抗氧化酶活性等测定方法

抗氧化酶活性等测定方法叶绿体的提取一、试剂配置1、 PBS 提 取 液： 每 L 水 依 次 加 入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl（0.010×58.5=0.585g）、MgCl0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入 ASA-Na198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将 PBS 提取液中的 MES 换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol200ml;40%Percol200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）2二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mMMESPH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mMNaCl，2mMMgCl2，2mMEDTA，0.5mMKH2PO4，2mMASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小， 4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值 (水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mMHEPESpH7.6，含0.33mM山梨糖醇，10mMNaCl，2mMMgCl2，2mMEDTA，0.5mMKH2PO4，2mMASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点，含叶绿素2mg.ml-1以上，这样有利于保持活性。36、2000g1min;7、沉淀再用悬浮液悬浮 ;(悬浮液同5，可以不做)8、用Percol试剂进行梯度离心（将3ml含有80%Percol（原液按100%算）铺在10ml离心管下层，再把3ml40%Percol铺在离心管中层，然后将1ml叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层）1500g2-3min（用水平离心头的离心机，离心机加速要缓慢上升，加速度调到 1），下降也要缓慢下降，否则会破碎Percol的浓度梯度层的形成，取出会看到3层绿色带，最上层为破碎的叶绿体，沉在地层的为粗颗粒，40-80%的Percol之间的界面有一层绿色层为完整的叶绿体;9、小心吸出，转移到悬浮介质中，使叶绿体浓度达到1mg.ml-1；（计算：取叶绿体悬浮液 0.1ml，加4.9ml80%的丙酮，摇匀后于 1000g离心2min，上清液置于 1cm的比色杯，在 625nm 上比色，按照公式计算：OD625nm×50/34.5=叶绿素mg/ml）10、测定叶绿体的完整性，完整率达到 85-95%；参考：TakedaK,OtauboT,KondaN.ParticipationofhydrogenperoxideintheinactivationofCalvin-cycleSHenzymeinso2-furmugatedspinachleaves.PlantandcellPhysiology,1982,23:1009-1018.4取上述制备的完整叶绿体进行如下测定：1、用50mMPBS（保护酶或其他测定项目的缓冲液）稀释2-5倍，用于测定SOD、POD、CAT、APX；2、用冷丙酮稀释 2倍，取 0.5ML 提取液用于测定H2O2；（本试验中用0.2mol/LHClO4稀释）3、用5%的TCA稀释2-5倍，取1.5ml用于测定MDA；4、用乙醇：丙酮：水=4.5：4.5：1稀释，用于测定叶绿素；抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到 1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取 A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸5馏水定容至1000ml。参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术 .高等教育出版社， 2000：267～268。2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。3）30μMEDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至 100ml。4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。5）2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100ml，避光保存。