2015年第七章吸光光度分析法

第一节概述第二节光吸收的基本定律第三节分光光度计简介第四节吸光光度法的建立第五节吸光光度法的应用第七章

吸光光度法2第一节概述一、吸光光度法的特点二、物质对光的选择性吸收三、光吸收曲线3

吸光光度法：在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法。

主要有:

红外分光光度：分子振动光谱，吸收光波长范围

2.51000m，主要用于有机化合物结构鉴定。

紫外分光光度：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200400nm（近紫外区），可用于结构鉴定和定量分析。第一节概述4可见分光光度：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400750nm，主要用于有色物质的定量分析。一、吸光光度法的特点1.灵敏度高；2.准确度高；3.操作简便、快速；4.应用广泛。物质溶液颜色的深浅与有色物质的含量有一简单的函数关系第一节概述5二、物质对光的选择性吸收1.光的颜色

可见光：波长在400~760nm范围内的光为可见光。

红（620~760）、橙（590~620）、黄（560~590）

绿（500~560）、青（480~500）、蓝（430~580）

紫（400~430）。单色光：具有一种波长的光。复合光：由几种单色光混合而成的光。白光：由红、橙、黄‥‥‥七种颜色的光按一定的强度比例混合而成。互补色光：如果把两种适当颜色的光按一定的强度比例混合也可以得到白光，那么这两种光为互补色光。第一节概述6互补色光示意图白光7

物质的颜色是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收而产生的。物质的颜色显示其吸收光的互补色。2.物质对光的选择性吸收

由于物质的本性和形态不同,对光的吸收透射和反射等情况不同,物质呈现出不同的颜色。第一节概述108光的互补：蓝黄9表1物质的颜色与吸收光颜色的互补关系P31210

用不同波长的单色光分别照射某一溶液，测量在每一波长下溶液对该波长光的吸收程度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制曲线，描述物质对不同波长光的吸收能力。三、光吸收曲线

A~(nm)吸收曲线第一节概述max

吸收光谱11max=525nmKMnO4溶液的吸收光谱图

吸收曲线第一节概述吸收绿色光显示紫红色12第一节概述13吸收曲线邻二氮菲-Fe2+配合物max=510nm吸收蓝绿色光显示橙红色14吸收曲线max=510nmA＝εbc15吸收曲线的讨论：（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax

。

在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。第一节概述16（3）从吸收曲线形状可以解释物质的颜色。物质的颜色主要由λmax

决定。物质的颜色与吸收光颜色互为补色。

吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。（4）同一种物质溶液的浓度不同，吸收峰值不同。这是定量分析的依据。第一节概述A＝εbc17一、朗伯-比耳定律（光吸收的基本定律）第二节光吸收的基本定律二、偏离朗伯-比耳定律的原因18一、朗伯-比耳定律（光吸收的基本定律）1.透光率和吸光度入射光——I0

吸收光——Ia

透射光——It

反射光——Ir

I0=Ia+It+Ir透光率（T

）：描述入射光透过溶液的程度。

T=It/I0吸光度（A）：描述溶液对光的吸收程度。

(或称光密度或消光值)

A＝lg（I0/It)吸光度A与透光率T的关系:

A

＝－lgT

第二节光吸收的基本定律2019样品溶液吸收光示意图IrIat202.朗伯-比耳定律A：吸光度；

I0

：入射光强度；

It：透射光强度；

b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；K：比例常数；与吸光物质的性质、温度、波长等有关。

c:溶液的浓度式中:

A＝lg（I0/It)=Kbc朗伯-比耳定律的数学表达式为：

朗伯-比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。广泛地应用于紫外光、可见光、红外光区的吸收测量，也适用于原子吸收测量。第二节光吸收的基本定律21

一、吸光光度法在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法。

物质的颜色显示其吸收光的互补色。二、光吸收曲线

A~(nm)三、朗伯-比耳定律（光吸收的基本定律）温故而知新A＝-lgT=Kbc

当平行单色光通过单一均匀的、非散射的吸光物质溶液时,溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。12.922吸光度A具有加合性：A总=A1+A2A1、A2分别为两种吸光物质的吸光度。

