基于DNA技术的红细胞血型检测及其应用策略

目前已经命名的所用红细胞血型系统ISBT迄今为止共确定、命名了30个血型系统（001～030），300多个血型抗原，1188个等位基因。其中血型系统抗原262个，集合抗原、低频抗原和高频抗原40个。ISBT系统名称发现系统符号抗原数基因符号等位基因数001002003004005006007008009010011012013014015016017018019020021022023024025026027028029ABOMNSPRhLutheranKellLewisDuffyKiddDiegoYtXgSciannaDombraockColtonLandsteiner-winerChido/RodgersHhKxGerbichCromerKnopsIndianOKRaphJMHIGlobosideGIL19011926192619391945194619461950195119551956196219621965196719401967195219751960196519701974197919871999199319981995ABOMNSP1RHLUKELLEFYJKDIYTXGSCDOCOLWCH/RGHXKGECROMKNINOKRAPHJMHIiGLOBGIL44315320276632122453391171282111111ABOGYPA.GYPB.GYPEP1RHD.RHCE,RHAGLUKELFUT3,FUT6,FUT7FYJKAEIACHEXGSCDOAQPILWC4A.C4BFUTI,FUT2XKGYPCDAFCRICD44OKMER2SEMA7AIGnT,GCNT2B3GALNT1AQP31584333119,42,13173617、2111878491083734、3232913〉302538992（一）血型的基因基本被染色体定位和克隆测序ABO 9q34.2MNS 4q28-31P 22q13.2Rh 1p36.1-34Lutheran 19q12-13Kell 7q33Lewis 19p13.3Duffy 1q22-23Kidd 18q11-12Diego 17q12-21Yt 7q22Xg Xp22.32Scianna 1p36.2-22.1Landsteiner-winerChido/RodgersHhKxGerbichCromerKnopsIndianOKRaphJMHIGlobosideGIL19p13.26p21.319q13.3Xp21.12q14-211q321q3211p1319p13.311p15.515q22.3-236p24.23q26.19p13.3Dombraock 12p13.3-13.2Colton 7p14Rh-associated

glycoprotein6p21-qter二、红细胞血型分子生物学研究进展（二）血型基因的组成已基本被阐明30个血型系统的血型基因已经被认定、克隆、测序。ABO、Lewis、H、I、Globoside和P基因编码糖基转移酶，这些糖基转移酶催化合成糖脂和糖蛋白上的寡多糖。其它28个基因编码表达在红细胞表面的蛋白抗原。（三）血型多态性抗原分子基础基本被阐明单核苷酸取代（单核苷酸多态性SNP）：外显子、内含子、启动子多核苷酸取代外显子取代单核苷酸缺失多核苷酸缺失外显子缺失基因缺失单核苷酸插入多核苷酸插入外显子重复基因转换或基因重组•••••••••••基因突变突变（mutation）：DNA分子中的核苷酸序列的改变。1）点突变（point

mutation）：单碱基置换。• 同义突变（same

sense

mutation）:

氨基酸无改变，无突变效应。• 错义突变(missense

mutation)：新密码子，氨基酸序列变化，产生突变效应。• 无义突变(non-

sense

mutation)：变成终止密码，合成不完整多肽产生突变效应。终止密码突变（terminator

codon

mutation)：合成过长的多肽，产生突变效应。• 移码突变（frame-shift

mutation)：DNA链中插入1个或几个单碱对，使突变处以下部位密码发生变化，使合成的氨基酸种类或序列变化，产生突变效应。2）片段突变：DNA链中小片段单碱序列发生缺失、重复或

重排，产生突变效应。117ABO血型抗原多态的分子基础（多碱基取代、单碱基缺失）ABO261 297G A526 657 703 796 803 930C C G C G G精176甘 亮 甘235 266 268G GGTAACAnt261GdeletionACCGCGG甘丝蛋丙176235266268O1nt261GdeletionACCGCGG117TACCGT

