基因诊断与基因治疗

基因诊断与基因治疗第1页/共52页第一节

基因诊断

GeneDiagnosis第2页/共52页基因诊断基因蛋白质性状生化诊断基因诊断临床诊断第3页/共52页

特点1．以基因做检查材料和检查目标，针对性强

2．分子杂交选用特定基因序列作探针，故特异性强

3．分子杂交和PCR具有放大效应，故灵敏度高

4．适用性强，诊断范围广基因诊断的概念和特点定义利用现代分子生物学技术，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。第4页/共52页、基因诊断的主要对象和样品来源主要是DNA分子，涉及到功能分析时，还可定量检测RNA（主要是mRNA）和蛋白质等分子。临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液等。对象：样品来源：第5页/共52页二、基因诊断技术分类定性分析定量分析基因分型检测基因突变测定基因拷贝数测定基因表达产物量基本流程：核酸抽提目的序列的扩增分子杂交信号检测第6页/共52页基因诊断常用技术方法（一）核酸分子杂交技术（二）聚合酶链式反应（三）基因测序（四）基因芯片第7页/共52页β珠蛋白链基因第6位密码子发生突变

GAG——GTGGlu——Vale.g.镰形细胞贫血的Gene诊断

限制性片断长度多态性分析（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)：这种方法对于点突变非常有效。由于基因突变，引起酶切部位的改变，导致限制性片断数目、每个片断长度不同。（一）核酸分子杂交技术第8页/共52页

已知限制酶Mst1识别序列（CCTNAGG）

CCTGAGG

CCTGTGG突变后不能识别酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。第9页/共52页Southernblot第10页/共52页（二）PCR技术

巢式PCR

多重PCR

RT-PCR

实时PCR

联合PCR第11页/共52页

PCR-单链构象多态性singlestrandconformationpolymorphism(SSCP)分析PCR-SSCP是在PCR技术基础上发展起来的一种简单、快速、经济的显示PCR反应产物中点突变的手段。原理：PCR产物经变性后可以产生2条互补的单链，不同的单链构象不同，如果存在基因突变，哪怕是只要有一个碱基发生改变，单链的构象也发生变化;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常与基因突变的DNA单链将在凝胶上显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型。优点：简单，较高的敏感性，可同时分析多个样本。第12页/共52页第13页/共52页（三）基因测序是最直接、最准确的基因诊断技术病例SOX9基因HMGbox内发生单碱基置换突变R178L(G→T)，左侧正常对照第225位碱基为C，而该患儿为A（反义链中）。

第14页/共52页三、基因诊断的应用

遗传疾病肿瘤感染性疾病，传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定第15页/共52页疾病致病基因突变类型诊断方法α地中海贫血α珠蛋白缺失为主Gap-PCR、DNA杂交、DHPLCβ地中海贫血β珠蛋白点突变为主反向点杂交、DHPLC甲型血友病凝血因子Ⅷ点突变为主PCR-RFLP乙型血友病凝血因子Ⅸ点突变、缺失等PCR-STR连锁分析苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶点突变PCR-STR连锁分析、ASO分子杂交马凡综合症原纤蛋白点突变、缺失PCR-VNTR连锁分析、DHPLC我国部分代表性常见单基因遗传病基因诊断第16页/共52页未病先防，既病防变第17页/共52页基因检测的现状目前可以用基因检测进行检测的疾病数1767种，其中1492种检测应用于临床，275种仅用于研究。美国早在1996年就开始了基因检测，2004年接受检测的人次数递增至400万，占人口比例1.57﹪，至2007年已有700多万人次。国内目前已经开展的基因检测项目包括：遗传病基因检测数十种，如遗传病的染色体检测，地中海贫血基因检测，G-6PD基因检测等；易感基因型检测400多种，如白细胞抗原（HLA）分型检测、多种癌症、糖尿病、冠心病、心肌梗死、动脉粥样硬化、高血压病、老年性痴呆等；第18页/共52页疾病易感基因检测适合于…...家族中有某种疾病的遗传病史者。某类疾病的高风险人群，如近亲或个人罹患慢性疾病，或者常处于污染环境者。有正确健康意识者。

第19页/共52页第二节

基因治疗

GeneTherapy第20页/共52页定义早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病的目的。一、基因治疗的概念第21页/共52页

20世纪60年代EdwardTatum提出基因水平上纠正缺陷基因的设想。以病毒为截体，体细胞为靶细胞的技术路线，从根本上解决遗传病的治疗问题。

1966年美国国立实验室的Rogers发现，接触兔乳头状病毒的实验工作人员中相当部分的血精氨酸降低。推测病毒核酸进入细胞使精氨酸酶活性升高。

1973年Rogers用shope兔乳头状瘤病毒感染一个患有精氨酸血症女孩的皮肤成纤维细胞，使细胞精氨酸酶活性上升，且可持续7个月。

1990年11月，美国NIH的Blease,Culver和Anderson进行了首例人体基因治疗临床试验。患ADA缺失症的4岁小女孩，利用反转录病毒将ADA基因转移到T淋巴细胞中，再回输。患者免疫力明显提高，取得了巨大成功。二、基因治疗历史第22页/共52页基因治疗的三要素：(NIH提出）

