临床免疫学检验技术第12章 免疫组织化学技术

医学技术学院免疫教研室第十二章

免疫组织化学技术(Immunohistochemistrytechnique)1掌握：酶免疫组织化学技术；了解：免疫组化技术要点、荧光免疫组织化学技术、亲和组织化学技术；2一酶免疫组织化学技术二荧光免疫组织化学技术三亲和组织化学技术四免疫标记电镜技术五免疫组织化学技术应用六影响免疫组织化学技术的主要因素3第一节

酶免疫组织化学技术4

组织切片

常用的标本

组织印片细胞涂片一、组织处理5定义:借助交联剂的共价键将酶直接连接在抗体上，酶标抗体与靶抗原反应后，再通过对底物的特异性催化作用，生成不溶性有色产物，达到对抗原定性、定量、定位检测的目的。方法：直接法和间接法二、酶标记抗体免疫组化染色6特点:用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体酶通过免疫学反应与抗酶抗体及组织抗原上的第一抗体结合，最后经酶分子催化底物的显色反应，达到对抗原的检测三、非标记抗体酶免疫组化染色7

酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过第二抗体作桥抗体，将结合在组织抗原上的第一抗体与第三抗体连接起来，最后形成酶联的抗原-抗体复合物，底物显色。+++HRP底物二抗/Ab2兔源一抗/Ab1Ag兔源抗酶抗体/Ab3Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP复合物AgAgAgAg技术类型8

PAP法：是酶桥法的改良法。PAP法将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶形成一种稳定可溶性(PAP复合物)

+++底物二抗/Ab2兔源一抗/Ab1Ag兔源PAP复合物AgAgAgAg-Ab1-Ab2-PAP复合物9

双桥PAP法：是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上。10

APAAP法：用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶(AP)-抗碱性磷酶(AAP)法，简称APAAP法+++底物二抗/Ab2兔源一抗/Ab1Ag兔源APAAP复合物AgAgAgAg-Ab1-Ab2-APAAP复合物11

辣根过氧化物酶/HRP

底物显色棕色或灰蓝色最常用

碱性磷酸酶/AP

底物显色玫瑰红色或深蓝色最敏感

葡萄糖氧化酶/GO

底物显色蓝色敏感性较低，显色底物不易保存

β-半乳糖酶四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物12第二节

荧光免疫组织化学技术13第三节亲合组织化学技术14第四节免疫标记电镜技术15第五节免疫组化技术的临床应用16荧光激活细胞分类仪（FACS）三、免疫组织化学技术的拓展17“

细胞CT

”！激光扫描共聚焦显微镜(LaserScanningConfocalMicroscope，简称LSCM)

共聚焦显微镜技术的应用18（三）免疫组化-显微切割技术19第六节

影响免疫组织化学技术主要因素201.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将标记物与抗体结合形成标记抗体；4.标本的处理与制备；5.抗原抗体免疫学反应标记物呈色反应；6.观察结果。免疫组织化学的基本过程21（一）标本的主要来源1活体组织：实验动物和人体活检组织。2各种体液及穿刺液3培养细胞一、标本的处理221.固定的目的：不损伤组织细胞的固有形态、结构、抗原性和细胞膜的通透性；不干扰固定后的抗原与抗体的识别与结合2.固定剂的选择：所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学反应选择适当的固定剂（二）标本固定与保存23蛋白质类抗原：乙醇或甲醇微生物抗原：丙酮或三氯化碳多糖抗原：10%福尔马林固定类脂丰富：有机溶剂（乙醚）固定剂的选择24冰冻切片：：较好地保存组织抗原的免疫活性石蜡切片：形态保存好，可以用于回顾性研究3制片方法的评价25抗原修复:使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法。常用的方法有：

酶消化法盐酸水解法微波法高压锅法煮沸法二抗原的保存与修复26（一）抗体的选择多克隆抗体：敏感性较高、特异性相对较低单克隆抗体：特异性较高、敏感性相对较低三、抗体的处理与保存27抗原抗体反应要比例合适才能达到预期效果使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度（二）抗体的稀释28

分装密封保存，避免对抗体的污染并注明标记（批号、名称、效价）避免反复冻融而使抗体效价降低。（三）抗体的保存29必须设立对照对照实验：

阳性对照阴性对照确证实验：

空白实验替代试验吸收或阻断试验四、免疫组织化学的结果判断30

阳性细胞显色分布类型细胞质细胞核细胞膜表面阳性细胞显色：抗原分布于细胞核31

阳性显色深浅反映抗原存在的数量可以作为定性的依据定位的依据定量的依据32

阳性细胞分布分为散在分布灶性分布弥散分布阳性细胞呈灶性分布33特异性染色非特异性染色分布在特定的部位,具结构性无分布规律，常出现在切片边缘、刀痕或皱折部位及坏死或挤压的细胞区域由于细胞内抗原含量不同，所以显色不均一不限于单个细胞，而是累及一片细胞，均匀显色阳性与阴性细胞相互交杂，同一切片上显色强度不一细胞和周围的结缔组织均无区别的着色特异性染色与非特异性染色34不一致：结合临床资料，如性别、年龄、部位等影像学及实验室结果综合分析（五）免疫组织化学结果与苏木素-伊红染色切片结果35

抗体特异性、敏感性测试抗体最佳稀释度的选择稀释剂抗体孵育温度、时间（一）试剂的质量控制五、质量控制36操作：步骤是否正确规范；每日之间、操作人员之间的变异；试剂复溶、状态是否良好。标本：阴性、阳性或自身组织对照三种类型。

（二)操作过程质量控制37相关技术设备、仪器和器具定期校对、消毒（三）技术设备、仪器和器具的质量控制38

免疫组织化学技术采用了标记抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定。该技术的应用便于在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)，为疾病的诊断、鉴别诊断和发病机制的研究提供了强有力的