（上述试剂先配好，放到4度冰箱，用之前临时按下面的方法配，然后放在4度冰箱中，不要在最上层，避免见光，第一组样品加好后拿出来加，加完后放回冰箱，第二组的样品加好后再拿出来加）酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met6溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml（加的量和前面的浓度要核对），磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；SOD反应混合液：3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200ml)（2）分别取3ml反应混合液和30μl（可视情况调整，最好先做一个浓度梯度，看加多少合适，如果量太少，最好稀释后再加，这样精确 ）酶液于试管中（尽可能加到试管的底部，要靠着试管壁打下去先加酶液，后加反应液，加好后摇一摇，看看试管上是不是有雾气，最好拿纱布把试管下边擦一下，免得雾气挡住光线照过去）；3）将试管置于光照培养箱中在4000lux光照下反应20min；（照光很重要，试管要选择相同规格的，因为不同的试管透光率是不一样的，试管架不要选择遮光7的，这个最好分组做，同时几组做相互之间会遮光，每一组一个重复，就是每一组中都要有所有的处理，且都要有一个最大管，处理多的话，把根和叶分开做，最大管放在中间）同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μlPBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量 ）为1个酶活单位（u）。SOD总活性＝[(Ack-AE)×V]/（1/2Ack×W×Vt）SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gFW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用8量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。二、POD、CAT酶活性的测定粗酶液制备同SOD。1、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）（1）试剂配制：0.2mol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取 A 母液(Na2HPO4)123ml和B母液(NaH2PO4)877ml混匀即为1000mlPBS(0.2M，pH6.0)；（2）反应混合液配制（以 60个样为准）：取200mlPBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。POD反应混合液：3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3 次测定=162ml(实际配置 200ml, 0.076ml,0.112ml)（3）样品测定：取3ml反应液并加入30μl酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40秒）。（边加样边测定，9测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大 ）4）酶活性计算：以每minOD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。POD=（ A470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/gmin)A470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，(1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。2、过氧化氢酶（CAT）活性测定（1）试剂配制：0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4)457.5ml和B母液(NaH2PO4)292.5ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。2）反应液配制：取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。CAT反应液：3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200ml,0.3092ml)3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫10外）（测定40s）。（4）酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。CAT=[ A240×Vt]/（W×Vs×0.01×t） (u/gmin)A240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml,0.1ml）。三、抗坏血酸过氧化物酶（ APX）活性的测定（缓冲液为 K）1、试剂配制（按 50个样计算）：1）0.05mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH7.0）的配制：A）K2HPO4·3H2O：228.22×0.05×0.61=6.9607gB）KH2PO4：136.09×0.05×0.39=2.6538g，以上两者混合起来用去离子水定容到1L。