中小学校体育工作评估自评结果报表(学校)(完整版)实用资料

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附件4中小学校体育工作评估自评结果报表(学校)（完整版）实用资料(可以直接使用，可编辑完整版实用资料，欢迎下载）中小学校体育工作评估自评结果报表单位全称（公章）：校长主管校长教务（体育）主任体育组长体育教师数体育教师缺额人数体育教师平均周课时年级班数学生人数年级班数学生人数年级班数学生人数年级班数学生人数一年级四年级七年级高一二年级五年级八年级高二三年级六年级九年级高三各项指标评估结果序号评估指标内容（要点）得分存在主要问题1成立领导小组，定期研究工作2将体育纳入学校整体工作计划3建立意外伤害应急管理机制4校长将学校体育列入工作职责5校长、分管校长听体育课次数6严格落实体育与健康课时规定7公布阳光体育运动工作方案8每学期通报学生体育活动情况9体育教学计划、单元计划等齐全10依据课程标准组织体育教学11加强教学研究与课程教学改革12严格执行体育课考勤、考核制度13制订阳光体育运动工作方案14将校园体育活动纳入教学计划15落实大课间体育活动等时间16学校每年召开春、秋季运动会1785%学生掌握至少2项体育技能18对学生加强体育安全教育19体育教师数量达到规定标准20体育教师职务评聘公平、公正21体育教师工资待遇、工作服装22体育活动、测试纳入教学工作量23体育教师集体备课、校本教研24体育教师参加培训、继续教育25体育场地、器材、设施达标26体育场地平整、整洁，符合要求27体育场馆管理规范，安全运行28体育场地、器材等有专人负责29课余、假日体育场馆向学生开放30公用经费满足学校体育需要31做好全体学生体质健康测试32妥善保存体质健康测试数据33按要求上报体质健康测试数据3495%以上学生达到标准合格等级3540%以上学生达到标准良好等级36每年公布健康测试总体结果37健康水平列入综合素质档案38分析测试结果，把握体质趋势加分项目加分得分总计自评等级请对应《中小学校体育工作等级评估指标体系》进行自评，并填写此表。此表一式两份，报送上级教育部门一份，学校存档一份。校长签字：填报人：联系：填报日期：年月日各乡镇中心学校、县直各学校：请按填表要求据实、分学校填报后由乡镇汇总，将学校自评表和汇总表一并上报（电子稿、纸质稿各一份，纸质稿加盖学校公章），县直学校直接上报。各学校、各乡镇可以附简洁的文字总结近一年的学校体育工作新做法、亮点和取得的突出成效，作为评优的依据。请各单位于2021年12月19日前上报（纸质稿交局405办公室，电子稿传QQ:67798598,联系教育管理股2021年12月12日附表2中小学校体育工作评估自评结果报表单位全称（公章）：校长主管校长教务（体育）主任莫中华体育组长体育教师数3体育教师缺额人数0体育教师平均周课时16年级班数学生人数年级班数学生人数年级班数学生人数年级班数学生人数一年级四年级七年级8563高一二年级五年级八年级8677高二三年级六年级九年级8623高三各项指标评估结果序号评估指标内容（要点）得分存在主要问题1成立领导小组，定期研究工作22将体育纳入学校整体工作计划23建立意外伤害应急管理机制14校长将学校体育列入工作职责15校长、分管校长听体育课次数26严格落实体育与健康课时规定77公布阳光体育运动工作方案28每学期通报学生体育活动情况39体育教学计划、单元计划等齐全410依据课程标准组织体育教学511加强教学研究与课程教学改革312严格执行体育课考勤、考核制度313制订阳光体育运动工作方案214将校园体育活动纳入教学计划215落实大课间体育活动等时间316学校每年召开春、秋季运动会31785%学生掌握至少2项体育技能418对学生加强体育安全教育119体育教师数量达到规定标准320体育教师职务评聘公平、公正321体育教师工资待遇、工作服装222体育活动、测试纳入教学工作量223体育教师集体备课、校本教研224体育教师参加培训、继续教育225体育场地、器材、设施达标126体育场地平整、整洁，符合要求227体育场馆管理规范，安全运行228体育场地、器材等有专人负责229课余、假日体育场馆向学生开放230公用经费满足学校体育需要331做好全体学生体质健康测试332妥善保存体质健康测试数据133按要求上报体质健康测试数据13495%以上学生达到标准合格等级53540%以上学生达到标准良好等级436每年公布健康测试总体结果237健康水平列入综合素质档案238分析测试结果，把握体质趋势1加分项目加分得分总计97自评等级A请对应《中小学校体育工作等级评估指标体系》进行自评，并填写此表。此表一式两份，报送上级教育部门一份，学校存档一份。填报日期：2021年10月27日水稻纹枯病病情调查周报表时间地点调查人田号类型田品种生育期调查丛数病丛数调查总株数病株数严重度分级病情指数备注012345平跳25丛平跳25丛平跳25丛平跳25丛合计稻飞虱田间虫情调查记载表时间地点调查人田号类型田品种生育期调查丛数成虫若虫蜘蛛备注白长白短褐长褐短白高白低褐高褐低20丛20丛20丛20丛合计二化螟田间为害情况调查表时间地点调查人田块序号类型田品种生育期调查丛数调查株数枯心株数50丛株数残虫数折合亩残虫量残虫分级情况备注平跳50丛稻曲病为害情况调查表时间地点调查人田块序号类型田品种生育期调查丛数调查株数病株数病丛数备注平跳50丛水稻纹枯病RiceSheathBlight水稻纹枯病又称“花秆”、“烂脚病”、“富贵病”等。主要分布于亚洲稻区，非洲和美洲等也有发生。我国发生普遍，以长江流域一带和南方稻区危害较重。发病后叶片枯死，结实率下降，千粒重减轻，秕谷增多，一般减产10%~30%，严重时达50%以上。此病在南方稻区所引致的总损失往往超过稻瘟病、白叶枯病，成为水稻的第一大病害。症状从苗期到穗期都会发生，以分蘖盛期到穗期受害最重，尤以抽穗期前后危害更烈。主要危害叶鞘，也可危害叶片。严重时，可深入茎秆内部引起植株倒伏。在抽穗前如严重发生，可造成植株不能正常抽穗而出现“胎里死”；当菌丝蔓延至穗顶，可造成瘪谷，有时形成白穗，甚至引起植株枯死。叶鞘发病，先在近水面处出现水渍状、暗绿色、边缘不清楚的小病斑，以后逐渐扩大成椭圆形或云纹状的病斑，中部灰绿色至灰褐色，最后病斑中部呈草黄色至灰白色，潮湿时则呈灰绿色至墨绿色，边缘呈褐色至暗褐色，外圈稍湿润状，经常几个病斑相互愈合成云纹状大斑块。重病鞘上的叶片常发黄或枯死。叶片上的病斑与叶鞘相似，但形状不规则。病情发展慢时，病斑外围褪黄；病情发展迅速时，病部暗绿色似开水烫过，叶片很快呈青枯或腐烂状。由于新叶片分蘖经叶鞘而出，当叶鞘受病时，就容易感染叶片或分蘖，所以病害常从植株下部向上部蔓延。稻穗发病，穗颈、穗轴以至颖壳等都呈污绿色湿润状，受害较轻的穗呈灰褐色，结实不良，出现部分黑褐色瘪谷。受害较重时，常不能抽穗，造成“胎里死”，或全穗枯死。在阴雨多湿的情况下，病部长出白色或灰白色的蛛丝状菌丝体。菌丝体匍匐于组织表面或攀缘于邻近植株之间，形成白色绒球状菌丝团，最后变成褐色坚硬菌核。菌核以少数菌丝缠结在病组织上，很易脱落。在潮湿条件下，病组织表面有时常生一层白色粉末状子实层（担子和担孢子）。此病的诊断要点为病斑云纹状，后期生鼠粪状菌核。病原图1-3水稻纹枯病菌(示担子及担孢子)学名：有性态为佐佐木薄膜革菌Pelliculariasasakii（Shirai图1-3水稻纹枯病菌(示担子及担孢子)病原形态：无性态产生菌丝和菌核，有性态产生担子和担孢子。