生产种子制备技术

微生物发酵技术-车间种子制备主讲人:XXX车间种子制备流程及设备01注意事项0203接种方式04质量标准工艺流程流程：

斜面、摇瓶或米粒种子

培养基配制→实罐/连续灭菌→冷却→火圈/压差接种

→培养→发酵罐种子。工艺流程设备：种子罐工艺流程设备：种子罐工艺流程设备：种子罐/发酵罐设备图注意事项及设备制备过程中应保持：培养基要求与发酵培养基大致相同，较摇瓶培养基丰富，控制培养基成份的合理配比2)接种方式：一级种子罐：火圈保护接种法和压差法二级种子罐：压差法3）通气培养时通入空气的温度适中（20-50℃），搅拌转速也要适当。4）采用夹套或蛇管冷却以保持恒温，温度不能高于控制温度，防止造成异常发酵5）通过培养基中生理酸碱性物质的配比，使pH自然维持在适宜的范围6）控制合适移种量：过大或过小都对发酵有不利影响接种方式流程：注意事项：压差法接种操作示意接种方式流程：注意事项：从种子罐接种接种方式注意事项：种子罐1发酵罐1发酵罐2种子罐2

1）单种2）双种：二只种子罐接一只发酵罐3）倒种：将发酵液倒出适量给另一发酵罐作种子4）混种质量标准1）不污染杂菌；2）菌体生长阶段（种龄）：处于对数生长期后期，菌体量未达到高峰；3）菌体浓度：菌体浓度的测定方法：离心沉淀法、光密度法、细胞记数法等；4）糖、氮、磷代谢情况；5）种子液pH；6）摇瓶试验的发酵水平；7）特异性酶活力。种龄对发酵的影响种子过于年轻：前期生长缓慢、整个发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，甚至会因菌丝量过少而在发酵罐内结球，造成异常发酵的情况。过老的种子：引起生产能力下降而菌丝过早自溶。一般细菌种子培养7-24h，霉菌16-50h，放线菌21-64h。思考题简要介绍压差接种法注意事项。1车间种子接种方式有哪些？2微生物发酵技术-米孢子主讲人:XXX米孢子概述01工艺流程0203注意事项04质量检查概述定义：将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一段时间后产生的分生孢子。以米粒作为培养基，进行种子扩培。工艺流程流程：包括三部分：1.营养液配制2.米粒培养基制备3.斜面种子。注意事项制备过程中应保持：（1）浸泡时间及加营养液量应掌握在灭菌后米粒熟透但不粘连；（2）分装量应掌握在平铺后有2-3粒米的厚度；（3）米粒不要碰到瓶塞；（4）培养前期应经常摇动米粒，使微生物在米粒表面生长均匀，气生菌丝及孢子长成后不再摇动；（5）保存：冰箱保存；真空干燥保存；10%-20%甘油浸泡保存。质量标准米孢子质量应遵循：（1）无杂菌污染；（2）孢子数足够，发芽率高；（3）生产能力高；(4)真空干燥后含水量小于8%。思考题米孢子制备工艺流程是怎样的？1米孢子质量如何保证？2微生物发酵技术-噬菌体防治主讲人:XXX噬菌体的防治噬菌体侵染表现01噬菌体防治措施021.噬菌体侵染表现噬菌体侵染表现简介：不同发酵类型遭到不同种类噬菌体侵染所出现的现象是不同的；而同一菌种被相同的噬菌体侵染，由于侵染的时间不同，也会造成不同的后果。噬菌体侵染表现表现1：感染噬菌体后种子出现畸形菌丝，菌体迅速消失；这是因为噬菌体侵染菌种细胞后会快速完成自身生活史周期，利用菌种的代谢体系大量合成子代噬菌体组成部分，完成组装、释放并再次侵染周边菌种细胞，并周而复始的进行侵染、合成、裂解生产菌种细胞造成的。