朗伯-比耳定律的物理意义

当平行单色光通过单一均匀的、非散射的吸光物质溶液时,溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。A、T、c三者的关系如下图所示。第二节光吸收的基本定律说明：23A~c

呈正比第二节光吸收的基本定律

A＝-lgT=lg（I0/It)=Kbc243.吸光系数和摩尔吸光系数(2)

摩尔吸光系数(1)

吸光系数A＝Kbc当b:cm,c:g/L,K:

L/gcm→a:吸光系数A＝abcA＝Kbc当b:cm,c:mol/L,K:L/gcm→ε:

吸光系数A＝εbc

吸光系数a(L·g-1·cm-1)相当于浓度为1g·L-1，液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。第二节光吸收的基本定律25

摩尔吸光系数ε(L·mol-1·cm-1)在数值上等于吸光物质浓度为1mol·L-1、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。（M为物质的摩尔质量）ε=Ma

ε与a的关系为：第二节光吸收的基本定律摩尔吸光系数的含义26摩尔吸光系数ε的讨论：⑴摩尔吸光系数ε在数值上等于浓度为1mol·L-1、液层厚度为1cm时，该溶液在某一波长下的吸光度。第二节光吸收的基本定律

ε是吸收物质在一定波长条件下的特征常数，不随浓度c和光程长度b的改变而改变。

在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关。27⑵可作为定性鉴定的参数。⑶同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示。

εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。

εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。

第二节光吸收的基本定律（4）摩尔吸光系数可以通过实验测定。28例1.浓度为0.510gL-1的Cu2+溶液，用双环己酮草酰二腙比色测定，在波长600nm处，用2cm比色皿测得T=50.5%，求吸光系数a、摩尔吸光系数ε各为多少？解：已知:T=50.5%，b=2cm，c=0.510gL-1

则得:A=-lgT=-lg50.5%=0.297将浓度进行换算:

c=0.510gL-1=5.1010-4gL-1=8.0310-6molL-1第二节光吸收的基本定律29第二节光吸收的基本定律30

溶液中吸光物质的浓度常因解离等化学反应而改变，若不考虑这种情况，以被测物质的总浓度代替平衡浓度计算，所得的为表观摩尔吸收系数。

ε>105：超高灵敏；

ε=(6~10)×104

：高灵敏；

ε=(2~6)104

：中等灵敏；

ε<2×104：不灵敏。第二节光吸收的基本定律31(3)桑德尔(Sandell)灵敏度(灵敏度指数)

:S表示也可表示光度分析法的灵敏度。

指当仪器的检测极限为A＝0.001时，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量，其单位为μg·cm-2，S与c及吸光物质摩尔质量M的关系为：

A=εbc=0.001

bc=0.001/ε(单位=cmmol/L=cmmol/1000cm3=10-3mol/cm2)即单位截面积光程内吸光物质的摩尔数第二节光吸收的基本定律32S与ε关系不仅表示显色物质的特性,也涉及了仪器的灵敏度。第二节光吸收的基本定律33例2.浓度为25.5g/50mL的Cu2+溶液，用双环乙酮二腙光度法测定，在波长600nm处，用2.0cm比色皿测得T=50.5%。求摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度。解:A=-lgT=-lg0.505=0.297第二节光吸收的基本定律34第二节光吸收的基本定律354.工作曲线的绘制与应用A——纵坐标c——横坐标→工作曲线（标准曲线）A~c或A~

c单位mol/L

单位g/L、mg/L、g/L第二节光吸收的基本定律360.20.80.40.6A012

345(mg·L-1)c(mol/L)工作曲线A＝εbc第二节光吸收的基本定律37二、偏离朗伯—比耳定律的原因

标准曲线法测定未知溶液的浓度时发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯-比耳定律的偏离。AcAc第二节光吸收的基本定律了解38

引起这种偏离的因素（两大类）：一类是物理性因素，即仪器的非理想引起的；另一类是化学性因素。

1.物理性因素

朗伯-比耳定律的前提条件是入射光为单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯-比耳定律的偏离。非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯-比耳定律的偏离。

