口腔微生物学牙菌斑

教材：指定参考书：1.周学东主编口腔微生态学，人民卫生出版社，20132.周学东主编微生物生物膜与感染，人民卫生出版社，2012周学东主编实用口腔微生物学与技术，人民卫生出版社，2009当前1页，总共103页。

一、牙菌斑的定义（掌握）二、牙菌斑的分类（了解）三、牙菌斑的基本结构（掌握）四、牙菌斑的组成（了解）五、牙菌斑的形成和发育（掌握）六、牙菌斑的物质代谢（了解）七、牙菌斑的致病性（了解）主要内容当前2页，总共103页。牙菌斑（肉眼）当前3页，总共103页。当前4页，总共103页。

牙菌斑（LM）当前5页，总共103页。牙菌斑细菌及EPS成分三维重建(CLSM)24h48h72h当前6页，总共103页。P.gS.mS.salivariusS.sanguinis玻片树脂

玻璃离子不同牙科材料表面口腔细菌黏附FISH技术当前7页，总共103页。一、定义当前8页，总共103页。1683年——发现牙面沉积物中有微小生物体（VanLeuwenhoek）1890年——首次详细论证了细菌、酸和龋病三者的关系（WilloughbyD.Miller）1897年——首先提出牙菌斑的概念（JamesLeonWilliams）1937年——牙面上的微生物必须依赖于牙面特定的菌斑环境代谢产酸（Forsdick）1963年——牙菌斑是附着在牙面上不易被漱口液清洗掉的软而粘的物质（Dawes）

早期对牙菌斑的认识当前9页，总共103页。牙菌斑(dentalplaque)存在于牙面或牙周袋内的一个细菌生态环境，细菌在其中生长、发育和衰亡，并进行着复杂的物质代谢活动，在一定条件下，细菌及其代谢产物将会对牙齿和牙周组织产生破坏JamesLeonWilliams(April18,1852–February23,1932),Americanprosthodontistandpioneerdentalhistologist当前10页，总共103页。

各种细菌嵌于来自其自身和/或外界环境的胞外基质内，而在固相界面上结成的有着三维立体结构的微生态环境，牙菌斑就是一种经典的生物膜JOHNWILLIAMCOSTERTON(July21st,1934-May12th,2012)

“thefatherofbiofilm”生物膜（biofilm）当前11页，总共103页。牙菌斑生物膜示意图当前12页，总共103页。当前13页，总共103页。

牙菌斑生物膜是牙面上或牙周袋内的多种菌丛构成的生态系。细菌在内生长、发育和衰亡。其复杂的结构使它能包涵对氧不同敏感性的细菌，这些细菌嵌入在由多糖、蛋白质和矿物质组成的基质中。细菌在其中的代谢活动，影响着细菌与宿主之间或细菌菌属之间的动态平衡

牙菌斑生物膜当前14页，总共103页。节制细菌代谢活性和保护菌丛抵抗口腔苛刻环境，使细菌在不适合的条件中仍能存留。膜内高水平的巯基能中和氧基，保护菌细胞免受氧化损伤。膜内的多聚物基质起约束网络作用，摄取和收藏食物，控制基质成分的移动速度。浓缩从环境中来的营养物质和其它元素，保留一些细胞内遗漏出来的溶解物质（如eDNA）。细菌耐药性生物膜的作用当前15页，总共103页。二、分类当前16页，总共103页。

龈缘为界:龈上菌斑龈下菌斑：附着菌斑，非附着菌斑

（一）根据所在部位分类当前17页，总共103页。

1．龈上菌斑（supragingivalplaque）位于牙颈部龈缘以上牙面上的菌斑。包括窝沟菌斑、光滑面菌斑、邻面菌斑、颈缘菌斑。这种菌斑的结构比较完整，主要细菌是革兰阳性球菌、杆菌。随着菌斑成熟，革兰阴性球菌、杆菌和丝状菌的数量增多。当前18页，总共103页。牙龈萎缩当前19页，总共103页。2．龈下菌斑(subgingivalplaque)位于龈缘以下，分布在龈沟或牙周袋内，分为附着龈下菌斑和非附着龈下菌斑。当前20页，总共103页。附着龈下菌斑非附着龈下菌斑当前21页，总共103页。＊非附着龈下菌斑