噬菌体侵染表现表现2：感染噬菌体后种子培养液会pH上升，发酵产物停止积累，甚至下降等现象。菌种密度的下降直接表现为产物积累量的下降。2.噬菌体防治措施噬菌体防治措施1.正确判断：以谷氨酸发酵为例，感染噬菌体后异常表现为：1、发酵液泡沫多，粘度大，甚至呈粘胶状，可拨丝；2、发酵液OD值上升后下跌，或不长；3、pH上升到8.0以上，且不再下降，或pH稍有升降，停滞在7.0～7.2之间；4、耗糖缓慢或停止；5、排出CO2量一反常态，急骤下降；6、发酵周期逐罐延长。此表现可以表述为发酵异常、动力消耗异常、排气异常……噬菌体防治措施2.普及有关噬菌体的知识：噬菌体来源一般为环境，对种子制备过程中涉及的人员要加强培训；对周边环境要勤消毒；严格管理种子实验室；……噬菌体防治措施3.选育抗噬菌体菌株：从自然突变或诱发突变所得到的抗噬菌体菌株，在用于生产之前，均需经过反复验证，才能使用。（l）抗噬菌体性状的稳定性试验抗性菌株分别在孢子培养、种子培养和发酵培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。如都不出现噬菌斑，说明该菌株对此噬菌体具有抗性。此外，还可以观察抗性菌株经多次传代后对噬菌体的抗性是否稳定。（2）抗性菌株的产量试验在选育抗噬菌体菌株时，既要求具有抗性，同时亦要求生产能力不低于原敏感菌株。（3）其正抗性与溶源性的区别试验菌株的抗噬菌体特性具有遗传的相对稳定性。噬菌体防治措施4.消灭噬菌体：在发生噬菌体感染时发酵罐排出的废气夹带有大量噬菌体，造成严重污染和扩散。因此，必须在排气口及下水道喷洒药剂，防止噬菌体扩散。常用的药物有漂白粉、甲醛、石灰水等。种子室应尽量设法与外界减少接触，严格执行无菌操作，并检查空气中有无噬菌体存在。噬菌体防治措施5.收集和保存噬菌体：在生产上出现噬菌体后要收集并保藏起来，以进行研究。因为这是选育抗性菌株及研究防治措施的材料和依据。噬菌体防治措施小结：总之，防治噬菌体，应以预防为主，杜绝噬菌体的滋生，两者结合，才是有效的防治措施。思考题如何判断发酵罐感染噬菌体？1如何消灭罐内及环境中的噬菌体？2微生物发酵技术-摇瓶种子制备主讲人:XXX摇瓶种子制备概述01工艺流程0203注意事项及设备04质量检查概述定义：将斜面种子或米孢子接种于锥形摇瓶内的液体培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子。用摇床旋转供氧，进行种子扩培。工艺流程流程：注：一定是冷却至室温后接种，也可于种子适温时接种；震荡频率即供氧速率，由摇床转速控制。培养基配制分装锥形瓶加塞或覆盖八层纱布灭菌冷却接种震荡培养液体培养物斜面种子注意事项及设备制备过程中应保持：营养成分较斜面丰富；培养基装量适当参考装量为40-50ml/250ml瓶，60-80ml/500ml瓶，90-110ml/750ml瓶，120-150ml/1000ml瓶；如果是厌氧培养，则装量应增加一倍以上；灭菌时加盖牛皮纸或双层报纸；注意摇床转速，转速越快，偏心距越大，通气越好。经常检查，皮带松弛时要紧一紧；5）注意摇床中心与边缘、上层与下层的温差。流程：注意事项：注意事项及设备流程：设备：注意事项及设备流程：设备：立式旋转摇床注意事项及设备流程：设备：超净工作台质量标准摇瓶种子质量应遵循：菌体浓度：外观稠度，静置沉降率，离心沉降率；

菌体生长阶段：显微镜检查细胞分化情况；(3)代谢情况：对残余糖、氮进行化学分析，并测量pH值；(4)

生产能力：摇瓶发酵试验；(5)