菌丝体初期无色，老熟时变成淡褐色，直径为8~12m，分枝与主枝成锐角，分枝处显著缢缩，距分枝不远处有分隔。菌丝能在寄主组织内生长，也可蔓延于植株的病部表面。病组织表面的气生菌丝体可结成菌核。菌核单个呈扁球形似萝卜籽状，多个连结在一起呈不规则形，附在病部的一面略凹陷，直径1.5~3.5mm。菌核表面粗糙多孔如海绵状，菌核萌发时菌丝可从这些孔伸出（萌发孔）；菌核内外颜色一致，均为褐色。但外层结构为10~15层死细胞腔所组成，内层则为活的细胞群。内外层的厚薄影响菌核在水中的沉浮，即外层比内层厚时为浮核，反之则为沉核。一般浮核多于沉核。担子及担孢子在病组织上形成灰白色粉状子实层。担子无色，倒棍棒状，大小为8~13m×6~9m，顶端生有2~4个小梗，其上各生一个担孢子。担孢子无色，单胞，卵圆形或椭圆形，基部稍尖，大小为6~10m×5~7m。病原生物学：菌丝生长的温度范围为10C~38C，适温30C左右，致死温度为53C，5min。病菌侵入寄主的温度范围为23~35C，适温28~32C。在适温下，如有水分，病菌经18~24h即可完成侵入。菌核在12~15C时开始形成，以30~32C之间为最多，超过40C就不能形成。在各种不同冬作物的稻田中，土表或土层的越冬菌核存活率达96%以上，在土表下1~3cm的菌核存活率也在87.8%以上，在室内干燥条件下保存8~20个月的菌核，萌发率达80%；在室内土层下保存32个月的菌核，萌发率仍可达50%；保存11年的“浪渣”菌核，萌发率仍有27.5%。菌核萌发与温度密切相关。20C、25C、30C、35C时的萌发率分别为44%、47%、52%、63%。菌核在55C下经8分钟死亡。病菌在pH2.5~9.8间均能生长，最适pH5.6~6.7。日光能抑制菌丝的生长，但可促进菌核的形成。病原菌生理分化：根据菌丝融合亲和现象，病菌可分为9个菌丝融合群（Anastomosisgroup，AG），其中AG-1群侵染水稻，专化性明显。根据对16个水稻品种的毒力差异，我国台湾省的300个菌株可区分为7个培养型和6个生理小种。江苏省农科院按培养性状和致病力把水稻上的病菌划分为3个类型，即A、B、C型，致病力顺序为A>B>C。病菌的寄主范围极为广泛，在自然情况下可侵染21科植物；除水稻外，还可侵害玉米、大麦、小麦、高粱、粟、甘蔗、甘薯、芋、花生、大豆、黄麻、茭白等作物以及稗、莎草、马唐草、游草等多种杂草；在人工接种条件下可侵染54科的210种植物。病害循环越冬：病菌主要以菌核在土壤中越冬，也能以菌丝和菌核在病稻草、其他寄主和田边杂草上越冬。水稻收割时大量菌核落入田间，成为次年或下季的主要初侵染源。在南部稻区，一般发病田存留土中的菌核数每667m2达5~10万粒，重病田可达60-~80万粒，甚至100万粒以上。侵入与再侵染：春耕灌水后，越冬菌核飘浮于水面，栽秧后随水漂流附着稻株基部叶鞘上，在适温、高湿条件下，萌发长出菌丝，在叶鞘上延伸并从叶鞘缝隙处进入叶鞘内侧，先形成附着胞，通过气孔直接穿破表皮侵入。潜育期少则1~3d，多则3~5d。病菌侵入后，在稻株组织中不断扩展，并向外长出气生菌丝，蔓延至附近叶鞘、叶片或邻近的稻株进行再侵染。病菌在感病品种上接种后6h，先在接种处叶鞘外表面上纵向或横向生长，并不断产生分枝，分枝顶端形成新菌丝；接种后12~18h，一些菌丝分枝顶端膨大形成足状附着胞，且许多菌丝体纠集在一起形成侵入垫；接种后24h左右，可观察到菌丝从表皮细胞间缝隙或穿透细胞壁侵入到寄主内部，或直接通过气孔侵入到寄主内部；接种36h后，菌丝在薄壁细胞与气腔内生长蔓延。此时，用肉眼可观察到叶鞘表面出现水渍状病斑；接种48h后，随着病斑的进一步扩大，菌丝体逐渐扩展，维管束细胞中出现大量菌丝，一些薄壁细胞及导管细胞出现解体；接种72h后，在病菌上下扩展的同时，向纵深发展，侵入深层叶鞘，并在组织内大量扩展。一般在分蘖盛期至孕穗初期，如条件适宜此病在株间或丛间不断地横向扩展（称水平扩展），以孕穗期最快，导致病株率或病丛率的增加。其后病部由下位叶鞘向上位叶鞘蔓延扩展（称垂直扩展），以抽穗期至乳熟期最快。条件适宜时，在高秆品种上每上升一个叶位约需3~5d，在矮秆品种上只需2~3d。到抽穗前后10d左右达高峰期，危害性也最大。除气生菌丝外，病部形成的菌核脱落后，可随水飘漂附在稻株基部，萌发产生菌丝，也能引起再侵染。在南方稻区，早稻上的菌核可作为晚稻的初侵染源。灌溉水是田间菌核传播的动力，密植的稻丛是菌丝体再侵染的必要条件。病菌的担孢子在培养基上长出的菌丝再进行接种，可以引起发病，但其在自然情况下的作用尚不清楚；国内研究认为，担孢子往往在病情急剧上升之后的出现率高，其盛衰不足以影响病情的消长。发病条件纹枯病的发生和危害受菌核基数、气象条件、稻田生态、种植密度、水稻抗病性特别是水肥管理等多种因素的影响。菌核基数：田间越冬菌核残留量的多少与稻田初期发病轻重有密切关系。上季或上年轻病田，打捞菌核彻底的田块和新垦田，一般发病轻；反之，历年重病田区，上季或上年重病田，越冬菌核残留量多，初期发病也较多。但此后病情的继续发展，则受稻田小气候及水稻抗性的影响更大。据估计，水稻田在收获后整地前，菌核数可达237~263万粒/hm2，整地后下降至202~226万粒/hm2。据江西农科院调查，菌核量为75、150、300、600和120万粒/hm2时，早稻品种泸红早的病情指数分别为25.79、27.69、34.68、37.23和42.39。可见，病情指数与菌核量成直线关系。气象条件：纹枯病属高温高湿型病害。在适宜侵染发病的温度范围内，湿度越大，发病越重。田间小气候湿度为80%时，病害受到抑制；71%以下时病害停止发展。我国稻区广阔，地理、气候差异很大，此病的始病期和田间病情消长与当地气候密切相关。一般平均气温稳定在22C以上，水稻处于秧苗期或分蘖期即可发病。珠江三角洲在早稻苗期出现，长江流域则在早稻分蘖期，华北稻区在分蘖盛期，黑龙江省则在孕穗期前后出现始病期。决定水稻纹枯病流行的关键生态因素是雨湿，其中以降雨量、雨日、湿度（雾、露）为最重要。雨日多，相对湿度大，发病重；反之，发病轻。当稻田郁闭时，株间湿度常比大气湿度高，对病害发展就更有利。这些因素如与水稻易感的生育阶段孕穗期至抽穗期相吻合，病害流行程度就更严重。华南及长江中、下游稻区，常年雨量多集中在夏季，早稻纹枯病发病较重。晚稻如遇秋雨多、寒露风较不明显的年份，发病亦重。不论南、北稻区，此病发生的高峰期总在抽穗前后，北方流行期稍晚而短，南方流行期早而长，发病较重。当日平均温度在20C以下时，病害会受到抑制。除云南南部和海南岛等稻区受旱季控制外，我国其他各稻区均受秋寒影响而使病害停止。水肥管理：水肥管理对菌丝生长和稻株抗病性的影响是决定发病轻重的主要因素之一。长期深水灌溉，稻丛间湿度加大，有利于病害的发展。当稻田相对湿度在95%~100%时，病害发展迅速；86%以下时病害发展缓慢。管水也是控制无效分蘖的一项措施，可增加田间通透性，降低湿度，提高光合作用，增强抗病力。施肥对纹枯病的影响一般与稻瘟病相似。施氮肥过多、过迟，使稻株内部纤维素、木质素减少，节间伸长，茎秆变细，组织软弱，不仅有利于病菌侵入，而且易引起倒伏，致使病害发生更重，氮素过多也使稻株茎叶茂盛，田间湿度加大，有利于发病。种植方式和密度：一般而言，插植苗数多、密度高时，株间湿度高，适于菌丝生长蔓延，而且光照差，光合效能低，不利于稻株积累足够的碳水化合物，抗病能力差。为了丰产抗病，必须在保证有效穗的基础上调正密度和改进插植方式。水稻抗病性及生育期：现有的水稻材料多为感病或中感，但感病程度有差异，少数中抗，未发现免疫和高抗品种。