位于附着龈下菌斑的表面，为结构较松散的菌群，直接与龈沟上皮和袋内上皮接触，主要为格兰阴性厌氧菌，还包括许多能动菌和螺旋体＊附着龈下菌斑由龈上菌斑延伸到牙周袋内，附着于牙根面，其结构、成分与龈上菌斑相似，细菌种类增多，主要为格兰阳性球菌及杆菌、丝状菌，还可见少量格兰阴性短杆菌和螺旋体当前22页，总共103页。龈上、龈下菌斑的主要特征特征\菌斑龈上菌斑龈下菌斑生长环境有氧、兼性厌氧兼性、专性厌氧优势菌G+需氧菌和兼性菌G-厌氧菌和能动菌唾液清洁+-食物摩擦+-代谢底物糖类血清蛋白、氨基酸、糖宿主防卫机制唾液Ig

血清Ig当前23页，总共103页。1.致龋菌斑

与龋病发生有关的牙菌斑，多位于牙齿的咬合面、光滑面、邻面和颈缘。主要的致病产物是各种有机酸，如乳酸。（二）根据致病作用分类当前24页，总共103页。

（1）利用蔗糖的速度快，乳酸产生速度快；（2）产生多糖的速度快，接触蔗糖15分钟内20%以上转化为细胞内多糖；（3）变链球菌的数量多，而非致龋性菌斑中血链球菌的数量多；（4）与产碱代谢相关酶（尿素酶、精氨酸脱亚

胺酶）的活性较非致龋菌斑低致龋性菌斑的主要生物学特征:当前25页，总共103页。

2.致牙周病菌斑指位于龈缘和牙周袋内，与牙周疾病发生有关的菌斑。此类菌斑因所处的生态环境不同，含更多的专性厌氧菌，如螺旋体。主要致病产物是破坏性酶和毒素专性厌氧产黑色素当前26页，总共103页。牙周复合体Socranskyet.al.1998.JClinPeriodontolMostcommonlyfoundinpatientswithperiodontaldiseaseFoundinbothhealthypatientsandinperiodontallesions当前27页，总共103页。三、基本结构当前28页，总共103页。

牙菌斑的基本结构（LM）基底层表层中间层当前29页，总共103页。

牙菌斑紧靠牙面的获得性膜，无细菌的均质性结构，HE染色呈红色，厚度一般在1-10μm

（一）基底层当前30页，总共103页。EnamelcrystalsPelliclelipid/proteinlayers(1-10µm)当前31页，总共103页。

牙菌斑的主体部分，由粘附在获得性膜上的丝状菌彼此平行排列，且与牙面垂直构成，丝状菌之间有大量球菌、杆菌分布或互相粘附。有时平行排列的丝状菌迫使球菌排成链状，好似栅栏，称为栅栏状结构

(palisadestructure)。栅栏状结构是牙菌斑的基本结构，也为牙菌斑深层的细菌获得营养和氧气提供通道。（二）中间层当前32页，总共103页。栅栏状结构（LM）当前33页，总共103页。

菌斑的表层结构比较疏松，细菌组成复杂，变动较大，球菌和丝状菌互相交织，短杆菌穿插其间。“谷穗状”结构(corncob)，以丝状菌为中心，周围有许多革兰氏阳性球菌粘附在其表面。以“谷穗”为中心，周围有长杆菌粘附的“瓶刷样”结构(bristlebrush)。（三）表层当前34页，总共103页。谷穗状结构（SEM）当前35页，总共103页。