2）0.1mMEDTA-Na2：取0.01861gEDTA-Na2用PBS溶液定容到500ml（372.24g/M×0.1mM×500ml=0.01861g）；3）5mMAsA：取0.044g抗坏血酸用PBS溶液定容到50ml（现用现配，176.13g/M5mM×50ml=0.044g）；4）20mMH2O2：取0.2ml,30%H2O2用去离子水11稀 释 到 100ml （ 30% H2O2 为550g×30%/(34.01g/M×0.5L)=9.703M）。实际配置0.1mM EDTA-Na2：3个处理*2个品种*3次重复*1.7ml*3次测定=91.8ml;（实际配置250ml,0.009305g）5mM的AsA:3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;（实际配置50ml,0.044g）20mMH2O2:3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;（实际配置50ml,0.1ml）2、酶活性的测定（以 2ml体系测定）1）取0.10ml酶液（可视情况调整），加入1.70ml含0.1mMEDTA-Na2的PBS（0.05mol/L，pH7.0），再加入0.10ml5mM的AsA，最后加入0.10ml20mMH2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在40s内（测定时间内变化大可测定的时间短点， 否则长点）的变化，计算单位时间内AsA减少量和酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。计算公式：12OD/△t×Vr×VTA×d×Vt×W△OD为反应时间内吸光度的变化（40秒吸光度－0秒吸光度）；△t为反应时间（40秒）；Vr为反应液体积2mL）；VT提取液体积（1.6mL）；A为消光系数2.8mM-1.cm-1）；d为比色杯厚度（1cm）；Vt测定液体积（0.1mL）；W为样品鲜重（0.2g）。四、超氧阴离子自由基（ O2.-）产生速率的测定（羟胺氧化法）1、试剂的配制1）1mM盐酸羟胺溶液：称取0.02085g盐酸羟胺用蒸馏水定容至300ml；2）17mM对氨基苯磺酸溶液：称取1.1776g对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1：3配制）加热溶解后定容至400ml；3）7mMα-萘胺溶液：称取0.4008gα-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3：1配制）定容至400ml。实际配置PBS（0.05M，pH7.8）:3个处理*2个品种*3次重复*0.5ml*3次测定=27ml;（实际配置100ml）1mM盐酸羟胺溶液:3个处理*2个品种*3次重复13*1ml*3次测定=54ml;（实际配置100ml,0.00695g）17mM对氨基苯磺酸:3个处理*2个品种*3次重复*1ml*3次测定=54ml;（实际配置100ml,0.2944g）7mMα-萘胺溶液：3个处理*2个品种*3次重复*1ml*3次测定=54ml;（实际配置100ml,0.1004g）2、O2.-含量的测定1）样品液提取方法同SOD测定；2）取0.5ml提取液（酶液）（可视情况调整用量）中加入0.5mlPBS（0.05M，pH7.8），1ml1mM盐酸羟胺溶液后摇匀。3）在25℃下保温1小时；4）依次先加入1ml17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml7mMα-萘胺，混合后快速摇匀；5）在25℃下保温20min后在3000×g下离心3min后马上进行测定（或置于冰箱待测）；6）以对照管调零（用水调零），取粉红色水相液测定OD530值（测定）；7）O2.-含量的计算：由测得的OD530，查NO2-标准曲线得到[NO2-]；根据羟胺与O2.-的反应式：NH2OH14＋2O2.-＋H+NO2-＋H222O计算[O2.-]，即O＋H[NO2-]×2=[O2.-]；再根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，求得O2.-产生速率（以nmolmin-1mg-1蛋白表示，也可以nmolmin-1g-1鲜重表示）。.-产生速率=（C×V）/（t×W）（nmolmin-1-1O2g鲜重）C为标准曲线上查得的浓度(umol/L)；V为测定时所取提取液用量(叶绿体稀释后的体积)；t为反应时间(60min)；W为样品鲜重(叶绿体实际质量g)参考文献：王爱国，罗广华．植物生理学通讯， 1990，（6）：55～57五、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）1、试剂的配制1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100mg考马斯亮蓝，溶于50ml90％乙醇中，加入100ml85％（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1Ｌ。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。（2）100μg/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取25mgBSA加水溶解后定容至100ml，再从中吸取40ml用蒸馏水定容至100ml（也可取10mgBSA定容至100ml即为100μg/ml标准BSA溶液）。