一般矮秆阔叶型比高秆窄叶型感病，粳稻比籼稻感病，糯稻最感病；在相同条件下，杂交稻比常规品种病重；一般生育期较短的品种比生育期长而迟熟的品种发病重；植株矮、分蘖能力强的发病重。密度高，叶片接触频率高，有利菌丝向水平蔓延，稻株矮有利于菌丝垂直蔓延危害。蜡质层厚的品种因可阻断菌丝与寄主表面上的一些化学刺激因子的接触，因抑制菌丝体的生长或侵入机构的形成，发病较轻。另外，水稻品种体内细胞硅化程度高、纤维素和木质素含量多的，过氧化物酶活性和多酚氧化酶活性高，抗病性也相应增强。比较抗病的品种有：羽禾、冬秋布、咸运、S-1092、华南15、Tetep、IET4699、Jawa14、IR64、Guyanal、Ta-poo-cho-z等，可考虑用作杂交亲本。水稻生育期和组织的老嫩与发病程度有一定关系。一般2~3周龄的叶鞘和叶片耐病，抽穗以前上部叶鞘叶片较下部叶鞘叶片抗病；水稻孕穗、抽穗期较幼苗及分蘖期感病。除天气条件影响外，还有另外两方面的原因：一是稻株本身在孕穗抽穗期，新根数量少，根系活力降低，上部叶鞘叶片中的有机化合物主要运向籽粒部分，抗病力弱；乳熟期后，下部老叶逐渐枯死，上部叶片逐渐衰老，病情发展缓慢，至黄熟期基本停止。二是稻株在孕穗抽穗期后，叶片面积最大，田间湿度也大，加上叶鞘与茎秆之间相对松散，利于菌丝生长以及病菌从内侧侵入。后期，因老叶枯死，丛间湿度下降，病情发展速度减慢。病害控制防治纹枯病的策略是挖掘抗源，培育和应用中抗以上品种，加强栽培管理，适时施用化学农药和生防制剂。1.清除菌源在秧田或本田翻耕灌水耙平时，大多数菌核浮在水面，混杂在“浪渣”内，被风吹集到田角和田边，用布网或密簸箕等工具打捞“浪渣”并带出田外烧毁或深埋。不直接用病稻草和未腐熟的病草还田，铲除田边杂草，可减少菌源，减轻前期发病。2.加强肥水管理根据水稻的生育时期、天气、稻田水位高低、土壤性质、水利条件等情况，合理排灌，以水控病，彻底改变长期深灌高湿的环境，做到浅水发根、薄水养胎、湿润长穗，其中尤以分蘖末期至拔节前进行适时搁（晒）田、后期干干湿湿的排灌管理，降低株间湿度，促进稻株生长健壮，对控制纹枯病的危害效果显著。对深泥田、冷浸田和肥田宜重晒，对沙性田则应轻搁，对稻苗旺、封行早的稻田宜分次搁。氮、磷、钾要配合施用，做到农家肥与化肥，长效肥与速效肥相结合，切忌偏施氮肥和中、后期大量施用氮肥。应前期发得起、中期站得稳、后期不脱肥，做到水稻前期不披叶、中期不徒长、后期不贪青，收割时青秆黄熟。对连作早稻田宜前重、中巧、后补，单季晚稻田宜两头重、中间轻，连作晚稻田宜基肥足、追肥早而速的肥料分配方式。南方红壤土酸性重并严重缺乏磷、钾，除种植绿肥增施有机肥以改造土壤外，应特别增施磷、钾肥和石灰。对绿肥较多的田块，应尽可能促使绿肥提早腐烂，以防稻株前期发僵，后期发苗过旺，引起发病。3.种植抗病品种尽管目前尚未发现高抗和免疫的品种，但品种间抗性存在差异，在病情特别严重的地区可以种植一些中抗品种。此外，应积极利用现代分子生物学手段，创造抗病材料，将外源抗病基因导入水稻品种中。4.药剂防治一般在水稻分蘖末期，丛发病率达5%或拔节至孕穗期丛发病率为10%~15%的田块，需要采用补救措施。前期（分蘖末期）施药在于抑制气生菌丝生长，控制病害的水平扩展；后期（孕穗期至抽穗期）施药在于抑制菌核的形成和控制病害的垂直扩展，保护稻株顶部功能叶不受侵染。①在水稻封行后至抽穗期间，或病情盛发初期，喷施井冈霉素，每hm2用药67.5~75.0g（a.i），间隔10~15d，针对稻株中、下部兑水喷雾或泼浇施药1~3次。②在分蘖盛期至圆秆期，用甲基硫菌灵兑水喷雾2~3次，每hm2用900g有效成分。③在水稻破口期和齐穗期各施药1次28%复方多菌灵（多井悬浮剂），如病情严重时可间隔10~15d再喷1次，每hm2用375~410g有效成分。④在分蘖盛期至拔节期用5%安福（已唑醇），每hm2用药60~75g（a.i）喷雾，可保持药效4周以上。⑤在发病初期喷施芽孢生防菌株B908，每hm2用7.5kg，可取得明显效果。另外，美国罗门哈斯公司生产的满穗对该病也具有较好的防治效果。0引言水稻(OryzasativaL.源于淡水沼泽植物，因此对盐较为敏感。水稻作为中国第一大粮食作物，现正面临可耕种面积逐渐缩小的尴尬。一些因素导致的土壤盐碱化也是导致水稻耕种面积缩小的原因之一。在亚洲，2150hm2水稻受到盐胁迫的危害，而且这种情况仍在不断加剧。因此，研究、培育耐盐水稻品种，提高土地利用率，从而扩大水稻种植面积，提高水稻产量已刻不容缓。目前，国内外已克隆了一些耐盐相关基因，并转化水稻，获得了耐盐性较高的转基因水稻。此文就转耐盐基因水稻及耐盐相关新基因克隆的研究现状做简要综述。1耐盐转基因水稻研究基因工程技术的诞生使得水稻育种变得容易，通过将耐盐基因转化到盐敏水稻品种中提高了盐敏水稻对盐的耐受能力。1.1渗透相关基因植物在盐胁迫下，细胞会代偿性地增加一些相容性物质，降低细胞的渗透势，保护酶和细胞膜结构，清除氧自由基[1]。这些物质包括：脯氨酸、甜菜碱、果糖、蔗糖、多胺等。它们具有较强的亲水力，可以代替蛋白质、蛋白复合物或膜表面的水[1]。基金项目：福建农林大学校青年教师基金(06B03。第一作者简介：陈煜，女，1977年出生，四川泸州人，讲师，硕士，主要从事植物分子生物学研究。通信地址：350002福建福州金山福建农林大学生命科学学院，TelE-mail：chenyuyu521@126。通讯柯玉琴，女，1954年出生，福建莆田人，教授，大普，主要从事植物逆境生理生化研究。通信地址：350002福建福州金山福建农林大学生命科学学院，TelE-mail：yuqin_ke@163。收稿日期：2021-01-06，修回日期：2021-02-27。水稻耐盐相关基因的克隆及转化研究进展陈煜，杨燕凌，谢小芳，柯玉琴（福建农林大学生命科学学院，福州350002）摘要：盐分是影响水稻生长发育的重要环境因素之一。伴随工业化进程及淡水资源的匮乏而出现的土壤盐碱化是当今水稻育种需要突破的一个难点。在此背景下，克隆耐盐基因和培育耐盐转基因水稻成为水稻育种的新的技术手段。作者在耐盐转基因水稻研究、耐盐相关新基因的克隆两个方面进行了综述，以期能使水稻育种科技人员对该领域有较为全面的了解，同时能为他们的科研工作提供一些借鉴。最后，对盐胁迫下转基因水稻的前景以及存在的问题进行了展望和讨论。关键词：水稻；耐盐基因；基因克隆；转基因水稻；研究进展中图分类号：S511文献标志码：A论文编号：2021-0053ResearchProgressonCloningandTranslationoftheSaltResistanceGenesinRiceChenYu,YangYanling,XieXiaofang,KeYuqin(CollegeofLifeScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002Abstract:Salinityisoneofthefactorswhichaffectthegrowthanddevelopmentofrice.Atpresent,Soilsalinization,whichfollowedwiththeindustrializationprogressandthelackoffreshwaterresource,becameonedifficultpointinthericebreeding.Insuchsituation,cloninggenesofsalinityresistanceandraisingtransgenicriceofsalinityresistancearethenewmethodsforricebreeding.Transgenicricewithsalinityresistanceandnewgenesclonedrecentlywerereviewedastosupporttotallycomprehensionandadviceforresearchers.Atlast,prosperityoftransgenicricewithsaltresistancewaspredictedandtheproblemsexistinitwerediscussed.Keywords:rice(OryzasativaL.;saltresistancegenes;geneclone;transgenicrice;researchprogress中国农学通报2021,26(11:23-27ChineseAgriculturalScienceBulletin1.1.1脯氨酸脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，分布最广的渗透调节剂。它不仅作为渗透调节剂降低细胞质的水势，维持胞质的水分状况，还是一种保护剂，使胞内大分子物质免受盐离子的毒害[2]。而且还参与氮代谢和能量代谢[3]。P5CS(2-氢吡咯-5-羧酸合成酶基因是一个双功能基因，编码γ-谷氨酰激酶(γ-GK和谷氨酸-5-半醛脱氢酶(GSA两种酶，催化从谷氨酸合成脯氨酸的最初两步反应。Anoop等[4]成功地把P5CS基因转入水稻中，并发现转基因水稻植株表现为较好的根生长和较高的生物量。1.1.2甜菜碱甜菜碱(GB是生物界广泛存在的细胞相容性物质，作为细胞的渗透调节剂，发挥平衡液泡中水势的功能，并对细胞内大分子物质起保护作用，从而维持细胞正常的生理功能。盐胁迫下，水稻细胞中会大量积累GB，以维持细胞内外的渗透平衡，其积累水平与植物抗胁迫能力成正比。其合成途径是由胆碱经由甜菜碱醛生成甜菜碱，需要胆碱单氧化酶(CMO和甜菜碱醛脱氢酶(BADH催化[5]。Shirasawa[6]用农杆菌将菠菜(Spinaciaoleracea的CMO转化水稻，结果发现：转基因水稻GB含量增加，而且提高了对盐胁迫、温度胁迫的耐受性。Su等[7]制备了几种产GB的转基因水稻。在这些转基因水稻中，分别使用了ABA-诱导的启动子(SIP和泛素蛋白(UBI基因启动子，使胆碱氧化酶基因(COX与叶绿体打靶序列(TP融合表达。发现应用SIP的种系的GB水平(2.60μmol/gDW不如UBI种系的高(3.12μmol/gDW。因此，应用ABA-诱导启动子在GB的初始生产方面并不合适。但是，SIP种系在盐生长环境中提高了GB的积累达89%，然而UBI种系只有44%。尽管GB浓度较低，但在统计学上发现，SIP种系比UBI种系能够产生更强的胁迫耐受水平，暗示在SIP种系中发现的胁迫保护不能完全用所增加的GB含量来解释。而甜菜碱醛脱氢酶(BADH对植物细胞中甜菜碱的合成和积累有直接的作用。1990年Weretilnyk等[8]从菠菜中首次克隆了BADH的cDNA。郭岩等[9]应用基因枪法将含盐生植物山菠菜(AtriplexhortensisBADH基因的植物双元表达载体导入粳稻中花8号中，得到的转BADH基因水稻植株具有较高的耐盐性。1.1.3糖醇糖醇作为相容性溶质在渗透调节和渗透保护中起重要作用。王慧中等[10]通过农杆菌介导法将1-磷酸甘露醇脱氢酶(mtlD基因，6-磷酸山梨醇脱氢酶(gutD基因同时整合进水稻基因组并且在转基因水稻中得到表达，气相色谱分析证明转基因水稻合成并积累了甘露醇和山梨醇。与未转基因对照相比，转基因植株耐盐性明显提高。1.2功能蛋白相关基因LEA基因是在种子成熟和发育阶段表达的基因，称为晚期胚胎发生丰富蛋白基因，在种子发育过程中的胚胎晚期引起LEA蛋白的高度富集。在植物受到盐胁迫后造成脱水的营养组织中也有所表达。LEA基因表达与植物的环境胁迫成正相关。在胁迫条件下，LEA蛋白对植物细胞起保护作用。在ABA和盐诱导下，LEA蛋白在耐盐的水稻根部有积累而在盐敏感品种中没有积累[11]。Xu等人[12]将大麦的LEA-2基因HVA1转入水稻，转基因水稻获得高耐盐性。钙依赖/钙调素不依赖的蛋白激酶(OsCDPK7是一种依赖于Ca2+的参与寒冷与盐胁迫的正向调节因子。已有资料报道OsCDPK7在根的中柱和花冠维管束中大量表达，同时，该基因也在花冠维管束鞘以及根的厚壁组织中表达。Saijo等[13]制备了过量表达OsCDPK7基因的转化体，转化体中加入了花椰菜病毒35S启动子，证实了上述结果。OsbZIP23是水稻亮氨酸拉链转录因子家族成员之一，为研究其功能和细胞内的定位，Xiang等[14]将其转化酵母细胞，发现OsbZIP23作为转录激活因子而发挥功能。用OsbZIP23-绿色荧光蛋白在洋葱(Alliumcepa细胞中的瞬时表达确定了该蛋白在核内的定位。同时还发现，表达OsbZIP23的转基因水稻表现出对干旱、高盐很强的耐受性以及对ABA的敏感性。而且，该基因的无效突变体对高浓度的ABA、高盐和干旱胁迫表现出明显的敏感性降低及耐受性降低，该表型可通过将OsbZIP23转导该突变体而得到弥补，暗示其在胁迫耐受的遗传改良方面具有潜在的应用价值。质外体蛋白在水稻盐胁迫中也扮演了重要角色。Zhang等[15]用200mmol/L的NaCl对10日龄的水稻进行处理，然后用二维蛋白质电泳对抽提的质外体进行了分析，发现其中一个质外体蛋白具有富含半胱氨酸功能域(DUF26的胞外结构域——OsRMC。该蛋白在盐胁迫的初期对盐胁迫的应答提高非常明显。应用RNAi技术，确定了其在转基因水稻盐胁迫应答中的功能。结果表明，与非转基因水稻相比，在转基因水稻中下调OsRMC的表达水平能够使种子发芽缓慢、生长抑制情况得到缓解，同时提高了水稻对NaCl盐胁迫的耐受性。1.3Na+/H+反向转运蛋白基因Fukada[16]等首次从单子叶植物水稻中克隆得到了水稻液泡膜Na+/H+逆向运输蛋白基因OsNHX1。为确定OsNHX1的产物在细胞内的定位，Fukuda等[17]利用OsNHX1产物的特异性抗体对其具体定位进行了分析，结果发现OsNHX1的表达产物定位于液泡膜，结果暗示了OsNHX1基因编码液泡(Na+、K+/H+反向转运体。高浓度的NaCl和KCl处理都可以提高OsNHX1在水稻根和地上部的OsNHX1的转录，OsNHX1受盐和甘露醇处理诱导表达，过量表达OsNHX1可以提高水稻的耐盐性[17]。Ohta[18]利用耐盐植物野滨藜(Atriplexfera的液泡膜逆向转运蛋白AgNHX1过量表达，提高转基因水稻的耐盐性。液泡膜上的OsNHX1在将Na+以及积累于细胞质中的K+运送到液泡的区室化过程中扮演了重要的角色，说明反向转运体的数量是决定水稻盐胁迫的重要因素。Kader等[19]研究发现OsHKT2(K+/Na+共转运体和OsVHA(盐胁迫下液泡Na+/H+反向转运体的激发器的诱导多数发生于韧皮部、韧皮部到叶肉细胞的过渡部分和叶片的叶肉细胞。邱生平等[20]通过RT-PCR技术从水稻幼苗组织中克隆了一个新的Na+/H+逆向转运蛋白基因OsNHX2，结果表明，水稻2个液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因OsNHX2、OsNHX1在盐敏感程度不同的水稻品种中表达有所不同，液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的转录调控可能是决定水稻耐盐能力的一个重要因素。