蛋白质电泳分离课件

醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质

4学时通过实验使学生掌握电泳的基本原理一二三熟悉薄膜电泳的基本操作一、实验目的掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的原理二、实验原理1、电泳法是指带电粒子在外电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。如：不处于等电点的蛋白质分子带电荷。pH=pI

OH-pH>pIH+

OH-H+pH<pI蛋白质的兼性离子阳离子阴离子CHNHCOOHRCHNH2COOHRCHNHCOORCHNH2COO-RCHNHCOORCHNH3COO-R+CHNHCOOHRCHNH3COOHR+2、电泳技术是利用样品中各带电粒子在电场中的迁移速度不同，从而对样品中分子进行分离、鉴定、纯化和制备。3、电泳的分类依据支持物的性质不同：纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳

醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜作支持物的一种区带电泳技术。该膜具有均一细密微孔结构，对分子移动阻力小，作为区带电泳的支持物，它具有操作简便、快速、样品需要量少，应用范围广等优点。不足之处是分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，薄膜厚度小不适于做样品制备用。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白pI4.885.065.065.126.85-7.3泳动度(cm2/s.v)5.9×10-55.14×10-54.1×10-52.8×10-51.0×10-5分子量(kD)6920030090-150156-3004、血清蛋白的种类PH8.6缓冲液中带负电荷电泳后，将薄膜取出，经染色和漂洗，薄膜上显示出五条区带，每条带代表一种蛋白质。结果示意图：γβα2α1清蛋白三、实验器材与试剂1.器材：电泳仪、电泳槽、醋酸纤维素薄膜(2X8cm)、毛细管、培养皿、载玻片、粗滤纸、镊子，烧杯，量筒，铅笔。2.试剂：新鲜人血清（无溶血现象）PH8.6缓冲液：巴比妥1.66g、巴比妥钠12.76g、加水至1000ml，置4℃冰箱保存。染色液：氨基黑10B0.5g、甲醇50ml、冰醋酸10ml、蒸馏水40ml，混匀溶解贮存。漂洗液：95％乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水50ml、混匀。浸泡电泳槽准备点样

电泳脱色染色五、实验过程1.浸泡：在薄膜粗糙面距一端2cm左右处用铅笔轻轻划一条直线，表示点样位置。将薄膜粗糙面向下，浸泡于PH8.6的巴比妥缓冲液中至少十分钟，使之完全浸泡透。2.电泳槽的准备电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。两杆之间的距离调节到略小于醋酸纤维薄膜的长度，点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上。3.点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后铺在干净的平皿盖上(粗糙面点样)，将毛细管在血清中沾一下，封住上端，在载玻片的一端均匀涂过，使样品连续、均匀、适量，把载玻片在薄膜粗糙面上点样位置轻而温和地印一下。2cm4.电泳：将薄膜粗糙面朝下，平行扣于电泳槽支架的滤纸桥上，膜条点样的一端放在负极上，膜条与滤纸必须贴紧，平衡5分钟后通电。调节电压至90-120V左右，电流强度为0.4—0.6mA/cm，电泳时间40min-1h。5.染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡2-5分钟。6.漂洗：将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗3-4次至无蛋白区底色脱净为止，可得到色带清晰的电泳图谱。五、实验结果与分析预期结果一般的染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。

清蛋白

12实际结果失败图谱的分析 拖尾状：点样量过多，被分离的血清蛋白不能分离成5条区带或产生拖尾。 有斑点：点样不均匀，不整齐，导致被分离的区带出现斑点。 边流现象：点样板蘸取血清一边多一边少，导致区带分离不清，出现边流现象。 区带模糊：薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带。

锯齿状：薄膜用滤纸吸水过度（薄膜上出现白斑）或未及时搭桥，导致薄膜过于干燥，使区带成锯齿状。 区带倾斜：薄膜搭载滤纸上的位置歪斜，弯曲，与电流方向不平行，或点样一边多一边少，区带容易泳斜。区带重叠：在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。区带过密：电泳时电压，电流过小或时间不够，造成区带未分离。六、临床意义血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分，含量为60～80g/L,大部分由肝脏合成。正常值：蛋白质血浆中浓度白蛋白40～50g/Lα1-球蛋白2～4g/Lα2-球蛋白4～9g/Lβ-球蛋白6～11g/Lγ-球蛋白13～17g/L肝炎白蛋白、α1、α2和β球蛋白降低，γ球蛋白升高；肝硬化白蛋白、α1、α2和β球蛋白下降明显，γ球蛋白极度升高；肾病综合征白蛋白降低，α2和β球蛋白升高。多发性骨髓瘤：白蛋白降低，γ球蛋白升高，β和γ球蛋白区带之间出现“M”带。急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭：白蛋白降低，α1、α2和β球蛋白升高；慢性活动性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，β、γ球蛋白升高；急性炎症：α1、α2球蛋白升高；慢性炎症：白蛋白降低、α2、γ球蛋白升高；红斑狼疮、类风湿关节炎：白蛋白降低，γ球蛋白显著升高；多发性骨髓瘤：白蛋白降低，γ球蛋白升高，β和γ球蛋白区带之间出现“M”带。七、注意事项1.保持薄膜清洁，勿用手指接触薄膜表面，以免油污或污物沾上，影响电泳结果。2.加样时一定要呈直线、垂直、分布均匀，这样泳动的区带整齐、不歪。4.染色的同时也是蛋白质的固定，所以，不要将很多蛋白条重叠在一起。3.注意薄膜正负极不要搭反，注意簿膜的正反不要放反。放的时候注意血样不要与滤纸接触了。5.通电完毕时，必须切断电源，以防触电事故。注意事项1.保持薄膜清洁，务必戴上塑料手套，勿用手指接触薄膜表面，以免油污或污物沾上，影响电泳结果。2.注意醋酸纤维膜的质量，至少浸泡10分钟，浸泡很久仍有大块白色硬点者须弃之不用。3.加样时一定要呈直线、垂直、分布均匀，这样泳动的区带整齐、不歪。4.电泳槽两边的缓冲液应保持液面在同一水平面上，槽里的缓冲液要保持清洁。5.电泳电压大小，时间长短与缓冲液的离子强度都有一定的关系。一般电流约0.4—0.6mA/cm,电压110—160V，通电时间40—60min。电压高，电流大，电泳速度加快，时间可缩短，但薄膜上蒸发严重，电泳图谱出现条痕，因此不能无限增大电流。6.使用培养皿时要润洗。7.染色的同时也是蛋白质的固定，所以，