免疫组化显色系统

免疫组化显色系统第一页，共三十页，2022年，8月28日免疫组化技术原理用标记物或显色物标记抗体或抗原通过免疫学中的抗原与已知抗体反应来检测组织或细胞内的抗原成分免疫组化染色是一项综合性技术组织材料的准备免疫组化染色前处理免疫组化染色(一抗,显色系统)第二页，共三十页，2022年，8月28日免疫组化原理图标注解一抗1一抗2抗兔二抗抗鼠二抗组织抗原1抗原2过氧化物酶碱性磷酸酶双染阻断剂显色剂(棕色)显色剂(红色)葡聚糖骨架分子第三页，共三十页，2022年，8月28日回顾过去直接法二步间接法三步间接法酶免疫复合物法链亲和素-生物素法(ABC)第四页，共三十页，2022年，8月28日目前常用的显色系统一步法:EPOS(EnhancedPolymerOne-StepStaining)二步法:EnVisionSystems双染:GeneralDoublestain

三步法:LSAB(LabeledSstreptavidin-biotin)催化放大系统:CSA(CatalyzedSignalAmplicationSystem)动物研究试剂盒:ARK(AnimalResearchKit)第五页，共三十页，2022年，8月28日一步法EPOS原理:

在一抗上通过多聚骨架标记过氧化物酶.即一抗上已标记过氧化物酶.这种一抗与抗原结合后即可直接显色.多聚骨架分子特异性一抗组织抗原过氧化物酶第六页，共三十页，2022年，8月28日一步法EPOS主要实验流程组织片脱蜡,水化阻断(S2001)TBS冲洗(S1968)一抗/HRP(U…)TBS冲洗(S1968)显色剂DAB或AEC(K3467或K0697)水漂洗素木精复染(S3309)第七页，共三十页，2022年，8月28日一步法EPOS特点:一抗孵育后直接显色即用型试剂快速(一步)完成敏感性较差昂贵使用对象:要求快速出结果的免疫组化实验对象第八页，共三十页，2022年，8月28日二步法EnVision原理:

在葡聚糖大分子上标记二抗及酶,将传统的二抗和三抗(酶)连接在一起,形成一个复合物EnVision.两步孵育完成免疫组化.第九页，共三十页，2022年，8月28日二步法EnVision原理图一抗与抗原结合EnVision二抗复合物与一抗结合第十页，共三十页，2022年，8月28日二步法EnVision主要实验流程阻断内过氧化酶(S2001)TBS冲洗(S1968)一抗孵育(Mo.Rb.)EnVision(Mo.K4001Rb.K4003)TBS冲洗(S1968)显色剂DAB或AEC(K3467或K0697)苏木精复染(S3309)TBS冲洗(S1968)

第十一页，共三十页，2022年，8月28日二步法EnVision

特点:

二抗及酶通过葡聚糖连成一个大分子试剂(避开了传统的生物素与链亲和素结合),不受内源性生物素干扰.即用,方便,快速(两步).敏感性强.背景低.是目前最理想的免疫组化显色系统使用对象可向所有做免疫组化的用户推荐.第十二页，共三十页，2022年，8月28日EnVision二步法双染原理:

与EnVision二步法原理相同,只是为达到在同一组织上标记两种抗原.必需用两种动物来源的一抗(常用抗小鼠和兔),分别配相应的EnVision(二抗),再用两种颜色的显色剂显色.第十三页，共三十页，2022年，8月28日EnVision二步法双染原理图鼠一抗接抗原1鼠EnV/HRP接抗鼠一抗DAB(显色剂1)双染阻断剂兔一抗接抗原2兔EnV/AP接抗兔一抗FastRed(显色剂2)第十四页，共三十页，2022年，8月28日EnVision二步法双染主要实验流程阻断内过氧化酶(S2001)TBS冲洗(S1968)一抗(1Mo.)孵育TBS冲洗(S1968)EnVision/HRP(1Mo.)TBS冲洗(S1968)显色剂1DAB(K3467)蒸馏水冲洗双染阻断剂(Kit含)一抗(2Rb.)孵育TBS冲洗(S1968)EnVision/AP(2Rb.)TBS冲洗(S1968)显色剂2FastRead(K0597)蒸馏水冲洗苏木精复染(S3309)第十五页，共三十页，2022年，8月28日EnVision二步法双染特点:即用,方便,快速,省时.敏感性强.背景低.在同一组织切片上,用两种不同标记物标记两种不同的抗原.使用对象需在同一张切片上标记两种抗原者主要是形态学科研人员第十六页，共三十页，2022年，8月28日三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)