第二节光吸收的基本定律39

为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器。此外｜Δε｜很小时，则可近似认为是单色光。还应将入射光波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。第二节光吸收的基本定律减小的措施40

2.化学性因素

朗伯-比耳定律建立在均匀、非散射溶液的基础上。当被测溶液是胶体、悬浮液等时，入射光除被吸收外，还有一部分光因散射而损失，使透光率降低，使吸光度比真实值偏大，发生偏离(一般为正偏离)。(1)介质的不均匀性第二节光吸收的基本定律（2）浓度的影响

朗伯-比耳定律假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用，实验证明，这种假定只有在稀溶液时才基本符合。41

(3)由化学反应引起的偏离

如化学因素引起的有色物质的离解、缔合，产生新的物质，改变了吸光物质的浓度，甚至改变了吸收质点，引起偏差。措施：控制显色反应条件。第二节光吸收的基本定律

当溶液浓度c

比较高时，由于吸光质点间的相互作用，使它们的吸光能力发生改变，直接影响了对光的吸收。朗伯-比耳定律只适用于稀溶液。423.工作曲线不过原点

存在系统误差：吸收池不完全一样；参比溶液选择不当等。第二节光吸收的基本定律43一、朗伯-比耳定律（光吸收的基本定律）第二节光吸收的基本定律二、偏离朗伯-比耳定律的原因44第三节分光光度计简介一、主要部件二、分光光度计的类型简介了解45第三节分光光度计简介一、主要部件光源单色器吸收池检测器A或T读数461．光源

在整个可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。钨灯作为可见光区光源，其辐射波长范围在350～800nm。第三节分光光度计简介47

2.单色器将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出任一波长单色光的光学系统。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或反射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光，棱镜或光栅；④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。第三节分光光度计简介48

3.样品室样品室放置各种类型的吸收池和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。

4.检测器

利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。5.信号显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理。第三节分光光度计简介49根据工作波段的不同分为：可见分光光度计350-800nm紫外－可见分光光度计185-900nm真空紫外(远紫外)分光光度计10-200nm紫外－可见－红外分光光度计

185-2500nm第三节分光光度计简介二、分光光度计的类型简介50SP-2000分光光度计第三节分光光度计简介51第三节分光光度计简介52根据光度学和记录系统的不同分为：根据测量过程中的波长数不同分为：单波长分光光度计双波长分光光度计单光束手动式分光光度计双光束自动记录分光光度计第三节分光光度计简介二、分光光度计的类型简介53第三节分光光度计简介一、主要部件二、分光光度计的类型简介54三、吸光度测定条件的选择一、显色反应及显色条件的选择二、干扰的消除第四节吸光光度法的建立55第四节吸光光度法的建立一、显色反应及显色条件的选择显色反应：将试样中被测组分转变成有色化合物的反应。

显色剂：把被测组分转变成有色化合物的试剂。1.对显色反应的要求⑴选择性要好。⑵灵敏度足够高。⑶有色化合物组成恒定、性质稳定，重现性好。⑷显色剂与显色化合物的颜色差别大。即对比度大。56常用的无机显色剂有：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等。有机显色剂种类繁多：如三苯甲烷类有铬天青S、二甲酚橙等；偶氮类有偶氮胂Ⅲ、PAR等。第四节吸光光度法的建立57条件试验的简单方法

变动某实验条件，固定其余条件，测定一系列吸光度值，绘制吸光度—某实验条件的曲线，根据曲线确定某实验条件的适宜值或适宜范围。2.显色条件的选择第四节吸光光度法的建立58⑴显色剂用量2.显色条件的选择显色反应：M+R=MR

被测组分显色剂有色化合物显色剂用量如何选择？→由实验确定方法：cM等其它条件一定，改变cR，测定溶液吸光度

cR1cR2

cR3

A1

A2

A3横坐标纵坐标第四节吸光光度法的建立59

吸光度A与显色剂用量

cR的关系曲线如图所示。选择曲线变化平坦处作为显色条件。显色剂用量范围为ca~cb第四节吸光光度法的建立60⑵溶液的pH值pH1pH2pH3

A1

A2

A3横坐标纵坐标由实验确定。方法：在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件下显色溶液的吸光度。①影响金属离子的存在状态②影响显色剂的浓度和颜色③影响配合物的组成第四节吸光光度法的建立61酸度范围为pH2~10pHA