1.4其他基因Katsuhara[21]将大麦的HvPIP2;1基因转入水稻，得到转基因水稻。HvPIP2;1的过量表达提高了水稻根的保水性达140%，茎杆到根的达到150%。使得生长在100mmol/LNaCl盐胁迫下的转基因水稻，生长速度大于非转基因植株。Hu[22]通过研究展示了胁迫应答基因SNAC1的过量表达明显提高了转基因水稻对干旱的耐受性(比对照组的发芽率高22%~34%，这些水稻是生长于大田、处于极度干旱胁迫的条件下，且处于发育阶段，没有表型变化和产量上的损失。转基因水稻在幼苗期表现出对干旱和盐的耐受性的明显提高。SNAC1主要在保卫细胞中通过干旱诱导表达出来，编码具有转录激活活性的NAM，ATAT和CUC(NAC转录因子。DNA芯片分析显示，在过量表达SNAC1的水稻中，大量胁迫相关基因表现出上调。数据暗示SNAC1在通过水稻对干旱和盐的耐受方面具有良好的应用前景。2耐盐相关新基因的克隆建立盐胁迫下水稻的cDNA文库是筛选盐胁迫相关基因的最佳方法。Qian等[23]构建了盐胁迫下和没有盐胁迫的水稻cDNA文库，通过差异筛选得到3个盐胁迫应答克隆，Ts1、Ts2、Ts3这3个克隆分别定位于1、3、7号染色体上。Northernblotting分析显示在盐胁迫3h内Ts1和Ts2转录水平提高，并在24h内保持高水平，然而Ts3的转录水平在3h内达到高峰。Rabbani[24]等利用干旱、寒冷、高盐处理的水稻植株cDNA文库，建立了cDNA微阵列，微阵列中包含了1700种cDNA。最终他们鉴定了73个胁迫诱导基因，其中包括了58个新的未见报道的基因。其中，第36、62、57和43号基因分别是由寒冷、干旱、高盐和ABA诱导表达的。发现，胁迫应答基因的表达有很强的相关性，而且发现了对上述4种处理而应答的15个基因。分析发现，在因干旱、ABA和高盐胁迫而产生的信号路径之间有很强的相关性，该相关性比因寒冷、ABA胁迫或寒冷与高盐胁迫所引起的信号相关性强。同时转录组分析显示，水稻中存在与拟南芥中不同源的胁迫诱导基因。李子银等[25]利用差异显示PCR(RT-PCR技术从水稻中克隆了2个受盐胁迫诱导和1个受盐胁迫抑制的cDNA片段，分别代表了S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(SAMDC基因、水稻翻译延伸因子1A蛋白(eEF1A基因家族中的新成员(称为REF1A以及一个功能未知的新基因(命名为SRG1。进一步利用RT-PCR技术克隆了SAMDC基因的全长cDNA序列(SAMDC1，发现该基因序列与其他植物及酵母、人类的SAMDC基因均有一定的同源性。Northern杂交结果显示，SAMDC1和REF1A基因的转录均明显受盐胁迫诱导，而SRG1基因的转录在盐胁迫6h后即受到抑制。Southern杂交分析表明SAMDC1和SRG1基因在水稻基因组中均以单拷贝存在，而REF1A基因则检测到多个拷贝。利用ZYQ8/JX17组合构建的DH群体和RFLP图谱将REF1A，SAMDC1和SRG1基因分别定位在水稻第3，第4和第6染色体上。Lin等[26]通过用高度耐盐水稻品种与感盐品种构建的群体和分子标记进行耐盐QTL的定位分析，共定位得到11个控制水稻耐盐性状的QTL。发现其中有2个是遗传效果较大的主效QTL，一个是位于第1号染色体、控制盐胁迫下K+含量的SKC1，它通过增加K+(营养元素含量而有助于增加耐盐性；另一个是位于第7染色体、控制Na+含量的SNC7，它通过降低Na+含量而有助于增加耐盐性。Ren等[27]成功克隆了与水稻耐盐相关的数量性状基因SKC1，并阐明了该基因的生物学功能和作用机理。发现SKC1编码的蛋白是钠离子的特异性转运蛋白而不直接运输钾离子，钾离子含量的变化是由于钠离子竞争引起的；该蛋白定位于陈煜等：水稻耐盐相关基因的克隆及转化研究进展··25细胞膜上，在耐盐水稻品种中其功能活性明显强于感盐品种。这对水稻耐盐遗传育种研究有重要的学术意义和一定的应用前景。HAL3是前人在筛选酵母耐盐基因的过程中分离克隆的抗逆相关基因，研究发现其编码一种促进细胞分裂以及提高耐盐性的核黄素蛋白，其过量表达不仅可以提高植物的耐盐性，还可以加速植物的生长。Sun等[28]对水稻中HAL3同源基因OsHAL3开展了功能和作用机理研究发现，这一基因介导了一个与普通光受体模式不同的光控发育机制。这是第一次发现HAL3扮演细胞分裂信号传导的角色。Huang等[29]通过图位克隆方法分离克隆了控制抗逆性状的基因DST，该基因编码一个只含有一个C2H2类型锌指结构域的蛋白。过氧化氢是一种重要的诱导气孔关闭的信号分子。DST作为抗逆性的负调控因子，当其功能缺失时可直接下调过氧化氢代谢相关基因(如过氧化物酶基因的表达，使清除过氧化氢的能力下降，从而增加过氧化氢在保卫细胞中的累积，促使叶片气孔关闭，减少水分蒸发，最终提高水稻的抗旱耐盐能力。3问题与展望水稻基因组测序的完成是水稻研究的一个里程碑，使人类在基因组水平上对水稻有了更深入地了解，使得一些传统的学说、假说受到挑战，但这并不意味这所有问题能够迎刃而解。植物的耐盐机理较复杂，从植株水平到细胞水平、分子水平，涉及信号传递、基因调控、蛋白质翻译与表达等一系列复杂的体系。至今尚未能完全弄清楚。国内外学者从不同的角度去研究、分析与水稻盐胁迫有关的机理，已经取得了很大的进步。近年来进行了植物耐盐胁迫功能基因组的研究，即利用盐胁迫特异性的表达序列标签(EST和cDNA微阵列(或基因芯片技术筛选胁迫相关基因，然后在拟南芥中超量表达或通过基因敲除等技术对初步筛选的基因进行功能研究，再利用酵母双杂交等技术对基因间相互关系及基因产物间的相互作用做进一步研究[5]。水稻耐盐性状是数量性状，不仅仅是某个基因在单独发挥作用，可能是几个基因或更多基因起作用的结果。因此，采用复合基因策略有利于获取高度耐盐转基因植株。郭龙彪等[30]采用双价基因共转化和杂交选育的方法聚合了2~5价的耐盐基因，得到了不同耐盐能力的转基因植株。王慧中等[10]通过农杆菌介导法将mtlD、gutD基因同时整合进水稻基因组并且在转基因水稻中得到表达，与未转基因对照相比，转基因植株耐盐性明显提高。尽管转基因水稻的安全性仍颇具争议，但是转基因水稻将会在未来发挥其巨大作用。华中农大作物遗传改良国家重点实验室研发的2个转基因水稻品种“华恢1号”和“Bt汕优63”，已获得农业部下发的转基因水稻生产应用安全证书。安全证书的有效期为2021年8月17日—2021年8月17日，种植区域限定在湖北省[31]。这意味着未来3~4年间转基因水稻将进入商业化生产应用，在未来加强转基因的基础研究工作、转基因技术与常规育种技术的有机结合，转基因水稻的商业化生产。将来，一定能克服并解决因土壤盐碱化而带来的水稻种植问题甚至整个世界的粮食问题，为人类造福。参考文献[1]BohnertH,ShenJ.Transformationandcompatiblesolutes[J].SciHorticul,1998,78(1-4:237-260.[2]许祥明,叶和春,李国凤.脯氨酸代谢与植物抗渗透胁迫的研究进展[J].植物学通报,2000,17(6:536-542.