AAG

GGC

GGC

TCA

TTA

CCT

TGT

CGG

GGT

ATA

GCT

AGCTAC

CGT

AAG

GCG

GCT

CAT

TAC

CTT

GTC

GGG

GTA

TTT

TAA

GC移码突变203297350407467564646681703721771829838871965996100910541061备注A101GAGCCCTGACCGCGAGACCA102TA103TTA104GA105G297位内含子6重组，形成B-O1杂合基因A106第7外显子重组，形成B-O2杂合基因A201T缺失A202TTA203TGA204GTAA205TGA206T缺失A301AA302A缺失A303TAx01AAx02GAATAAx03AATA与5,6.8重组位置不同，表型不同Ax04AAAx05AATAAx06AATAAx07AAx08AATAAel01Ael02Aw01TT缺失Aw02CT缺失Aw03CT缺失Aw04T247467502539548556641646669681721771796803829863871873103610551057B101GCCGAATTGGCCCGGTGCAGCB301TB302AB303TBxABel01TBel02GBel03TBel04TAATACABw01GBw02TBw03GBw04ABw05GBw06ABw07GBw08G15920231450810671086Lewis基因ATG----------CTG-----------------TGG-----------ACG-------------------GGC--------------------------------------ATA-----TGA氨基酸MetLeuTrpThrGlyIleStop12068105170356362Le59ATG----------CGG----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TGAArgLe59,508ATG----------CGG-------------------------------------------------------------------------------AGC-----------------------------------------------------------TGAArgSerLe59,1067ATG----------CGG-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AAA-----TGAArgLysLe1067ATG---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AAA-----TGALysLe202,314ATG-------------------------------------------CGG-----------ATG----------------------------------------------------------------------------------------------TGAArgMetLe202ATG-------------------------------------------CGG-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TGAArgLewis基因中五种常见点突变所构成的单倍型RhD（－）的分子基础：基因缺失几乎所有白人的Rh阴性表型的分子基础是RHD缺失。多核苷酸插入CcEe多态性分子基础CeCT A G

GTG半异亮丝丝丙cEGC C A

ACCCECT A G

GTCCysIleSerSerPro48G150C178C201

203A

A307C676Gce色亮天东脯丙166068103226Exon-1Exon-2Exon-5Exon-1Exon-2Exon-5Exon-1Exon-2Exon-5TrpLeuAsnproPro166068103226Exon-1Exon-2Exon-5MN2TTA亮12TCA丝11415GGT甘5谷51415GAGMN血型物质是一种富含唾液酸糖蛋白，被称为唾液酸糖蛋白（sialoglycoprotein）或血型糖蛋白A（glycophorins

A,GPA）。GPA由131个氨基酸残基组成

。M与

N的碱基差异为在第2、14、15发生3个碱基替换，导致第1、5氨基酸M抗原为丝、甘，N抗原为亮、谷。MNSs血型抗原及分子基础

（1）MNSs血型抗原及分子基础

（2）Ss蛋29苏29143TSs血型物质是GPB。GPB是另一个富含唾液酸红细胞膜糖蛋白，在结构上与GPA密切相关。GPB由72个氨基酸残基组成。S/s多态性表现在第29位氨基酸的替换。143C基因杂交GYPA的第3外显子与GYPB的第3外显子（假外显子）部分杂交形成表型Mur。血型抗原不表达的常见机制：1、基因缺失2、移码突变导致提前产生终止信号3、剪切位点核苷酸取代4、启动子核苷酸取代5、基因交换或基因转换6、基因融合7、

假基因GATA

boxTAT

CTA

CC启动子

突变形

成沉默基

因Fy

*A/

Fy

*BFy

丰B辽宁省、血液中心

辛剑平g

>tll'3g

>t毡’

35内含子

剪切点

突变

形

成沉默基

因lNormal GYPB(S+/

s+)Var

iant

(S-s一）GYPB辽宁省‘

血革中心

李剑平三、血型分子生物学研究的意义1、解决了很多悬而未决或有争议的问题2、有助于更好地研究红细胞抗原功能3、有助于人类学、疾病相关性等研究4、为开展血型基因分型（分子检测）奠定基础解决了很多悬而未决或有争议的问题（1）Rh血型的遗传模式Fisher遗传模式Wiener遗传模式（2）类N特异性（3）解决有争议的亲权关系O型父亲和AB型母亲可以生出AB型的孩子吗？O型父亲和O型母亲可以生出A型孩子吗？O型父亲和B型母亲可以生出A型的孩子吗？M型父亲和N型母亲能生出N型孩子吗？OOO