四、组成当前36页，总共103页。

1.细菌的种类繁多。

2.不同年龄阶段微生物种类差异较大，

组成呈动态变化。

3.致病性菌斑与非致病性菌斑的细菌

种类差异不大，功能差异较大。

（一）微生物组成的特点当前37页，总共103页。Aspectralfluorescenceimageof15differentspeciesofhumanoralmicrobesgrowninthelaboratoryandlabeledwithtaxonspecificprobesinaCLASI-FISHexperiment.(Credit:AlexValm)当前38页，总共103页。Neighbor-joiningtreeforhumanoraltaxainthephylumTenericutesandtheclassesBacilliandErysipelotrichiaofthephylumFirmicutesTheHumanOralMicrobiome.JOURNALOFBACTERIOLOGY,Oct.2010,p.5002–5017当前39页，总共103页。世界历史分期旧石器时代：通过狩猎和采集维持生活，制造简单石器中石器时代：开始家畜驯养，使用打制石器新石器时代：产生了农业和畜牧业，磨光石器流行青铜时代：制造使用青铜器铁器时代：制造使用铁器中世纪近代现代石器时代古代封建社会碳水化合物大量摄入工业革命/食物更为精细/糖LBK/BellBeakerJewbury/St.Helen-ontheWallis/RaundsFurnells当前40页，总共103页。采集自正常人群相同部位的菌斑微生物组成种类差异较大，但代谢功能相似。Nature.2012Jun13;486(7402):207-14.当前41页，总共103页。牙龈卟啉单胞菌的检出率明显升高开始有变异链球菌检出当前42页，总共103页。古代人口腔微生物的多样性保持相对稳定（p>0.05）当前43页，总共103页。现代人口腔微生物的多样性明显减低当前44页，总共103页。致龋性与非致龋性菌斑的细菌构成致龋性菌斑细菌数量非致龋性菌斑变链球菌多粘性放线血链球菌血链球菌粘性放线变链球菌乳酸杆菌少乳酸杆菌当前45页，总共103页。致牙周病菌斑非致牙周病菌斑球菌少多可动菌多少螺旋体多少致牙周病菌斑与非致牙周病菌斑的细菌构成当前46页，总共103页。（二）化学组成1.水占菌斑体积的30%-50%，重量的80%，其中50%在菌细胞内，30%在菌斑基质中。基质中的水大约25%呈游离状态，剩余部分与蛋白质结合呈结合态。当前47页，总共103页。2.

蛋白质和氨基酸

蛋白质占牙菌斑干重40%-50%，主要来自宿主唾液和龈沟液，少量来自细菌。细菌蛋白则包括细菌本身以及细菌产生的酶，以及免疫球蛋白和少量的氨基酸。当前48页，总共103页。3.糖占牙菌斑千重的13%-18%，来源于食物和细菌，包括低分子可溶性糖，如单糖、双糖、低聚糖和多糖。当前49页，总共103页。

细胞内多糖（IntracellularPolysaccharides,IPS）

存在于细菌体内，作为一种储能形式，当外源性糖提供不足时，为菌斑细菌的新陈代谢提供能源。主要为糖原和支链淀粉。当前50页，总共103页。

细胞外多糖（extracellularpolysaccharides,EPS）

存在于细菌体外，主要有葡聚糖、果聚糖和少量的杂聚糖。细胞外多糖分为水溶性和水不容性两种。当前51页，总共103页。不同底物对生物膜EPS的影响PLoSPathog8(4):e1002623.当前52页，总共103页。生物膜形成过程中细菌细胞与EPS组成的动态变化PLoSPathog8(4):e1002623.当前53页，总共103页。

4.

