FISH技术在血液肿瘤中应用

FISH技术在血液肿瘤中应用第1页/共34页FISH技术原理第2页/共33页第2页/共34页FISH技术原理第3页/共33页第3页/共34页FISH技术原理第4页/共33页第4页/共34页FISH技术原理第5页/共33页第5页/共34页FISH技术原理第6页/共33页第6页/共34页FISH技术原理第7页/共33页第7页/共34页FISH技术原理第8页/共33页第8页/共34页FISH的种类间期FISH（InterphaseFISH）染色体涂染分析（Chromosomepainting）多色FISH（Multicolor-FISH）反向涂染（Reversepainting）比较基因组杂交（Comparativegenomichybridization）第9页/共33页第9页/共34页FISH探针的种类和用途着丝粒探针用于检测染色体数目异常如三体、单体等。亚端粒探针靠近端粒的200-300Kb为染色体特异性DNA，用于检测涉及端粒的隐匿性易位。染色体臂或整条染色体涂染探针（WCP）用于检测染色体易位和标记染色体。序列特异性探针包括臂、带和基因探针等多种，用于检测基因缺失和重排。第10页/共33页第10页/共34页

血液肿瘤FISH检测常见探针类型

双色双融合探针（DC，DF）额外信号探针（ES）分离探针（BRK）第11页/共33页第11页/共34页FISH在血液肿瘤中的应用检测样本可以是血液、骨髓、石蜡切片诊断和鉴别诊断治疗和预后分层监测疗效（微小残留病灶检测）

识别移植后骨髓细胞来源第12页/共33页第12页/共34页一、诊断和鉴别诊断核型分析缺点：有丝分裂象少或缺如染色体质量低劣，显带不佳染色体异常复杂分子生物学检测不足：常见的转录序列来设计引物，扩增的片段长度一般在100～700bp之间mRNA剪切方式比较特殊，假阴性结果，易造成漏诊或误诊第13页/共33页第13页/共34页一、诊断和鉴别诊断FISH技术能弥补以上2种技术的不足之处间期细胞上分析（无需中期分裂象），极大地提高了敏感性、准确性和可靠性。对核型提示的染色体异常做进一步鉴定，从“正常核型”中筛查隐匿的染色体畸变，成为精确的染色体分析不可缺少的手段。FISH探针的片段相对较长，常可达数百kb，甚至大于1Mb，跨越融合基因每一侧多个外显子区域，只要发生在这些区域的缺失或易位都能被检测到，极少发生漏检，假阴性率很低。第14页/共33页第14页/共34页举例男性46岁患者，2003.2.24内科急诊发现白细胞增高（25×109/L）。骨髓显示粒系极度增生，红系、巨核系以及血小板增生尚可，NAP积分49分，核型分析结果为46,XY[20]。随访3年，其白细胞始终维持在20-30×109水平。一、诊断第15页/共33页第15页/共34页2006.5.4发现白细胞增高至170×109，血小板511×109，血红蛋白118g/dL。骨髓象显示早幼粒细胞占6%，中幼粒细胞占13%，核型分析未见分裂象。BCR-ABL210基因阴性，经单融合FISH探针证实骨髓59%细胞BCR-ABL融合基因阳性。接受格列卫治疗，2006.9.7复查，FISH阳性细胞比例降低至7.4%，2006.10.23以后的复查结果FISH都为阴性。一、诊断第16页/共33页第16页/共34页其他常用于诊断的探针还有：PML/RARA，AML1/ETO，CBFβ，TEL/AML1等。以CBFβ探针为例：发生16号染色体倒位的细胞其荧光信号由2F变成1F/1R/1G。有研究表明CBFβ探针对inv(16)导致的CBFβ-MYH11融合基因的检出率与分子生物学的方法相当。一、诊断第17页/共33页第17页/共34页一、诊断—急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病检测探针探针定位异常染色体GLP4/GLP10GLP4:4p11.1-q11.1GLP10:10p11.1-q11.1+4，+10GLP17GLP17:17q11+17GLPTEL/GLPAML1GLPAML1：21q22GLPTEL：12p13

