁移至底部，停止电泳。电转膜准备好与胶大小一致的硝酸纤维素膜一张、两张相应大小的滤纸，将其与纤维垫放入1×蛋白转膜缓冲液中浸泡15~60min。按照纤维垫、滤纸、胶、膜、滤纸、纤维垫的顺序作好转膜三明治，滤纸、胶、膜、滤纸各层中要用玻棒赶尽气泡，然后放入转膜装置中。注意放置的次序：负极（黑孔板）—→纤维垫—→滤纸—→胶—→膜—→滤纸—→纤维垫—→正极（红孔板）。于4℃转膜完毕后，取出膜，放入丽春红染液中染色5min，观察转膜效果。将膜于清水中冲洗，洗去丽春红，放入PBS，待用。封闭将膜放入5%脱脂奶粉（PBS配制）中，于脱色摇床中室温缓慢摇1h。杂交用PBS或是封闭液稀释一抗：Rabbit-anti-Dnaic2（1：2）、Rabbit-anti-DNAI2（1：1000）、Mouse-anti-myc（1：1000）、Mouse-anti-β-tublin（1：1000）、Mouse-anti-Stat3（1：100）、Rabbit-anti-p-Stat3（1：100）或是Mouse-anti-PCNA（1：100），于37℃摇2~3h或是4用含1%Tween-20的PBS洗膜两次，每次5min。加入用PBS或是封闭液稀释的相应的二抗：HRP-Goat-anti-MouseIgG（1：1000）、HRP-Goat-anti-MouseIgG（1：2000），于37℃ECL显色（ECL显色试剂盒）A液：B液=1：1混合，加到膜上，封好。压片曝光1~5min。显影、定影，用水冲洗胶片、晾干。

蛋白裂解贮存液：1MTris-HCl(pH=7.5) 5mlTritonX-100 1ml0.5MEDTA(pH=8.0) 1ml加水至100ml，用滤纸过滤，4℃保存。用时加入leupeptin（终浓度为10μg/ml）及aprotinin（终浓度为10μg/ml）蛋白酶抑制剂配成蛋白裂解液。100mMPMSF：PMSF 17.42mg加无水乙醇至1ml，-20℃保存。1.5MTris-HCl（pH=8.8）:Tris 碱 90.8g去离子水 400ml溶解后，加浓盐酸调pH至8.8，然后定容至500ml。0.5MTris-HCl（pH=6.8）:Tris 碱 30.3g去离子水 400ml溶解后，加浓盐酸调pH至6.8，然后定容至500ml。10%APS：APS 0.1g加去离子水至1ml，现配现用。2×蛋白上样缓冲液：0.5MTris-HCl(pH=6.8) 1.25ml甘油 2.5ml20%SDS 1ml0.5%溴酚蓝 0.2ml加去离子水至10ml，-30℃保存。使用前加入β-巯基乙醇（终浓度为5%）。10×蛋白电泳缓冲液：Tris碱 30.3g甘氨酸 144gSDS 1%w/v加去离子水至1L。使用时稀释成1×电泳缓冲液。1×蛋白转膜缓冲液：Tris碱 3.03g甘氨酸 14.4g甲醇 200ml