乙肝病毒检测

乙肝病毒检测第一页，共四十二页，2022年，8月28日一、几个相关问题简介第二页，共四十二页，2022年，8月28日什么是HBVcccDNA?即共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA)。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。第三页，共四十二页，2022年，8月28日乙型肝炎病毒基因组结构示意图第四页，共四十二页，2022年，8月28日乙型肝炎病毒的复制过程第五页，共四十二页，2022年，8月28日我们为什么要关注HBVcccDNA?cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制“池”目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNA的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治疗后容易复发的原因之一肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏移植术后乙肝复发的来源还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试剂盒问世第六页，共四十二页，2022年，8月28日为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?·研究和开发该检测技术的时间不长·检测技术上的难度较大·前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏模，不能满足临床检验的需求·现有技术灵敏度不高，检测低限104copy/ml左右·分研究机构和学者对检测技术的特异性认识不足，存在缺陷第七页，共四十二页，2022年，8月28日·多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、rcDNA、ssDNA、整合的HBVDNA），必须有效地分离cccDNA和其他类型的病毒DNA·如何进一步解决特异性的问题？·如何解决灵敏度不高的问题（细胞内cccDNA含量的较低），血清中含量？·如何简化检测步骤？建立cccDNA检测技术必须克服的难点第八页，共四十二页，2022年，8月28日cccDNArcDNA核酸一级结构完整的双链两条链均不完整核酸空间结构闭合环状，超螺旋松弛环状，非超螺旋是否与蛋白质结合不结合共价结合对某些核酸酶抗性强，不容易被降解弱，容易被降解分离cccDNA和rcDNA的分子基础分离cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差异第九页，共四十二页，2022年，8月28日二、HBVcccDNA检测技术第十页，共四十二页，2022年，8月28日1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法现有的几种cccDNA检测技术简介第十一页，共四十二页，2022年，8月28日现有的几种cccDNA检测技术简介选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法第十二页，共四十二页，2022年，8月28日设计一对特殊引物：跨双缺口引物

正义引物P1：与负链互补结合，位于正链缺口上游反义引物P2：与正链互补结合，位于负链缺口下游目的：rcDNA不被扩增1.选择性PCR第十三页，共四十二页，2022年，8月28日选择性PCR：rcDNA不被扩增第十四页，共四十二页，2022年，8月28日选择性PCR：cccDNA能被扩增第十五页，共四十二页，2022年，8月28日PCR产物自身退火（selfannealing）“选择性”PCR：并非万无一失第十六页，共四十二页，2022年，8月28日rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠HepatologyResearch2003;15:234-243（PBMC）WorldJGastroenterol2004;10(1):82-85(血清)Kock等：反应管中rcDNA含量不能超过105copyHepatology

1996;23:405-413血清HBVrcDNA超过108copy/ml，进行荧光PCR可能会出现检测结果假阳性“选择性”PCR：并非万无一失第十七页，共四十二页，2022年，8月28日与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA第十八页，共四十二页，2022年，8月28日rcDNA不能被扩增无荧光信号EcoRI5‘+P1P23200(1)5‘3‘15903‘1820P118201590+3200（1）EcoRIP2cccDNA能被扩增检测到荧光信号选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA第十九页，共四十二页，2022年，8月28日实时荧光定量PCR的原理第二十页，共四十二页，2022年，8月28日实时荧光定量PCR的原理第二十一页，共四十二页，2022年，8月28日实时荧光定量PCR的原理第二十二页，共四十二页，2022年，8月28日标准曲线方程YCtcopy

相关指数：R2=0.995

灵敏度至少可以达到103copy/ml结果：选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA第二十三页，共四十二页，2022年，8月28日·同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA非特异性扩增的问题·由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普通PCR更高缺陷：选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA第二十四页，共四十二页，2022年，8月28日质粒标准品107copy/ml3.5×108copy/ml携带者血清质粒标准品105copy/ml105~107copy/ml携带者血清选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA第二十五页，共四十二页，2022年，8月28日解决方案特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法酶切纯化cccDNA采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safeDNA酶选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA第二十六页，共四十二页，2022年，8月28日1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法现有的几种cccDNA检测技术简介第二十七页，共四十二页，2022年，8月28日2.侵入者探针法(Invaderassay)两个体系：两种特殊的探针：invaderprobe和primaryprobe，后者含与待测模板无关的5’侧翼的碱基片段。荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶Ⅰ(cleavase,裂解酶)特异地切割5’侧翼碱基片段作为第二个invader，与荧光共振能量转移盒（FRETC）结合，裂解酶切割FRETC上含有荧光基团的短臂，发出荧光信号。特点：一个模板可以重复使用，每“结合—裂解—结合—裂解”一次为一个循环，每循环一次产生一个荧光信号，呈线性信号放大第二十八页，共四十二页，2022年，8月28日第二十九页，共四十二页，2022年，8月28日第三十页，共四十二页，2022年，8月28日侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点优点：线性信号放大，特异性比荧光PCR法强缺点：灵敏度低：104copy/ml第三十一页，共四十二页，2022年，8月28日1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者分析法（Invaderassaay）嵌合引物荧光PCR法现有的几种cccDNA检测技术简介第三十二页，共四十二页，2022年，8月28日3.嵌合引物荧光PCR法Shao,etal.JVirolMethods2003；112：45-52+PNN：与HBVDNA非同源片段5’N5’3’3’p+rcDNAcccDNA第三十三页，共四十二页，2022年，8月28日PNNP25’3’5’3’3.嵌合引物荧光PCR法第三十四页，共四十二页，2022年，8月28日

嵌合引物荧光PCR的优缺点

优点：克服了荧光PCR法的部分缺陷，灵敏度比侵入法提高

缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的rcDNA被非特异性扩增第三十五页，共四十二页，2022年，8月28日

无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR，本身都不能解决在高rcDNA背景条件下的假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提高特异性。第三十六页，共四十二页，2022年，8月28日三、影响cccDNA池的因素第三十七页，共四十二页，2022年，8月28日1.cccDNA池的自身恒定cccDNA池：感染肝细胞核内HBVcccDNA的含量在无外来干扰的情况下保持恒定(5－50copy/cell)病毒自身调节：关于病毒的进化关于病毒的“思维”病毒自身的调节外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果第三十八页，共四十二页，2022年，8月28日2.抗病毒药物对cccDNA的影响现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物，可以一过性地减少cccDNA，但均不能清除cccDNA细胞核内cccDNA含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性第三十九页，共四十二页，2022年，8月28日3.肝外组织也是cccDNA的储存池？·肝外组织细胞中HBV标志的存在情况：肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺等组织或细胞中均检测到HBV的标志物·HBV吸附？暂居？建立感染状态？依据：从上述组织细胞中检测到cccDNA，但必须解决检测技术问题第四十页，共四十