合适的目的基因

发病机制在DNA水平上已经清楚要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解

合适的基因转移方式

合适的基因表达与调控第23页/共52页三、基因治疗的基本策略（一）缺陷基因精确的原位修复基因矫正genecorrection基因置换genereplacement致病基因的突变碱基进行纠正用正常基因通过重组原位替换致病基因这两种方法属于对缺陷基因精确的原位修复，既不破坏整个基因组的结构，又可达到治疗疾病的目的，是最为理想的治疗方法。第24页/共52页（二）基因增补不删除突变的致病基因，而在基因组的某一位点额外插入正常基因，在体内表达出功能正常的蛋白质，达到治疗疾病的目的。这种对基因进行异位替代的方法称为基因添加（geneaugmentation）或称基因增补，是目前临床上使用的主要基因治疗策略。第25页/共52页（三）基因沉默或失活有些疾病是由于某一或某些基因的过度表达引起的，向患者体内导入有抑制基因表达作用的核酸，如反义RNA、核酶、干扰小RNA等，可降解相应的mRNA或抑制其翻译，阻断致病基因的异常表达，从而达到治疗疾病的目的。这一策略称为基因失活（geneinactivation）或基因沉默（genesilencing）。第26页/共52页反义RNA

定义：与mRNA或其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合即抑制了该mRNA的翻译，是原核生物基因表达调控的一种方式，在真核生物中也存在反义RNA。第27页/共52页特点（l）安全性高，专一性强，效率高。反义RNA只作用于特异的mRNA分子，不改变所调节基因的结构。反义RNA分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解，不留“残渣”（2）设计和制备方便（3）具有剂量调节效应（4）在治疗RNA病毒感染性疾病时有更大的优势。能直接作用于一些RNA病毒，阻断RNA病毒的繁殖第28页/共52页（四）自杀基因治疗

将“自杀基因”导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀效应”，从而清除肿瘤细胞。为恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。第29页/共52页

自杀基因的类型胸苷激酶基因thymidinekinase(TK)

胞嘧啶脱氨酶基因cytosinedeaminase(CD)5-FC5氟胞嘧啶5-FU5氟尿嘧啶CDGanciclovir,GCV丙氧鸟苷TKGCV-ATP丙氧鸟苷三磷酸第30页/共52页

自杀基因的旁观者效应

“自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。第31页/共52页（五）基因免疫治疗(基因疫苗)定义通过将抗癌免疫增强细胞因子（TNF,干扰素，IL-2)或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。第32页/共52页三、基因治疗的基本程序治疗性基因的选择基因载体的选择靶细胞的选择基因转移外源基因表达的筛选

利用在体中的标记基因回输体内病毒载体非病毒载体体细胞生殖细胞间接体内疗法直接体内疗法第33页/共52页（一）选择治疗基因许多分泌性蛋白质如生长因子、多肽类激素、细胞因子、可溶性受体（人工构建的去除膜结合特征的受体），以及非分泌性蛋白质如受体、酶、转录因子的正常基因都可作为治疗基因。简言之，只要清楚引起某种疾病的突变基因是什么，就可用其对应的正常基因或经改造的基因作为治疗基因。第34页/共52页（二）基因载体的选择

基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。

病毒载体：逆转录病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺相关的病毒(AAV)等。

非病毒载体：这类载体的发展较快，目前主要是脂质体。第35页/共52页（三）靶细胞的选择----分为生殖细胞和体细胞两大类,现阶段只限于应用体细胞靶细胞选择的原则:1.易操作;2.易培养;3.易接受外源基因;4.在体内能持久高效表达目前常用的靶细胞包括：成纤维细胞、淋巴细胞、上皮细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞等第36页/共52页（四）基因转移方法化学方法——磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法物理方法——电穿孔法、粒子轰击法（基因枪）病毒法——主要通过携带有外源基因的病毒载体感染靶细胞来实现基因的转移。膜融合法——细胞融合法、脂质体介导法、原生质体融合法、微细胞核介导法等

第37页/共52页间接体内疗法目的基因转移到体外培养的靶细胞内高效表达，然后将靶细胞回输体内直接体内疗法将目的基因在体内直接转移到靶细胞载体：需要有特异导向性和高转移效率将治疗基因导入人体第38页/共52页载体目的基因invivoexvivo靶细胞第39页/共52页（五）治疗基因表达的检测无论以何种方法导入基因，都需要检测这些基因是否能被正确表达。被导入基因的表达状态可以用PCR、RNA印迹、蛋白印迹及ELISA等方法去检测。对于导入基因是否整合到基因组以及整合的部位，可以用DNA印迹技术进行分析。第40页/共52页（六）回输体内方式：静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等基因修饰的淋巴细胞以静脉注射的方式回输到血液中；将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组织；采用自体骨髓移植的方法输入造血细胞；或以导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。

第41页/共52页腺苷脱氨酶(ADA,AdenosineDeaminase))缺乏的

严重联合免疫缺陷(SCID,severecombinedimmunodeficiencysyndrome)病因淋巴细胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆积破坏免疫功能患儿很少活到成年(bubble-babysyndrome;verylowTcellcounts)第42页/共52页治疗基本步骤:ADA基因+逆转录病毒载体导入患者淋巴细胞体外扩增回输病人体内淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%

维持免疫系统功能,改善病人症状第43页/共52页基因治疗成功范例

ADA缺乏症基因治疗

1990年9月,一位四岁的ADA缺乏症女孩接受了首例基因治疗患者注入10亿个遗传修饰的T淋巴细胞,约每月1次,连续1年,ADA水平从1%上升到20%,淋巴细胞数量正常,免疫功能正常1991年,另一位9岁患者基因治疗也取得成功,他们从隔离病房走向了美好生活.第44页/共52页肿瘤的细胞疗法CIK细胞：细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokines-inducedkillercells）；CIK细胞是人体内正常的具有很强杀伤肿瘤细胞作用的免疫T淋巴细胞，但数量很少，在患肿瘤后略有所增加；体外增殖培养CIK细胞到9-10亿数量后，回输人体，以快速识别并杀伤体内各部位肿瘤细胞，并诱导体内CIK细胞的增殖，从而达到治疗肿瘤的目的。肿瘤的靶向治疗

第45页/共52页四、基因治疗的应用与展望应用展望