t(12;21)GLPMLLGLPMLL：11q23t(11;v)GLPBCR/GLPABL(DF)GLPBCR:22q11.2GLPABL:9q34t(9;22)第18页/共33页第18页/共34页一、诊断—淋巴瘤B细胞淋巴瘤—IGH基因断裂重组滤泡性淋巴瘤—IGH/BCL2融合基因套细胞淋巴瘤—IGH/CCND1融合基因弥漫大B细胞淋巴瘤—BCL6基因Burkitt淋巴瘤—C-MYC基因粘膜相关淋巴组织淋巴瘤—MALT基因断裂重组第19页/共33页第19页/共34页鉴别诊断，以BCR/ABL探针为例：额外信号的BCR/ABL探针（ES）根据荧光信号的模式不同，可以鉴别MBCR断裂点（P210）和mBCR断裂点(P190)。MBCR断裂点的细胞呈现1Y/2R/1G的信号模式，而mBCR断裂点的细胞则是2Y/1R/1G的信号模式。一、鉴别诊断第20页/共33页第20页/共34页一、鉴别诊断双色双融合信号探针（DF）—虽不能区分MBCR和mBCR，但能检测der（9）的部分序列缺失。ABL和BCR基因同时缺失：1R/1G/1YABL基因单独缺失：1R/2G/1Y。ES探针却无法检测der（9）的部分序列缺失，其信号均显示1R/1G/1Y。第21页/共33页第21页/共34页一、鉴别诊断IgH-CCND1男性，54岁患者，左颌下肿块2月余白细胞增高（21.3×109/L）骨髓涂片见到增生活跃，以成熟淋巴细胞增生为主，考虑慢性淋巴细胞白血病。流式分析显示CD5+CD19+细胞占86.5%，以CD19+的细胞群设门，CD23+细胞约占16.3%。FISH检测患者外周血，约50%的圆形细胞显示融合信号，提示套细胞淋巴瘤可能性大。病理证实了左颌下淋巴结非霍奇金套细胞淋巴瘤。。第22页/共33页第22页/共34页

CLL中的应用CLL的细胞大多处于间期，有丝分裂活性较低，细胞往往不分裂，即使分裂的细胞绝大多也是正常核型，核型分析的异常检出率很低。CLL的遗传学异常被认为与存活期有关：正常核型和13q-预后相近+12、11q-和17p-的预后均较差二、治疗和预后分层第23页/共33页第23页/共34页FISH共检出了23例异常（76.7%）。完成核型分析的18例中仅2例检出异常。正常核型的9例中，FISH检出7例异常。未见分裂象的7例中，FISH检出5例异常。而且这些由FISH检出的异常克隆比例基本都在20%以上。CEP12P53D13S25RB1ATM核型阳性例数11213121异常2正常9未见7未做12二、治疗和预后分层第24页/共33页第24页/共34页MM中的应用MM的骨髓瘤细胞有丝分裂指数低，且由于骨髓浸润程度不同，常规核型分析异常检出率相对较低，检出的异常往往是超二倍体和/或复杂核型。MM的遗传学异常同样被认为与预后相关，13q14的缺失被认为是复发和预后不良的独立危险因素，1q21扩增、p53缺失也都提示预后不良。二、治疗和预后分层第25页/共33页第25页/共34页二、治疗和预后分层FISH共检出了17例异常（56.7%）。完成核型分析的27例中6例检出异常（22.2%）。正常核型的15例中，FISH检出9例异常。未见分裂象的7例中，FISH检出3例异常。FISH检出的异常克隆比例大多都低于30%。浆细胞比例低于20%，异常检出率会大大降低。1q21P53D13S319RB1IgH核型阳性例数628710异常6正常15未见6未做3第26页/共33页第26页/共34页MDS中的应用FISH在MDS中的应用价值相对较低。MDS的患者大多能成功完成核型分析，且被分析的分裂象数目和质量尚可。FISH检测普遍采用组合探针（-5/5q-、-7/7q-、+8、20q-和-Y）对五大类常见异常进行分析。二、治疗和预后分层第27页/共33页第27页/共34页在我院新近完成的70例MDS患者的研究中：核型和FISH分别检出21例和22例异常，异常检出率相当。核型异常但FISH正常的6例，这6例异常均发生于探针覆盖范围以外区域。核型正常而FISH异常7例，这7例的异常克隆细胞比例大多较低（<10%）。对于未见分裂像和正常核型的患者有一定的应用价值，能提高小克隆异常的检出率。二、治疗和预后分层第28页/共33页第28页/共34页三、监测疗效

对于某些不具有特定分子水平改变，或者是基因重排方式比较特殊，常规的分子生物学方法不能检测，但其在疾病初发时有较大片段的易位、缺失、扩增或重排并能被现有的FISH探针检出的患者，可在治疗后进行FISH监测。第29页/共33页第29页/共34页FISH在异性别异基因造血干细胞移植后供受者嵌合比例的监测中也有非常重要的价值。比较未分选细胞的STR和FISH两种技术，FISH的敏感性和准确度更高，对于早期提示复发或排斥反应的临床应用价值更大。四、识别移植后骨髓细胞来源第30页/共33页第30页/共34页小结FISH的优点：简便迅速。杂交和检测效率高。敏感性和特异性高，能对间期细胞进行分析。缺点包括：价格相对较高。受探针来源的限制。检测三体敏感性高于单体或缺失。石蜡包埋或冰冻切片较难处理。需荧光显微镜和分析系统