[3]KishorKPB,SangamS,AmruthaRN,etal.Regulationofprolinebiosynthesis,degradation,uptakeandtransportinhigherplants:Itsimplicationsinplantgrowthandabioticstresstolerance[J].CurrentScience,2005,88(3:424-438.[4]AnoopN,GuptaAK.TransgenicindicariceCVIR-50overexpressingvignaaconitifolia-pyrroline-5-carboxylatelatesynthetasecDNAshowstolerancetohighsalt[J].JplantBiochemandBiotech,2003,12(2:109-116.[5]胡忠,曹军,庄东红.耐盐性植物转基因工程的研究进展[J].热带亚热带植物学报,2006,14(2:169-178.[6]ShirasawaK,TakabeT,TakabeT,etal.Accumulationofglycinebetaineinriceplantthatoverexpresscholinemonooxygenasefromspinachandevaluationoftheirtolerancetoabioticstress[J].AnnBot,2006,98(3:565-571.[7]SuJ,HirjiR,ZhangL,etal.Evaluationofthestress-inducibleproductionofcholineoxidaseintransgenicriceasastrategyforproducingthestress-protectantglycinebetaine[J].JExpBot,2006,57(5:1129-1135.[8]WetilnykEA,HansonAD.Molecularcloningofaplantbetaine-aldehydedehydrogenase,anenzymeimplicatedinadaptationtosalinityanddrought[J].ProcNatlAcadSciUSA,1990,87(7:2745-2749.[9]郭岩,张莉,肖岗.甜菜碱醛脱氢酶基因在水稻中的表达及转基因植株的耐盐性研究[J].中国科学:C辑,1997,27(2:151-155.[10]王慧中,黄大年,鲁瑞芳,等.转mtlD/gutD双价基因水稻的耐盐性[J].科学通报,2000,45(7:724-728.[11]MoonsA,BauwG,PrinsenE,etal.Molecularandphysiologicalresponsestoabscisicacidandaltsinrootsofsalt-sensitiveandsalt-tolerantIndicaricevarieties[J].PlantPhysiol,1995,107(1:177-186.[12]XuD,DuanX,WangB,etal.Expressionofalateembryogenesisabundantproteingene,HVA1,frombarleyconferstolerancetowaterdeficitandsaltstressintransgenicrice[J].PlantPhysiol,1996,110(1:249-257.[13]SaijoY,KinoshitaN,IshiyamaK,etal.ACa2+dependentproteinkinasethatendowsriceplantswithcold-andsalt-stresstolerancefunctionsinvascularbundles[J].PlantCellPhysiol,2001,42(11:1228-1233.[14]XiangY,TangN,DuH,etal.CharacterizationofOsbZIP23asakeyplayerofthebasicleucinezippertranscriptionfactorfamilyforconferringabscisicacidsensitivityandsalinityanddroughttoleranceinrice[J].PlantPhysiol,2021,148(4:1938-1952.[15]ZhangL,TianLH,ZhaoJF,etal.Identificationofanapoplasticproteininvolvedintheinitialphaseofsaltstressresponseinricerootbytwo-dimensionalelectrophoresis[J].PlantPhysiol,2021,149(2:916-928.[16]FukudaA,NakamuraA,TanakaY.MolecularcloningandexpressionoftheNa+/H+exchangergeneinOryzasativa[J].BiochimBiophysActa,1999,1446(1-2:149-155.[17]FukudaA,NakamuraA,TagiriA,etal.Function,intracellularlocalizationandtheimportanceinsalttoleranceofavacuolarNa+/H+antiporterfromrice[J].PlantCellPhysiol,2004,45(2:146-159.[18]OhtaM,HayashiY,NakashimaA,etal.IntroductionofaNa+/H+antiportergenefromAtriplexgmeliniconferssalttolerancetorice[J].FEBSLett,2002,532(3:279-282.[19]KaderMA,SeidelT,GolldackD,etal.ExpressionofOsHKT1,OsHKT2andOsVHAaredifferentiallyregulatedunderNaClstressinsalt-sensitiveandsalt-tolerantrice(OryzasativaL.cultivars[J].JExpBot,2006,57(15:4257-4268.[20]邱生平,周国安,陆驹飞.一个新的水稻液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆及表达特征[J].中国水稻科学,2006,20(2:119-124.[21]KatsuharaM,KoshioK,ShibasakaM,etal.Over-expressionofabarleyaquaporinincreasedtheshoot/rootratioandraisedsaltsensitivityintransgenicriceplants[J].PlantCellPhysiol,2003,44(12:1378-1383.[22]HuH,DaiM,YaoJ,etal.OverexpressingaNAM,ATAFandCUC(NACtranscriptionfactorenhancesdroughtresistanceandsalttoleranceinrice[J].ProcNatlAcadSciUSA,2006,103(35:12987-12992.