脂质

占菌斑干重10%-14%，多位于菌斑基质中，主要有磷脂、糖脂和中性脂。菌斑中的脂质对菌斑的矿化和细菌对牙面的粘附有一定影响。当前54页，总共103页。

5.无机物

占菌斑干重的5%-10%，主要有钙、磷、镁、钠、钾及少量的铜、铁等。无机物一部分位于菌细胞内，另一部分分布于菌斑液中。菌斑具有集中钙、磷、氟的能力，菌斑中钙、磷、氟含量明显高于唾液。当前55页，总共103页。

五、形成和发育TheBiofilmLifeCycle当前56页，总共103页。

1、获得性膜的形成2、细菌的黏附和集聚3、生物膜的成熟

4、生物膜的分散当前57页，总共103页。（一）获得性膜的形成唾液糖蛋白选择性吸附在牙齿表面所形成。1.形成机制当前58页，总共103页。

获得性膜的形成机制当前59页，总共103页。EnamelcrystalsPelliclelipid/proteinlayers(1-10µm)当前60页，总共103页。

2.组成糖蛋白、酸性富脯蛋白、富酪蛋白、白蛋白、氨基酸、脂类物质、碳水化合物、一些酶和免疫球蛋白等。

当前61页，总共103页。

3.生物学作用

（1）确定首先定植在牙面的细菌种类（2）细菌代谢的营养来源（3）保护釉质表面（4）牙面上的离子保护库当前62页，总共103页。

1.细菌的黏附：细菌在牙面上的附着

（1）钙桥作用（2）氢键作用（3）疏水作用（4）受体粘结素作用（二）细菌的黏附和集聚当前63页，总共103页。钙桥作用当前64页，总共103页。氢键作用当前65页，总共103页。疏水作用疏水基团疏水蛋白当前66页，总共103页。黏附素与受体

黏附素（Adhesin）：细菌表面的蛋白样成分，以立体化学的特异方式结合到组织表面的受体上

受体（Receptor）：组织表面与黏附素结合的物质当前67页，总共103页。黏附素与受体结合模式当前68页，总共103页。

主要口腔细菌的黏附素和受体细菌名称黏附素受体血链球菌唾液酸蛋白粘蛋白轻型链球菌唾液酸蛋白粘蛋白、淀粉酶变异链球菌几种蛋白粘蛋白、淀粉酶、富脯蛋白远缘链球菌葡聚糖蛋白葡聚糖粘性放线菌I型菌毛富脯蛋白、富酪蛋白II型菌毛半乳糖残基、链球菌内氏放线菌II型菌毛半乳糖残基、链球菌颊纤毛菌半乳糖蛋白半乳糖残基具核梭杆菌半乳糖蛋白半乳糖残基、胶原中间普氏菌半乳糖蛋白半乳糖残基、胶原牙龈卟啉单胞菌菌毛、血细菌凝集素富脯蛋白、精氨酸、多肽胶原当前69页，总共103页。2.集聚（aggregation）一种细菌黏附于另一种细菌的表面称之为集聚当前70页，总共103页。（1）细菌间通过自身合成的细胞外聚合物而相互粘附（2）不同种细菌直接粘附在一起（3）细菌与宿主的聚合物相互作用，使细菌容易聚集在菌斑中当前71页，总共103页。（三）牙菌斑生物膜的成熟牙菌斑的生长周期成熟牙菌斑的形态结构特征当前72页，总共103页。牙菌斑的发育当前73页，总共103页。

牙菌斑（LM）当前74页，总共103页。栅栏状结构（LM）谷穗状结构（SEM）当前75页，总共103页。

谷穗状结构（FISH）组合标签和光谱成像当前76页，总共103页。（四）生物膜的分散当前77页，总共103页。生物膜的分散Biofilmscanpropagatethroughdetachmentofsmallorlargeclumpsofcells,orbyatypeof"seedingdispersal"thatreleasesindividualcells.EithertypeofdetachmentallowsbacteriatoattachtoasurfaceortoabiofilmdownstreamoftheoriginalcommunityNatureReviewsMicrobiology.2012;10(1):39-50当前78页，总共103页。生物膜的分散分散形式：主动分散（activedispersal）：在外来刺激下，如营养变化、代谢产物堆积、温度变化、噬菌体攻击、酰基高丝氨酸内酯(AHL)、右旋氨基酸等作用下进行；主动分散的细菌具有独特的生物学特性，如鞭毛相关编码基因被激活，细菌运动能力显著增强；被动分散（passivedispersal）：如唾液冲刷、食物咀嚼等，菌细胞无生物学特性改变当前79页，总共103页。环二鸟苷酸(c-di-GMP)是生物膜分散的核心分子NatureReviewsMicrobiology.2012;10(1):39-50当前80页，总共103页。EssentialStepsofBiofilmLifeCycle当前81页，总共103页。六、物质代谢当前82页，总共103页。