AhOAAOHAOO cisAB/OcisAB/OABOHcisABMMg

NNNMgNM

gN解释OOOBOOAAAv解释四、红细胞血型基因分型方法4、红细胞血型常用基因分型方法PCR-RFLPPCR-SSCPPCR-SSPPCR-SSOPCR-SBT• 基因芯片限制性片段长度多态性分析法restriction

fragment

lengthpolymorphisms,RFLPs因DNA核苷酸序列的变异，使DNA限制性内切酶识别部位产生、消失或移位，致使酶切片段长度和/或数量发生变化而呈现的DNA多态性。•FYA

240bp 213bp 107bp 109bp••••FYB453bpBanI的酶切识别点为

GGPyPuCC。FYB被BanI切成长分别为453bp，107bp和109bp的三条短片断；因为FYA是FYB在第42密码子发生A→G突变进化而来[4]，所以FYA较FYB多一个酶切点，被切成长度分别为240bp，213bp，107bp和109bp的四条短片断（见图1）。PCR-RFLPPCR单链构型多态性PCR-single

strandconformation

polymorphism,

PCR-SSCP基本原理：PCR产物热变性后形成单链DNA，在非变性凝胶中，因DNA片段碱基排列顺序的不同，单链DNA形成不同的（空间构型，导致电泳迁移率的差别而呈现多态性，根据谱带的位置判定型别。PCR-SSCP解链原

理DAN单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移率不仅与链长有关，还与单链

DNA的空间构象有关，因此碱基变异引起的构象变化也可改变单链DNA的电泳迁移率。利用这种原理可将野生型DNA和突变型DNA区分开来。CCGCCGAGTACTGGAACAGCaTACCGTAAGGGCGGCTCATGACCTTGTCGGGGTATACCTAGCCGCCGAGTACTGGAACAGCbTACCGTAAGAGCGGCTCATGACCTTGTCGGGGTATACCTAGSequence-Specific

Primer(

Allele-Specific

Primer)

PCRMNMN Marker序列（等位基因）特异性寡核苷酸探针杂交分析法Sequence(allele)

specificoligonucleotide,S(A)SO根据硷基互补的原则,制备识别特定寡核苷酸序列的单链DNA探针,并标记示踪物,在高强度条件下与变性DNA样品杂交,检测示踪物,阳性者为检出相应的等位基因。相关概念：A：杂交：两条异源寡核苷酸单链按照硷基互补的原则复性为双链的过程。B：探针：标记有示踪物，能够识别靶核苷酸序列并与之退火杂交的具有以知序列的寡核苷酸单链。探针的条件A:长度为20bp左右。B：具备高度特异性。C：容易标记示踪物。D：在杂交过程中本身性质稳定。TGGCATCACGGGCATCASO探针法’E-1曹,E,,’1·11...

·-··1·-·r--··r····-r

四

···1..

一

－－··－”－···-·--

--·-

,’

E生物芯片（biochip

&bioarray)技术：根据生物分子间特异性相互作用，

将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质等各

种生物成分的高通量快速检测分析。将大量靶基因片段有序地、高密度地（点与点间距小于500um）排列在载体上，通过荧光标记的探针杂交，计算机扫描分析获取数据，是一种快速、高效、高通量分析生物信息的工具，特别适用于一次性进行大量靶基因的杂交探测。DNA序列测定DNA

sequencing双脱氧链终止法Dideoxy

chain

terminationHO::HOBaseHHHHOOPOOHOBaseHHHHOOPOOHCGCTTACGCAGGTGTTGCGATGTCCAC五、红细胞基因分型应用策略血清学方法PK基因分型方法中国蜻血靠草

20-07

年2

月第

ZO

;I第

1期1

Chin

I

Bt叩d

T

咄,5fo画i剧，F,ebu盹ry12007

Vo1.

20

,No.

1－E”－BE－E－··E，专家述评

，人类血型分型的新妃元14辆坦JNational

1nsrirute

of

He.alth,Bet

hesda

t

MD

208,92，因A)提篝诵h虹细胞血型

1血晴牵

F

血型

；基因

分J

型；脱筑核精棋

酸中国分提号：R457.