污染杂菌情况：镜检及无菌试验检查。思考题摇瓶种子制备过程为怎样的流程？1摇瓶种子质量如何检验？2微生物发酵技术-种子的扩大培养主讲人:XXX种子的扩大培养种子扩培概述01种子培养方法0203种子扩培工艺04种子扩培参数1.种子扩培概述种子扩培概述定义：种子扩大培养，简称种子扩培，是指将保存的处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得的供生产车间发酵罐接种用的一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。广义的种子：是指利用微生物生产中所用到的各种孢子、摇瓶菌丝、种子罐菌丝的总称。狭义的种子：指用于接种的各种菌丝。种子扩培概述作用：发酵接种量的需要；菌种的驯化需要；缩短发酵时间、保证生产水平需要……2.种子培养方法种子培养方法表面培养法：指表面皿培养，液面形成生物膜。特点：接近自然，但种子生长速度慢。常用茄子瓶、克氏瓶、瓷盘培养。种子培养方法固体培养法：用天然的固体物料培养，另加入生长因子、微量元素以补充养料。不使用琼脂，和1中的固体培养基不同。主要用于孢子制备，大规模生产也有应用，养分传递慢，生长较慢，也易染菌。常用三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶和培养皿等。种子培养方法液体深层培养法：将孢子悬浮于培养基中，物质、氧的传递快、生长快，工业生产主要用此法，也用于一级、二级种子罐。3.种子扩培工艺种子扩培工艺实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此形象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。如包括琼脂斜面、固体培养基扩大培养或摇瓶液体培养。种子扩培工艺车间种子阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。如种子罐扩大培养。种子扩培工艺扩培一般工艺流程：斜面沙土管冷干管液氮管实验室种子制备生产现场种子制备二级斜面一级斜面米孢子

母瓶

子瓶一级种子罐发酵罐

二级种子罐三级种子罐菌种保藏4.种子扩培参数种子扩培参数接种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常，接种龄以菌丝处于对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时较为合适。种子扩培参数种子罐级数：种子在种子罐中需扩大培养的次数。一般根据菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及所采用发酵罐的容积而定。谷氨酸及其他氨基酸发酵所采用的菌种生产繁殖很快，常用一级种子扩大培养；庆大霉素、卡那霉素一般用二级种子扩大培养；有些酶制剂生产也用二级种子扩大培养；链霉素采用三级种子扩大培养；放线菌的细胞生长繁殖较慢，常采用三级种子扩大培养；种子罐的级数越少，越利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来染菌的机率。种子扩培参数发酵级数：种子罐级数+1：谷氨酸及其他氨基酸发酵常用一级种子扩大培养，即二级发酵；庆大霉素、卡那霉素一般用二级种子扩大培养，即三级发酵；有些酶制剂生产也用二级种子扩大培养，即三级发酵；链霉素采用三级种子扩大培养，即四级发酵；放线菌的细胞生长繁殖较慢，常采用三级种子扩大培养，即四级发酵；必须考虑应该尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。种子扩培参数接种量：指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。思考题种子扩大培养的一般流程是什么？1种子罐级数和发酵级数的关系？2微生物发酵技术-种子异常情况主讲人:XXX种子异常情况菌种生长发育过快或缓慢01菌丝结团02菌丝粘壁03种子异常情况菌种生长发育过快或缓慢空气温度偏低；培养基灭菌温度太高，营养成分破坏多。（生产中，培养基灭菌后取样测定PH，以判断培养基的灭菌质量）；局部烫伤；培养基原材料质量差；无机磷量低；接种量太小；前一级种子质量太差；泡沫多，通气差。种子异常情况菌丝结团：在液体培养条件下，繁殖的菌丝并不分散舒展而聚成团状，称为菌丝团，这时从培养液的外观就能看见白色的小颗粒。菌丝聚集成团有什么影响？如果种子液中的菌丝团较少，进入发酵罐后，在良好的条件下，可以逐渐消失，不会对发酵产生显著影响。如果菌丝团较多，种子液移入发酵罐后往往形成更多的菌丝团，影响发酵的正常进行。菌丝结团和搅拌效果差、接种量小有关。一个菌丝团可由一个孢子生长发育而来，也可由多个菌丝体聚集一起逐渐形成。种子异常情况菌丝粘壁菌丝粘壁是指在种子培养过程中，由于搅拌效果不好、泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因，使菌丝逐步粘在罐壁上。其结果使培养液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。以真菌为产生菌的种子培养过程中，发生菌丝粘壁的机会较多。思考题菌种过缓或过快生长的原因有哪些？1菌丝粘壁主要原因在哪几个方面？2微生物发酵技术-种子质量影响因素主讲人:XXX种子质量影响因素原材料质量01培养条件02种龄03接种量04种子质量影响因素原材料质量：原材料质量的波动，起主要作用的是其中无机离子；水质对孢子质量影响也很大。一些厂家在蒸馏水或去离子水，加入适量的无机盐制成合成水，可提高孢子质量。种子质量影响因素培养条件：（l）温度温度过低，菌体生