实际配置150.05M，pH7.8磷酸缓冲液：3个处理*2个品种*3次重复*0.08ml*3次测定=0.3456ml;（实际配置100ml,）考马斯亮蓝溶液 :3个处理*2个品种*3 次重复*2.9ml*3次测定=156.6ml;（实际配置200ml，20mg）2、样品可溶性蛋白含量的测定1）样品可溶性蛋白含量测定：取20μl提取液（酶液）加入80μl，0.05M，pH7.8磷酸缓冲液（即稀释成0.1ml提取液），再加入2.9ml考马斯亮蓝溶液，反应2min后测OD595（以100μl缓冲液加2.9ml考马斯亮蓝为对照调零）。（2）蛋白质含量计算：可溶性蛋白质含量（mg/g）=(C×VT)/(W×VS×1000)C为标准曲线查得的蛋白质含量（μg）；VT为提取液总体积（稀释后的体积ml）；VS为测定时所用提取液体积（ml，20μl）；W为样品鲜重（g）。过氧化氢（H2O2）含量的测定一、试剂配制：1、0.2mol/LHClO4：取10.05gHClO4溶解于0.5L的水中；2、4mol/LKOH：取112gKOH溶解于0.5L的水中；163、0.1 mol/L ，pH 6.5 的磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O5.6407g+NaH2PO4·2H2O5.3433g用去离子水定容到500ml；4、显色液：100mL、0.1mol/L、pH6.5的磷酸缓冲液+25μLN,N-二甲基苯胺+10mg4-氨基氨替吡啉；5、过氧化物酶溶液（250U/mL）二、测定步骤：称取植株根和叶片组织各0.5g，分别置于研钵中，加入1.6mL预冷至4℃的0.2mol/LHClO4，冰浴匀浆，于10000×g离心5min（4℃），取上清液，加4mol/LKOH调pH值为7.5后，再于10000×g离心5min（4℃），取上清液1mL，加0.4mL显色液和0.1mL过氧化物酶溶液（250U/mL），用岛津UV-1601分光光度计测定波长550nm（可见）处光密度值的变化，H2O2含量以μmol/gFW表示。（用什么调零？）三、计算方法：（要做标线？）参考：过氧化氢（ H2O2）含量的测定参照 Uchida等(2002)方法并加以改进。还原型谷胱苷肽 GSH2． 试剂配制（1）1mMGSH标准液10mL（现用现配）：称3.0733mgGSH,加蒸馏水至10mL。(不要)（2）5％磺基水杨酸500mL：25g溶于500mL水中。173）6mMDTNB：称取0.118905gDTNB溶于50mLPBS（0.1M，pH7.5）中。4）2mMNADPH：18.1mgNADPH溶于10mLPBS中。5）1mMGSSG标准液10mL：6.126mgGSSG加PBS至10mL。(不要)实际配置0.1MPBS(pH7.5):3个处理*2个品种*3次重复*0.5ml*3次测定=27ml;（实际配置50ml）6mMDTNB: 3个处理*2个品种*3次重复*0.2ml*3次测定=10.8ml;（实际配置50ml，实际用量0.1189g）2mM NADPH: 3个处理*2 个品种*3 次重复*0.1ml*3 次测定=5.4ml;（实际配置 50ml,实际用量18.1mg）(1U)GRⅢ:3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;（实际配置50ml,实际用量10ml）5％磺基水杨酸： 3个处理*2个品种*3次重复18*0.01ml*3次测定=0.54ml;（实际配置10ml）(实际用量0.5g/10ml)0.5mMPBS:3个处理*2个品种*3次重复*1.5ml*3次测定=81ml;（实际配置100ml）乙醚（二乙醚）:3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml;（实际配置1000ml）PBSBuffer0.5mM:3个处理*2个品种*3次重复*1.5ml*3次测定=81ml;（实际配置150ml）2-乙烯吡啶:3个处理*2个品种*3次重复*0.2ml*3次测定=10.8ml;（实际用量20ml）乙醚:3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml;（实际用量1000ml）1．标线制作：配制浓度为0，0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM的标准GSH溶液（吸取上述标准液各0.1mL）加入0.5mL0.1M磷酸钠Buffer（pH7.5）(含5mMEDTA)，0.2mL196mMDTNB,0.1mL2mMNADPH,0.1mL(1U)GR Ⅲ（谷胱甘肽还原酶）(sigma),从0.1mLGSH启动反应，测定650s的A412（OD412），绘制标准曲线。以PBS代替DTNB作空白。3． GSH（还原型谷胱甘肽）及GSSH（氧化型谷胱甘肽）（1）取1g新鲜叶片，加入10μL（可以取0.2g鲜样，加1.6ml提取液）5％磺基水杨酸，研磨后在14000g离心10分钟，取1mL上清液，加入1.5mL,0.5mMPBS（pH7.5）中，再用5mL乙醚（二乙醚）抽取二次（杂质会融到乙醚层中，而乙醚处于整个反应体系得上层，你直接用枪吸取上层乙醚丢弃即可，反复进行两次即为抽取两次），此提取液用于分析总谷胱苷肽含量。各取1mL上清液，加入1.5mLPBSBuffer0.5mM(pH7.5),0.2mL2-乙烯吡啶（原装试剂浓度）混合至乳胶状，在25℃反应1小时，再用5mL乙醚（原装试剂浓度）抽提2次，此提取液用于分析GSSG『GSSG－氧20化型谷胱甘肽， GSH－还原型谷胱甘肽不能够直接测出，需测出氧化型和还原型谷胱甘肽含量，即总的谷胱甘肽含量，然后减去氧化型谷胱甘