I+

1

Q154

立融标识码

：A虹描胞血型抗原是通过红

细胞和相应

抗体的

提

集

作用而被鉴别画

无论是

简单的红姐胞盐

本是

现握

集试验

，还是抗球蛋由

撰集试验

f或是近年

发展的提

股雄集试馨

，都

是以提集

反应

为基地

英国输血博文章摘号

：I004-549X(

2007

)01·0001·02会

Transf

usion

MedJdne

如志主搞

Ans

1

e;e

时F

前年就撰

文探讨对于具有百年历

史

的提靠试验是

否该说血型基因分型技

录

相握

建立L唱J

F

有

可能对患者

和供

者作全串的血型基

因分型p

并设

想在来最

可以根据

血型基因型

匹配选择供

者

，是

假

于目前的骨髓库选

择

HLA

E

配供点

这对于带有

多种抗钵的

步决精血患＃特鼻j

有意旦

l以不

必墓定

克竟

带有何

种抗体而选择

匹配的血液输盘

F•

338

t中国输血杂志

2007

年

8

月第

20

毒第

4

搁

Chi1t

J

囚

od

Tr.ansfusion

,

August

’

20Q,1,Vol

2•0

,N队

4·学术争鸣

’临床红细胞血型相容性试验中基因和血

清学技术孰重孰轻

？李 勇

（怯春生物制品研究所

，吉林怯春

130062

)美键词

＝主E细胞

血型I，血清丰

t

基因

$桂测

t

输血

安全中圄分鸯号

：R457.

1+

1

立献标识码

：A人类血

型分型

的技术

分为

2

犬

类

桂割

DNA

的基

固定

型和桂

剧

抗原／抗体的血靖宇

定

型⑩

«

中

国输血串串》近

期

刊

友的4

人类

血犁分型的

新纪元

h即认为

z

基

因分型

拉＊＂近年

来

巴

捏成

为

血型血清

非

分型的

一项辅

助

技来”

f

近年

最高

通量血型基因分型拉

来

相继

建

立，有

可

能

患者和

供者作

全窑

的企

型基因

分型，并设

想在

来

章可

以根

据

血型

基

因型匹

配选

择供者，建

但

于目前的

骨

髓

库

选

择

HLA

匹

配

供者”

刊

。对

此笔

者理解为

：l)基

因桂

酒

是

辅

助

技

求

专

并未被

强

调

成

主

导

技;ft.

;2）

是

对未来曲设想

面来

否认现在的

血型血

清

学

技

术

＠

这样疆

解

当

用

不少

专

革的现点

二

军t

UJ，我

们

以为，无

论

怎梓

强调

血清

血

型＃在

医

字

瞌尿

中

的重要

性都

平过

齿，因为

血

型分

型临库

应用的更

重

要意

义是

保障

安全输血及

告睛

、预防ll活

疗胎儿和耕生儿

免

疫

珞

血

性

在

病，人

类

血

型

学

在临革

应

用中，血

型血靖

宇

技

术

是

主

导技

术

，基

因检测

技

术

是

辅

助

技立章捕号

1004-54l9X

(

2007

)0←0338-03理1细胞和血清

中血型抗原抗体

，后者

是栓制

血型抗原

相

应的

遗

传

物质的

多

性

血

清

血型

学水

平

桂

测分为

桂

测

完

全扰

悻和不

完全抗体的实睡技术

［5J

；桂割

不

完全抗体的技＊

又

分为

筛

拉

挂

;f::

(

!icreening

me:t!iorJs）

和鉴

定技

术

（

ident:ifica

tionmethods

）

分析抗体

（意外

和

非

意外以及

规

则和

不

规

划

的抗

体）

是

否有临

床

意义的

实验技术

等

等

也

基

因水平血型

桂

割

是

桂

割草

较普

踵

步

在

性（SPA）

桂

才t

及

平

同的

PCR

技

术

且其

临床应

用

意

义考

虑

＋血型基

因桂剩拉未

可

且

以标本来报成＊i展方主音分

壳

，如封胎

儿和

新

生儿

兔疫培

血性在

痛

的静

断‘

可

以是对胎儿

可

能有损伤的和无损

伤的

采集栋

本

方

法

前者

如子宫

内是

应

脐

带

血

取样

（院时u

taoeou

s

urnbilical

vein

sam.­

pling

,

PU出〉录靠的

胎

儿

血革

标本

·＊集

羊点

4草

草凹，后

者为

王在

集

和栓喇母亲

外周血中胎儿

的

DNA

a.

