小肠结肠炎耶尔森氏菌

食品卫生微生物学检验

小肠结肠炎耶尔森氏菌检验1范围本标准规定了食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersiniaenterocoli的i检验方法。本标准适用于食品和食源性疾病样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.4食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验3设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：冰箱：2°C〜5°C。恒温培养箱：26C±lC、36C±lC。显微镜：10X〜100X。3.4均质器或灭菌乳钵。天平：感量0.1g。灭菌试管：16mmx160mm、15mmx100mm。灭菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。灭菌锥形瓶：200mL、500mL。3.9灭菌培养皿：直径90mm。3.10全自动细菌生化鉴定仪，如VITEK。4培养基和试剂4.1改良磷酸盐缓冲液：见第A.1章。4.2CIN-1培养基：见第A.2章。4.3改良Y培养基：见第A.3章。4.4改良克氏双糖培养基：见第A.4章。4.5糖发酵管：见第A.5章。4.6鸟氨酸脱羧酶试验培养基：见第A.6章。4.7半固体琼脂：见第A.7章。4.8缓冲葡萄糖蛋白胨水［甲基红（MR）和V—P试验用］：见第A.8章。4.9碱处理液：见第A.9章。4.10尿素培养基：见第A.10章。4.11API20E生化鉴定试剂盒或VITEKGNI+生化鉴定卡。

5检验程序小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见图1。图1小肠结肠炎耶尔森氏茵检验程序6操作步骤6.1增菌以无菌操作称取25g（或25mL）样品放入含有225mL改良磷酸盐缓冲液的无菌均质杯或均质袋中，以8000r/min均质lmin或拍击式均质器均质1min。液体样品或粉末状样品，应振荡混匀。于26°C±l°C增菌48h〜72h。6.2碱处理除乳及其制品外，其他食品的增菌液0.5mL与碱处理液4.5mL充分混合l5s。6.3分离将乳及其制品增菌液或经过碱处理的其他食品增菌液分别接种CIN-1琼脂平板和改良Y琼脂平板，于26°C±l°C培养48h±2h,典型菌落在CIN-1琼脂平板上为红色牛眼状菌落，在改良Y琼脂平板上为无色透明、不粘稠的菌落。6.4改良克氏双糖试验分别挑取上述可疑菌落3个〜5个，接种改良克氏双糖斜面，于26C±lC培养24h,将斜面和底部皆变黄不产气者做进一步的生化鉴定。6.5尿素酶试验和动力观察将改良克氏双糖上的可疑培养物接种到尿素培养基上，注意接种量要大，挑取一接种环，振摇几秒钟，于26C土1C培养2h〜4h，然后将阳性者接种两管半固体，分别于26C±lC和36C±1C恒温培养箱中培养24h。将26C有动力的可疑菌落接种营养琼脂平板，进行革兰氏染色和生化试验。6.6革兰氏染色镜检小肠结肠炎耶尔森氏菌呈革兰氏阴性球杆菌，有时呈椭圆或杆状，大小为(0.8pm〜3.0pm)x0.8pmo6.7生化鉴定6.7.1常规生化鉴定：从营养琼脂平板上挑取单个菌落做生化试验，所有的生化反应皆在26C±lC培养。小肠结肠炎耶尔森氏菌的主要生化特性以及与其他菌的区别见表1o表1小肠结肠炎耶尔森氏茵与其他相似茵的生化性状鉴别表项目小肠结肠炎耶尔森氏菌中间型耶尔森氏菌弗氏耶尔森氏菌克氏耶尔森氏菌假结核耶尔森氏菌鼠疫耶尔森氏菌动力(26C)+++++-尿素酶+++++-VP试验(26C)+++---鸟氨酸脱羧酶++++--蔗糖d++---棉子糖-+---d山梨醇++++--甘露醇++++++鼠李糖-++--+注：+阳性；-阴性；d有不同生化型。6.7.2生化鉴定系统可选择使用两种生化鉴定系统(APl20E或VITEKGNI+)中任一种，代替常规的生化鉴定。API20E：从营养琼脂平板上挑取单个菌落，按照API20E操作手册进行并判读结果。VITEK全自动细菌生化分析仪：从营养琼脂平板上挑取单个菌落，按照VITEKGNI+操作手册进行并判定结果。6.8血清型鉴定除进行生化鉴定外，可选择做血清型鉴定。具体操作方法按GB/T4789.4中沙门氏菌0因子血清分型。7结果报告综合以上生化特性报告结果，报告25g（或25mL）样品中检出或未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌。附录A

(规范性附录)