1.分解代谢

产生多种有机酸，如乳酸、甲酸、乙酸、

丙酸、丁酸和戊酸。（一）糖代谢

当前83页，总共103页。

2.合成代谢（1）细胞内多糖：糖原、支链淀粉（2）细胞外多糖：

SolubleECP:

α-1,6糖苷键葡聚糖(右旋糖苷)

β-2,6糖苷键果聚糖(左旋糖苷)

InsolubleECP:

α-1,3糖苷键葡聚糖(glucan)变聚糖β-2,1糖苷键果聚糖(fructan)

当前84页，总共103页。（二）碱性物质代谢

当牙菌斑处于饥饿状态时，菌斑内尿素酶能够将唾液中尿素分解为氨，二氧化碳，使牙菌斑pH上升。同时，菌斑中细菌可以利用氨基酸，使菌斑pH下降/上升。

目前认为，细菌的产碱代谢是龋病发生的保护因素，口腔主要的产碱细菌包括格式链球菌、唾液链球菌、血链球菌、内氏放线菌等。当前85页，总共103页。尿素酶(urease)及精氨酸脱亚胺酶(argininedeiminase)是口腔细菌最主要的两条产碱代谢通路，对维持口腔微生态平衡具有重要意义当前86页，总共103页。（三）无机物代谢在酸性环境中，磷酸盐会变为易溶解的相，钙释放到基质中。当菌斑pH下降到临界时(低于pH5.5)，羟磷灰石就会转化为钙/磷比值低的盐：Ca10(PO4)3(OH)2+8H+→6CaHPO4+2H2o+4Ca2+

当前87页，总共103页。

在酸性条件下，磷酸氢钙(CaHPO4)进一步分解：CaHPO4+H+→Ca2++H2P4O—当牙菌斑pH上升，这时牙菌斑的钙/磷比值又将增高。10CaHPO4+8OH-→Ca10(PO4)3(OH)2+4HPO42-+6H2O当前88页，总共103页。

七、致病性当前89页，总共103页。

牙菌斑是造成人类两大口腔疾病------龋病、牙周病的始动因子。当前90页，总共103页。

（一）牙菌斑与龋病

1.龋病是发生于牙齿硬组织的慢性细菌性疾病，表现为牙体硬组织色、形、质的改变。2.致病性

（1）产酸性

（2）合成细胞外多糖对牙面的粘附能力

（3）耐酸性当前91页，总共103页。Stephan曲线Stephan曲线：进食后菌斑原位pH变化过程甜食频率vs甜食的量再矿化vs龋病形成所需时间

当前92页，总共103页。细胞内、外多糖的种类和作用1.

种类:葡聚糖、果聚糖和少量的杂聚糖以及糖原和支链淀粉2.

作用:

①作为菌细胞壁成分或位于胞内。

②作为菌斑基质的主要成分，构成菌斑的基本骨架。

③作为细菌代谢所需的能源。

④促进细菌对牙面的粘附和细菌间的聚集。当前93页，总共103页。糖的种类与pH当前94页，总共103页。（二）牙菌斑与牙周病

牙周病是发生在牙的支持组织的疾病，主要临床症状是牙龈出血、溢脓、牙齿松动、牙槽骨吸收以及牙周袋形成，该病是造成成年人失牙的主要原因