[23]QianQian,SeijiYanagihara,Tengsheng,etal.Isolation,expressioncharacteristicsandchromosomallocationsofthreecDNAfragmentsundersaltstressinrice[J].ActaBotanicasinica,2003,45(9:1090-1095.[24]RabbaniMA,MaruyamaK,AbeH,etal.Monitoringexpressionprofilesofricegenesundercold,drought,andhigh-salinitystressesandabscisicacidapplicationusingcDNAmicroarrayandRNAgel-blotanalyses[J].PlantPhysiol,2003,133(4:1755-1767.[25]李子银,张劲松,陈受宜.水稻盐胁迫应答基因的克隆、表达及染色体定位[J].中国科学:C辑,1999,29(6:560-570.[26]LinHX,ZhuMZ,YanoM,etal.QTLsforNa+andK+uptakeoftheshootsandrootscontrollingricesalttolerance[J].TheorApplGenet,2004,108(2:253-260.[27]RenZH,GaoJP,LiLG,etal.Aricequantitativetraitlocusforsalttoleranceencodesasodiumtransporter[J].NatGenet,2005,37(10:1141-1146.[28]SunSY,ChaoDY,LiXM.OsHAL3mediatesanewpathwayinthelight-regulatedgrowthofrice[J].NatCellBiol,2021,11(7:845-851.[29]HuangXY,ChaoDY,GaoJP.Apreviouslyunknownzincfingerprotein,DST,regulatesdroughtandsalttoleranceinriceviastomatalaperturecontrol[J].GenesDev.,2021,23(15:1805-1817.[30]郭龙彪,薛大伟,王慧中.转基因与常规杂交相结合改良水稻耐盐性[J].中国水稻科学,2006,20(2:141-146.[31]生物谷.华中农大两个转基因水稻品种获得应用安全证书[EB/OL].[2021-12-06].://bioon/bioindustry/agriculture/422849.shtmL.陈煜等：水稻耐盐相关基因的克隆及转化研究进展··27微生物学通报AUG20,2021,35(8):1240~1245Microbiology©2021byInstituteofMicrobiology,CAStongbao@im.ac一株抗玉米纹枯病内生细菌的分离鉴定及其抗病促生作用辜运富1张云飞2张小平1*(1.四川农业大学资源环境学院雅安625014)(2.农业部成都沼气研究所成都610041)摘要:玉米纹枯病是玉米主要的真菌病害,从优良玉米品种川单13号中分离到一株对玉米纹枯病菌具有明显抑制作用并能够促进玉米生长的内生细菌。通过形态、生理生化特性分析以及16SrDNA序列同源性比较,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。盆栽试验表明,菌株能够抑制玉米纹枯病的发生,抑菌率为43.01%,促生试验表明,该菌能够显著促进玉米苗的生长,促生作用与植物生长刺激素(IAA)的效果相似,显示出良好的开发前景。关键词:玉米纹枯病,立枯丝核菌,内生细菌,16SrDNAIsolationandIdentificationofOneAnti-RhizoctonissolaniEndophyticBacteriaStrainfromCornandItsAntagonismandPromotingResearchGUYun-Fu1ZHANGYun-Fei2ZHANGXiao-Ping1*(1.CollegeofEnvironmentalandResourceScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014)(2.InstituteofBiogasScience,MinistryofAgriculture,Chengdu610041)Abstract:Thecornsheathblightwasthemainfunguspathogenofthecorn.OneendophyticbacteriastrainwhichcouldsignificantlyinhibitcornsheathblightandpromotecorngrowthwasisolatedfromChuandan13cornseeding.Accordingtomorphological,biophysiologicalandbiochemicalcharacteristicsand16SrDNAsequencehomology,thestrainwasidentifiedasBacillussubtilis,potexperimentsindicatedthestraincouldinhibitcornsheathblightfromhappening,theinhibitratecouldreach43.01%;promotinggrowthexperimentrevealedthatitcouldsignificantlypromotecornseedgrowth,thepromotingeffectwasequaltothatofIAA,whichshowedagooddevelopmentprospect.Keywords:Cornsheathblight,Rhizoctonissolani,Endophyticbacteria,16SrDNA玉米是中国三大粮食品种之一,年种植面积达到2500万公顷左右,年玉米产量达到1.2亿吨,播种面积和玉米产量都处于世界第二位。进入上世纪*通讯Tel:aumdwsb@收稿日期：2007-12-19;接受日期：2021-02-2190年代以后,由于播种面积的增加和杂交技术的广泛采用,我国玉米生产有了较快的发展。但是玉米的各种病虫害也逐渐增加起来。玉米纹枯病是由立辜运富等:一株抗玉米纹枯病内生细菌的分离鉴定及其抗病促生作用1241枯丝核菌(Rhizoctonissolani)引起的世界性玉米土传病害[1],是危害玉米的严重病害。目前,主要是用化学药剂防治该病,但是,长期单一使用化学药剂,不仅对环境造成极大的胁迫压力,同时也易使病原菌产生抗药性。内生细菌在植物体内具有稳定的生存空间,不易受环境条件的影响,可以在植物体内独立的分裂繁殖和传递,筛选有益的内生细菌有可能成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌加以利用[2−4]。植物内生细菌已成为近十年内微生物学研究的一大热点,国内外有关研究报道不断增加,其中关于内生细菌对宿主植物的抗病促生作用更是人们关注的热点问题[5,6],本文就一株玉米苗期内生细菌的分离、筛选和鉴定及其抗病促生作用报道如下。1材料与方法1.1材料1.1.1玉米品种：川单13号,由四川农业大学玉米研究所提供。