应该

理渭

桂测中国植血艇在

2£27

年

2

月第

却卷第

1期

Chin

J

Blood

Tun,dusion,Feburuy,

Z佣7,Vol.20,Nι

1·专家述评

，加强血型血清学培训与研

究，提高临床输血水平张印刷l，兰嗣＊－t(1，露圳市血班中心

输血医学研究所

r京探圳

51803.S』

2.

广鼻｜南方医院

输血科）芙擅匍：血请

学

，血型

；血型

鉴定

i基因

检测

；输血

安全申固分冀号：R457..l+

l

R446.61

立献标识商

业

立章组号

：1004-549X(

2007

)O

1’0003-01近年来

，在临

床输血

实践

中普遍存在

种认识

匍向

，认为

血型血清

丰落伍

了

，技

术

落后

了

，不

需要

研究

了

，只有

DNA

检

测才

上“档

次”，才

有

科

技含

量

，时

鼓

忽视血

型血清学基本理论

、实挂

方

法的普及

和提

高

，惠略血

型血

清

学

的研究和临库需

要

，这种

脱离实

际

味求“新飞

在“

深”的顿

向甚

至

有向基层

血站和医院

输血科

夏延之

势，影

响

了输血学

科

的建

设发展和临

＊用

血的安

全由技术取代不

了交叉

配血技

术，也不会普

遍用于常规

工作

？因为

与

血清

学技

术

相比

，基

因挂

测

所

需

时

间

长

、操作复杂

，且缺乏标

准品

，易受

多精因

素干扰

，如

引物设计『合成

等

。忽视血型血清

学研究

，

味追求基

因检测

的现

象影

响输血学

的学科建设，潜在

威

NJ.用血安全曲

例

如，现在刚踏人输血

事

业

的技

术人

员就没有全面系

统学

习血型血清学理论和技

术的机会和条件

，些Where

are

,ve,

and

,vhere

are

we

.going,

with

DNA-

based

approaches

i:n

immunohematolo白带

Is

serology

且nished?George

Garratty口

问temb

2006

I

副tendworkshop

or’ganized

by

the

Food

and

Drug

Administration

(FDA)

I

Cet】ter

for

Biologics

Evaluatim】

and

Resear’ch’

Dep盯ttnent

ofHealth

and

Hun1an

Sendces/0伍ce

of

Pub]ic

Heε11th

andScience,

and

the

National

Institutes

of

Health/

NationalH剧时，Lung

,

and

Blood

Institute.

The

workshop

、ws

on

Mo]ecu]ar

Methods

in

Im1nunohematofogy.

A

ve血a.tiln

report

is

available

on

the

web

(ht甲：Ih.V\/

cberIefoiltninutes.hnn)

.Iam

not

experienced

in

mo]ecu］缸

biology,

but

duringthelast

decade

it

has

become

increasingly

obvious

to

1ne

that

the

application

of

deoxyl'ibonucleic

acid

(DNA)

­

based

techno]ogy

is

going

to

change

allour

Lives.

As

an

Associate

巴ditor

of

τRANSFU

SION,

I

receive

most

of

the

artides

concen1ing

胞d

blood

cell

(RBq

in1munohematol

­

ogy.

Since

the

beginning

of

this

new

centu盯在

the

number

of

atik]es

involving

DNA-based

technology

has

been

inc皿asing

every

ye缸’

（e.g..

in

2006.,

55

per’cent

of

themanaging

the

availability

and

usage

of

components

of

rare

blood

叩pes:genotypi口g

multiply

transfused

recipients

,

p副ients

with

severe

thromboc严openia，四d

those

whose

RBCs

or

p]atelets

are

sensitized

v1,ith

antibodies;resohdng

ABO

and

RhD

discrepandes;identi