细胞工程第九章转基因动物与生物反应器详解演示文稿

细胞工程第九章转基因动物与生物反应器详解演示文稿当前1页，总共66页。1（优选）细胞工程第九章转基因动物与生物反应器当前2页，总共66页。2转GH基因超级小鼠当前3页，总共66页。3转基因兔、牛、猪、羊、鱼、小鼠……

当前4页，总共66页。4新加坡国立大学生物系转基因斑马鱼1.荧光鱼当前5页，总共66页。5当前6页，总共66页。6当前7页，总共66页。72.蜘蛛羊当前8页，总共66页。8研究者将高度活跃的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK-C)基因注入老鼠胚胎。基因转化的老鼠在运动时有效利用身体脂肪产生能量，同时避免产生大量乳酸。3.超级老鼠当前9页，总共66页。9不怕猫的老鼠。在科学家展示的照片中，一只褐色老鼠离一只猫不到一英寸，在猫的身边嗅来嗅去。研究人员确认并移除了老鼠大脑嗅球上的某些感受器，结果这些老鼠变成了一群无所畏惧的啮齿动物，在天敌面前转来转去，显示出极强的好奇心，永远不知道危险的存在。

4.无所畏惧老鼠当前10页，总共66页。10

2003年7月11日由陈系古教授领导的“人类转基因动物模型的制作”课题组历时5年，研制成功了四种转基因小鼠。其中，荧光鼠为胚胎干细胞、人类基因功能、人体组织工程和克隆器官等研究提供了基础；患白化病的小鼠转导了酪氨酸酶基因后长出了黑毛；四环素调控系统和丙肝核心抗原的转基因小鼠分别传到第四、第三代，为制备人类丙肝病毒感染的双基因动物模型提供了父代、母代。当前11页，总共66页。11当前12页，总共66页。12当前13页，总共66页。13当前14页，总共66页。14转基因动物模型优势：可以从整体水平、器官水平、组织水平、分子水平进行多层次、全方位、深入而又系统的综合研究。当前15页，总共66页。15借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定的移转给后代的动物称为转基因动物。一、转基因动物（transgeneticanimal）当前16页，总共66页。16目的基因的来源采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因；通过mRNA合成cDNA；人工合成的DNA片段；目的基因的克隆。当前17页，总共66页。17显微注射法病毒介导的生物学方法胚胎干细胞法精子载体法酵母人工染色体载体法其它二、培育转基因动物的方法当前18页，总共66页。181.显微注射转基因技术利用显微操作技术转移外源基因的方法。此法转入基因长度可达数百kb；并能随机地整合在受体体细胞染色体DNA上，因此应用范围广。当前19页，总共66页。19microinjection当前20页，总共66页。20当前21页，总共66页。21受精卵显微注射制备转基因动物的缺点1.外源基因整合至基因组的效率很低，对经济大动物（猴、牛、羊）的整合效率更低；2.随机整合，转基因整合的位点和拷贝数无法控制，造成转基因的表达差异很大，筛选高表达转基因动物的工作量很大；3.对经济大动物，由于需要大量的供体和受体，耗时长、费用昂贵，受到很大的限制。当前22页，总共66页。22将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的),获得转基因动物的方法。

2、逆转录病毒感染法当前23页，总共66页。23

优点：受精卵携带外源基因的阳性率高外源基因多单拷贝整合操作简单，避免注射法对卵子的损害宿主范围广可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高当前24页，总共66页。24缺点：容纳大小有限(<10-15kb)重组逆转录病毒的长末端容易甲基化，影响外源基因的表达潜在致癌性,载体复杂整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性当前25页，总共66页。253.胚胎干细胞方法当前26页，总共66页。26

优点：外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。当前27页，总共66页。27

缺点：ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体当前28页，总共66页。28目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。当前29页，总共66页。294.精子载体导入法当前30页，总共66页。30

5酵母人工染色体载体法（YAC）利用酵母人工染色体(ＹＡＣ)作为载体制作转基因动物的方法。

酵母人工染色体（ＹＡＣ）载体是近年来发展起来的新型载体,能克隆百万对碱基的大片段ＤＮＡ。

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优点：保证大片段ＤＮＡ的完整性。

保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率提高。

保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性,因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。