1.1.2培养基：1)立枯丝核菌的培养以及拮抗实验均用马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基;2)拮抗内生细菌培养用肉汁胨(BPA)培养基。1.1.3病原菌：玉米纹枯病病原菌(Rhizotoniasolani)(AG1-AI)由四川农业大学植物病理学系提供。1.2方法1.2.1内生细菌的分离、纯化：1)取样：分别称取供试品种玉米苗的根、茎、叶(根部取离土表5cm内的材料,茎部选取离土表10cm~15cm内的材料,叶部则用打孔器随机选取各部材料)各5g。2)表面灭菌：经清水冲洗后置于95%的酒精3min~5min后转入含0.1%升汞液中消毒15min,消毒结束后立即用无菌水漂洗4次,取最后一次清洗液0.5mL转入无菌培养皿,倒入肉汁胨培养基,于28℃~30℃混菌培养3d~4d,以检测消毒是否彻底,3次重复。3)样品处理：用灭菌剪刀将表面无菌材料剪成2cm~3cm的小段后,转入盛有少量无菌水的无菌研钵,将植物组织分别研碎至汁液流出,用无菌纱布将汁液过滤至100mL无菌水的三角瓶中,得到第一个稀释度10−1,然后分别稀释到10−6,取不同稀释度的菌悬液0.5mL加入无菌培养皿中,倒入肉汁胨培养基于28℃~30℃温箱中混菌培养3d~4d,重复3次,记数。4)纯化和保存：挑取形态不同的菌落在固体肉汁胨平板上划线纯化、培养,然后将其转入含30%甘油的塑料离心管中于−70℃保存备用。5)内生性测定：参考蔡学清的方法[7],利用抗利福平标记进行回接测定。6)菌株CNBH稳定性检测：将菌株进行传代培养,测定菌株对立枯丝核菌的抑制效果,传代次数以获得稳定抑制效果为准。1.2.2抑菌作用测定：1)平板对峙法测定：无菌操作下将玉米纹枯病病原菌接种到PDA平板中央,在距离病原菌2.5cm处,接入待测内生细菌菌株,以仅接种病原菌的处理为对照,每个处理重复3次,观察菌落的生长变化,以抑菌圈大小和形状判断拮抗程度,最后筛选出1株拮抗效果最强的菌株(命名为CNBH)。2)盆栽实验：在每盆(d=24cm)土壤上覆盖15g玉米纹枯病菌的带菌麦粒,并使之均匀分散在离表层土壤6cm范围内;种子用拮抗菌(总菌量4×108CFU/mL)菌悬液,浸泡5h后播种,以井岗霉素拌种处理的玉米种子为对照,每处理10盆,每盆10粒。15d~20d后调查植株发病情况。发病率(%)=发病株数/植株数×100%病死率(%)=病死株数/植株数×100%1.2.3促生作用测定：将筛选出的菌株制成菌悬液(接种在LB液体培养基中振荡培养72h)浸种,含菌量为1.4×108CFU/mL,将表面消毒的玉米种子浸泡于菌悬液中,以清水处理和植物生长刺激素IAA处理为对照,5h后,催芽,每个处理10次重复,每个重复10粒种子,观察发芽情况及5d后根和茎的长度情况。1.2.4生理生化及形态鉴定：菌株的格兰氏染色、芽孢染色、运动性观察、甲基红(M.R)、V-P测定、葡萄糖发酵、氧化酶、接触酶、赖氨酸和苯丙氨酸脱氨酶、硫化氢还原、吲哚等试验参阅《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版和《常见细菌系统鉴定手册》进行(东秀珠,2001)[8]。1.2.5细菌总DNA的提取：菌体在BPA液体培养基中于28℃恒温振荡培养至对数生长期,以5000r/min离心15min,收集菌体,参照陈强等的方法提取细菌基因组DNA[9],1%的琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.616SrDNA的扩增、纯化及克隆：PCR引物采用细菌16SrDNA通用引物,Primer1(P1)5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′;://journals.im.ac/wswxtbcn1242微生物学通报2021,Vol.35,No.8Primer2(P6)5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。PCR反应体系：25μL2×PCRMastermix(TIANGen,Beijing),每种引物0.5μL(25pmol/μL),0.5μL细菌基因组DNA,最后加无菌去离子水23.5μL至终体积50μL。PCR扩增条件：94℃预变性5min;94℃变性1min,55℃退火50s,72℃延伸1min30s,进行35个循环;然后72℃延伸7min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行检测。PCR产物的纯化采用UNIQ-柱式PCR产物纯化试剂盒(上海生工公司)并参照使用说明书进行。纯化PCR产物的克隆是利用pMD18-T载体进行连接并将其转化入大肠杆菌(DH5α)(具体方法参见使用说明书),利用Amp++X-gal+IPTG+LB固体培养基进行阳性克隆子的筛选。1.2.716SrDNA的测序及系统发育树的构建：16SrDNA的测序由大连宝生物公司完成,将所得长度约为1.5kb的序列用BLAST软件与GeneBank中的16SrDNA进行同源性比较。采用DNAMEGA程序进行系统发育树的构建。到接种的突变菌株,说明细菌到第3天已经侵入植物根部;到第5天拮抗突变株均可以在根部、茎部分离到,说明细菌在侵入根部以后已经向上转移,到第7天为止在叶部也分离到了拮抗菌株,说明拮抗菌株已经转运至叶部。结果说明CNBH不仅可以在体内繁殖,并具有可转移性。表1菌株CNBH的生理生化特性Table1Biophysiologicalandbiochemicalcharacteris-ticsofstrainCNBH试验项目Testitem革兰氏染色Gramstaining硝酸盐Nitrate淀粉水解Starchhydrolysis氧化酶Amylase接触酶CatalaseL-阿拉伯糖Pectinose芽孢染色Sporestaining形状Shape甲基红试验Methylred明胶液化GelatinliquefactionV-P测定V-Ptest运动性Motility苯丙氨酸脱氨酶Phenylalanineammonia·lyase酪素水解Caseinhydrolysis葡萄糖氧化Glucoseoxidation甘露醇Mannitol石蕊牛奶实验Litmusmilktest注：+:阳性反应;−:阴性反应结果Results+++−++杆状−+++−+++产酸胨化2结果与分析2.1菌株CNBH的分离与生理生化鉴定以表面消毒的方法从川单13玉米苗中选出1株具有抗病促生能力的细菌菌株,命名为CNBH,该菌株在普通细菌培养基生长良好,菌落圆形,灰白色,扁平,表面粗糙,边缘光滑,该菌株的生理生化指标见表1,根据伯杰氏细菌鉴定手册,将该菌株初步鉴定为枯草芽孢杆菌。Note:+:Positivereaction;−:Negativereaction2.3菌株CNBH的拮抗效果测定以玉米纹枯病为主要病原菌,检测了CNBH在平板培养过程对它的拮抗效果,拮抗圈直径为26.3mm,具体拮抗效果见图1。从图1a可以看出菌株CNBH对立枯丝核菌具有明显的抑制作用,对抑菌圈的菌丝进行显微观察(图1b所示),主要表现为抑菌圈内立枯丝核菌菌丝扭曲、畸形;菌丝中原生质凝集,有的原生质外渗造2.2菌株CNBH的内生性检测对菌株CNBH进行抗药性(利福平)标记后,获得1株稳定的突变体,并就其对纹枯病的拮抗性进行测定,结果与原菌株相同。利