原理:

应用生物素标记二抗与过氧化物酶或碱性磷酸酶标记链亲和素(Streptavidin)的亲和作用,连接一抗及抗原,形成大分子.再通过相应酶的底物(显色剂)作用使之显色.第十七页，共三十页，2022年，8月28日三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)原理图:一抗与抗原结合二抗/Bio与一抗结合STPA/HRP(AP)与二抗/Bio结合第十八页，共三十页，2022年，8月28日三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)主要实验流程阻断内过氧(S2001)TBS冲洗(S1968)一抗孵育(Mo.Rb.)TBS冲洗(S1968)

TBS冲洗(S1968)二抗/生物素(Mo.E354Rb.E353)TBS冲洗(S1968)显色剂DAB或AEC(K3467或K0697)FastRead(K0597或K0699)苏木精复染(S3309)链亲和素/HRP或AP蒸馏水冲洗第十九页，共三十页，2022年，8月28日三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)特点:便宜有现成的兔,鼠,羊通用试剂盒会有内源性生物素造成的非特异性背景使用对象可向所有做免疫组化的用户推荐.第二十页，共三十页，2022年，8月28日催化放大系统CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

原理在经典三步法免疫组化放大基础上,通过生物素化酪胺的催化,将又一次加入的酶标记链亲和素(Streptavidin-enzyme)与二抗中生物素亲和,使已放大的分子再一次放大.第二十一页，共三十页，2022年，8月28日催化放大系统CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

原理图一抗与抗原结合二抗/Bio与一抗结合STAV/Bio与二抗/Bio结合放大液催化加入STAV/HRP与Bio再结合第二十二页，共三十页，2022年，8月28日催化放大系统CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

主要实验流程:阻断内过氧(S2001)水洗TBS冲洗(S1968)二抗孵育(Rba-Mo/Bio)TBS冲洗(S1968)

放大液(Kit含)链亲和素/生物素Strep./Bio(Kit含)TBS冲洗(S1968)显色剂DAB或AEC(Kit含)苏木精复染(S3309)链亲和素/过氧化物酶Strep./HRP(Kit含)蒸馏水冲洗蛋白阻断剂(Kit含)一抗孵育(Mo)TBS冲洗(S1968)TBS冲洗(S1968)TBS冲洗(S1968)第二十三页，共三十页，2022年，8月28日催化放大系统CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

特点:敏感性极强实验步骤较多较贵使用对象:需做免疫组化实验者,特别适用于某些石蜡片不易出结果的一抗.第二十四页，共三十页，2022年，8月28日动物研究试剂盒

ARK

(AnimalResearchKit)原理在一抗与组织抗原反应之前:小鼠一抗F(c)与生物素化抗小鼠F(ab)片断结合,再加入小鼠免疫球蛋白,中和未被结合的生物素化抗小鼠F(ab).用该复合物再与小鼠组织中特异抗原反应,可降低非特异性背景.第二十五页，共三十页，2022年，8月28日动物研究试剂盒

ARK

(AnimalResearchKit)原理图小鼠一抗抗小鼠IgF(ab)/Bio免疫复合物/Bio和游离抗小鼠IgF(ab)/Bio免疫复合物/Bio和游离抗小鼠IgF(ab)/Bio小鼠Ig免疫复合物/Bio和被中和的抗小鼠IgF(ab)/Bio与组织抗原结合按LSAB法继续免疫组化染色第二十六页，共三十页，2022年，8月28日动物研究试剂盒

ARK

(AnimalResearchKit)主要实验步骤一抗与组织抗原反应之前需做试剂的预处理:小鼠一抗+抗小鼠Ig的F(ab)/Bio复合物1复合物1+小鼠Ig复合物2(已优化的一抗)用复合物2作为一抗同LSAB三步法免疫组化染色第二十七页，共三十页，2022年，8月28日动物研究试剂盒

ARK

(AnimalResearchKit)特点小鼠一抗在小鼠组织切片上做免疫组化可降低背景.使用对象需用小鼠一抗做小鼠组织的免疫组化实验者.第二十八页，共三十页，2022年，8月28日几种显色系统复杂与敏