当前32页，总共66页。326、体细胞核移植法

将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞进行培养，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植（把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中，融合并激活），将重组胚进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。当前33页，总共66页。337.其它方法……性腺转基因方法

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总结：转基因动物的制作方法1、受精卵雄原核显微注射法2、胚胎干细胞（ES细胞）法3、逆转录病毒感染法4、精子载体法5、YAC法6、体细胞核移植法当前35页，总共66页。35显微注射法病毒介导的生物学方法胚胎干细胞法精子载体法酵母人工染色体载体法其它基因打靶二、培育转基因动物的方法当前36页，总共66页。36基因打靶利用细胞脱氧核糖核酸(DNA)可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质，定向改造生物某一基因的技术。1、基因敲除（geneknockout）2、基因替换（geneknockin）当前37页，总共66页。37基因敲除（geneknockout），指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中,而获得的内源目的基因缺失或功能丧失的转基因动物。当前38页，总共66页。38基因替换（geneknockin），指外源DNA与受体基因组中特定的内源基因发生同源重组而相关的两个内源基因中的一个基因的编码区被另一个基因的编码区的拷贝所置换的基因动物。当前39页，总共66页。39基因打靶基因敲除（geneknockout）将基因组特定内源基因定点突变基因替换（geneknockin）将基因组特定内源基因进行定向重组当前40页，总共66页。40显微注射法病毒介导的生物学方法胚胎干细胞法精子载体法酵母人工染色体载体法其它基因打靶二、培育转基因动物的方法当前41页，总共66页。41三、转基因动物的检测当前42页，总共66页。42DNA的提取PCR/RT-PCRSouthern杂交表达产物的检测（蛋白/下游产物）当前43页，总共66页。43

Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。当前44页，总共66页。441、改良动物品种2、生物制药3、动物模型4、异体器官移植5、基因治疗四、转基因动物的应用当前45页，总共66页。45转基因动物的低效性转入基因造成宿主基因突变问题转入基因的表达问题病毒转基因研究存在的问题转基因动物模型与预期不符问题乳腺生物反应器的问题社会问题五、转基因动物研究存在的问题当前46页，总共66页。46六、细胞转染常用方法当前47页，总共66页。471.电穿孔法实现外源基因的转移利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA转移至细胞中。此法简单、效率较高，广泛应用于培养细胞的基因转移。当前48页，总共66页。482.磷酸钙—DNA共沉淀法基因转移技术这种方法是受二价金属离子能促进细胞菌吸收外源DNA的启发而发展起来的。当核酸以磷酸钙—DNA共沉淀物的形式在时，细胞摄取DNA的能力显著加强。磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞。不适用于原代细胞（所需的DNA浓度较高）,操作简便但重复性差,有些细胞不适用当前49页，总共66页。493.脂质载体法将需要转移的外源DNA或RNA包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，从而将外源DNA转入宿主细胞。这种方法转基因效率高。当前50页，总共66页。50当前51页，总共66页。514.病毒介导的生物学方法（1）逆转录病毒（RNA病毒）（2）腺病毒（双链DNA病毒）当前52页，总共66页。52当前53页，总共66页。53当前54页，总共66页。54当前55页，总共66页。55比利时蓝牛当前56页，总共66页。56动物生物反应器当前57页，总共66页。57

一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。当前58页，总共66页。58一、动物血液生物反应器

外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生物反应器。大家畜的血液容量较大,利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物可直接从血清中分离出来,血细胞组分可通过裂解细胞获得。当前59页，总共66页。59二、动物膀胱生物反应器

外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器,叫动物膀胱生物反应器。膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膜蛋白,这种蛋白在膀胱中表达具有专一性,而且它的基因是高度保守的,将外源基因插入5′端调控序列中,就可以指导外源基因在尿中表达。当前60页，总共66页。60三、动物乳腺生物反应器

动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物,指导外源基因在乳腺中表达,并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白。当前61页，总共66页。611.动物乳腺生物反应器的制备（1）表达载体的构建目前用于表达载体的启动子调控元件选用动物乳蛋白基因启动子元件，主要有四类乳腺定位表达调控元件：第一类是B2乳球蛋白(BLG)，第二类是酪蛋白基因调控序列：第三类是乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列；第四类是乳清白蛋白基因调控序列。当前62页，总共66页。62（2）目的基因的选择选择目的基因的基本要求是，正常情况下浓度低、翻译后修饰复杂