选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的pH范围。第四节吸光光度法的建立酸度选择曲线62三、吸光度测定条件的选择一、显色反应及显色条件的选择二、干扰的消除第四节吸光光度法的建立温故而知新12.1763条件试验的简单方法

变动某实验条件，固定其余条件，测定一系列吸光度值，绘制吸光度—某实验条件的曲线，根据曲线确定某实验条件的适宜值或适宜范围。第四节吸光光度法的建立一、显色反应及显色条件的选择温故而知新12.1764⑴显色剂用量2.显色条件的选择显色剂用量如何选择？→由实验确定⑵溶液的pH值酸度如何选择？→由实验确定显色剂用量选择曲线酸度影响曲线温故而知新12.1765⑷显色时间与稳定性有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快达到稳定状态，并在较长时间内保持不变；有些显色反应虽能迅速完成，但有色络合物的颜色很快开始褪色；有些显色反应进行缓慢，溶液颜色需经一段时间后才稳定。

通过实验确定。⑶温度显色反应一般在室温下进行，有的反应需加热，应通过实验找出适宜的温度范围。⑸溶剂的选择第四节吸光光度法的建立66显色时间为15min稳定时间45min67二、干扰的消除

例：测定Ti4＋，加入H3PO4掩蔽剂使Fe3+(黄色)成为［Fe(PO４)2］3-(无色)，消除Fe3+的干扰；又如用铬天菁S光度法测定Al3+时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将Fe3+还原为Fe2+，消除Fe3+的干扰。

选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。1.加入掩蔽剂第四节吸光光度法的建立682.选择适当的显色反应条件通过控制适宜的显色条件，消除干扰组分的影响。第四节吸光光度法的建立

3.

提高显色反应的选择性利用被测物能形成三元配合物的特点，提高显色反应的选择性。696.分离干扰离子采用适当的分离方法预先除去干扰物质。第四节吸光光度法的建立4.选择适宜的波长避开干扰物的最大吸收。5.利用参比溶液配制适当的参比液，消除干扰组分的影响。70三、吸光度测定条件的选择及误差控制一、显色反应及显色条件的选择二、干扰的消除第四节吸光光度法的建立711.选择适当的测定波长

一般应该选择λmax为测定光波长。但如果λmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。max

三、吸光度测定条件的选择及误差控制原则：吸收最大干扰最小第四节吸光光度法的建立72

2.选择适当的参比溶液

吸收池表面对入射光有反射和吸收作用；溶液的不均匀性所引起的散射；过量显色剂、其它试剂、溶剂等引起的吸收，这些因素影响待测组分透光度或吸光度的测量。

采用参比溶液校正的方法消除或减小这些影响。在相同的吸收池中装入参比溶液(又称空白溶液)，调节仪器使透过参比池的吸光度为零(称为工作零点)。在此条件下测得的待测溶液的吸光度才真正反映其吸光强度。第四节吸光光度法的建立73A=AMR+A干扰AMR=A-A干扰

希望A干扰=0将干扰部分作为参比通过仪器调节T=100%,即A=0结果

AMR

=A第四节吸光光度法的建立进一步解释74第四节吸光光度法的建立

参比溶液的选择一般遵循以下原则：⑴若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收，其它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水)作参比溶液；⑵若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液本身无吸收，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液；⑶若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则可用“试样空白”(不加显色剂)作参比溶液；⑷若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸收，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液（褪色空白）。75参比溶液溶剂试剂试液显色剂参比液一般无色无色无色无色溶剂空白无色或有色有色试剂空白（不加试液）有色试液空白有色有色褪色空白第四节吸光光度法的建立763.控制适宜的吸光度读数范围第四节吸光光度法的建立光源不稳定光电池不灵敏光电流测量不准确主要来源:浓度c的测量误差与吸光度A的测量误差是一致的。偶然误差

在光度分析