培养基和试剂A.1改良磷酸盐缓冲液A.1.1成分磷酸氢二钠8.23g磷酸二氢钠1.2gTOC\o"1-5"\h\z氯化钠5.0g三号胆盐1.5g山梨醇20gA.1.2制法将磷酸盐及氯化钠溶于蒸馏水中，再加入三号胆盐及山梨醇，溶解后校正pH为7.6,分装试管，于121°C高压灭菌15min,备用。A.2CIN-1培养基A.2.1基础培养基：TOC\o"1-5"\h\z胰胨20.0g酵母浸膏2.0g甘露醇20.0g氯化钠1.0g去氧胆酸钠2.0g硫酸镁0.01g琼脂l2.0g蒸馏水950mLpH7.5±0.1将基础培养基于121C高压灭菌15min,备用。A.2.2Irgasan:以95%的乙醇作溶剂，溶解二苯醚，配成0.4%的溶液，待基础培养基冷至80C时，加入1mL混匀。A.2.3冷至50C时，加入：中性红(3mg/mL)10.0mL结晶紫(0.1mg/mL)10.0mL头孢菌素(1.5mg/mL)10.0mL新生霉素(0.25mg/mL)10.0mL最后不断搅拌加入l0.0mL的10%氯化锶，倾注平皿。A.3改良Y培养基A.3.1成分TOC\o"1-5"\h\z蛋白胨15.0g氯化钠5.0g乳糖l0.0g草酸钠2.0g去氧胆酸钠6.0g三号胆盐5.0g丙酮酸钠2.0g孟加拉红40mg水解酪蛋白5.0g琼脂17g蒸馏水1000ml.A.3.2制法将上述成分混合，校正pH7.4±0.1。于121^高压灭菌15min,待冷至45°C左右时，倾注平皿。A.4改良克氏双糖培养基A.4.1成分TOC\o"1-5"\h\z蛋白胨20g牛肉膏3g酵母膏3g山梨醇20g葡萄糖1g氯化钠5g柠檬酸铁铵0.5g硫代硫酸钠0.5g琼脂12g酚红0.025g蒸馏水1000mlpH7.4A.4.2制法将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正？氏加入0.o2%的酚ETJ（溶液12.5mL,摇匀，分装试管，装量宜多些，以便得到比较高的底层°l21C高压灭菌15rain，放置高层斜面备用。A.5糖发酵管A.5.1成分TOC\o"1-5"\h\z牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠3g磷酸氢二钠2g0.2%漠麝香草酚蓝溶液12mL蒸馏水1000mLpH7.4A.5.2制法A.5.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121C高压灭菌15min。A.5.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶l00mL，121C高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。A.5.3试验方法从琼脂斜面上挑取少量培养物接种于26°C±l°C培养，一般观察2d〜3d。迟缓反应需观察14d〜30d。A,6鸟氨酸脱羧酶试验培养基A.6.1成分蛋白胨5g酵母浸膏3g葡萄糖1g蒸馏水1000mL1.6%漠甲酚紫-乙醇溶液1mLL-鸟氨酸或DL-鸟氨酸0.5g/100mL或1g/100mLpH6.8A.6.2制法除鸟氨酸以外的成分加热溶解后，分装，每瓶100mL,分别加入鸟氨酸。L-鸟氨酸按0.5%加入，DL-鸟氨酸按1%加人。再校正pH至6.8。对照培养基不加鸟氨酸。分装于无菌的小试管内，每管0.5mL,上面滴加一层液体石蜡，115C高压灭菌10min。A.6.3试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于26C±lC培养18h〜24h，观察结果。鸟氨酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管为黄色。A.7半固体琼脂A.7.1成分蛋白胨1g牛肉膏0.3g氯化钠0.5g琼脂0.35g〜0.4g蒸馏水100mLpH7.4A.7.2制法按以上成分配好，煮沸使溶解，并校正pH。分装小试管，121C高压灭菌15min，直立凝固备用。注：供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。A.8缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR和V—P试验用）A.8.1成分TOC\o"1-5"\h\z磷酸氢二钾5g多胨7g葡萄糖5g蒸馏水1000mLpH7.0A.8.2制法溶化后校正pH,分装试管，每管1mL,121°C高压灭菌15min。A.8.3甲基红(MR)试验自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中，于26C±lC培养2d〜5d,哈夫尼亚菌则应在22C〜25C培养。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。甲基红试剂配法：10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸馏水。A.8.4V-P试验用琼脂培养物接种本培养基中，于26C±lC培养2d〜4d。哈夫尼亚菌则应在22C〜25C培养。加入6%o-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36C土lC培养4h再进行观察。A.9碱处理液A.9.10.5%氯化钠溶液氯化钠0.5g蒸馏水100mLA.9.20.5%氢氧化钾溶液氢氧化钾0.5g蒸馏水100mLA.9.3制法将0.5%