蛋白质与酶工程酶学基本理论演示文稿

蛋白质与酶工程酶学基本理论演示文稿当前1页，总共118页。优选蛋白质与酶工程酶学基本理论当前2页，总共118页。酶的概念目前将生物催化剂分为两类酶、核酶（ribozyme）酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物（substrate）具有高效催化作用的生物大分子，包括蛋白质和核酸。当前3页，总共118页。第一节

酶的分类和命名

当前4页，总共118页。酶的分类与命名原则（自学为主）

P酶和R酶数量高达数千种要准确地识别各种酶，避免发生混乱或误解，就必须建立一套酶的

分类(classification)和

命名(nomenclature)

的原则当前5页，总共118页。

国际系统分类命名法原则--（1）根据酶的底物来命名

Ribonuclease核糖核酸酶

Protease蛋白酶（2）根据所催化的反应类型来命名

Dehydrogenase脱氢酶

Phosphotransferase磷酸转移酶

Aminotransferase转氨酶（3）上述两个原则结合-丙酮酸脱氢酶（4）上述原则再加上酶的来源

如：牛胰核糖核酸酶当前6页，总共118页。1、P酶的分类与命名

国际酶学委员会（internationalcommissionofenzyme,ICE)于1961年提出了酶的分类与命名方案，此后不断得到补充和修改

其建议：每一种酶都有其推荐名和系统命名推荐名：由两部分组成--底物名称+催化反应类型+“酶”如：葡萄糖氧化酶

*对于水解酶类，可省去“水解”,

如：淀粉酶，蛋白酶，乙酰胆碱酶等*必要时再加上酶的来源或其它特性，如：菠萝蛋白酶，木瓜蛋白酶，碱性磷酸酶等当前7页，总共118页。P酶的分类原则—1）按照其催化作用的类型，分为6大类

2）每大类中，按底物、化学键或基团的不同，分为若干亚类

3）每一亚类中分为若干小类

4）每一小类包含若干个具体的酶当前8页，总共118页。

国际系统分类法及酶的编号、反应通式1、氧化还原酶（1）AH2＋B＝A＋BH22、转移酶（2）AB＋C＝A＋BC3、水解酶（3）AB＋H2O＝AOH＋BH4、裂合酶（4）AB＝A＋B5、异构酶（5）A＝B6、连接酶或合成酶（6）A＋B＋ATP＝AB＋ADP＋Pi

或A＋B＋ATP＝AB＋AMP＋PPi六大类编号依次为1.2.3.4.5.6亚类编号依次为1.2.3.4.5.6…….亚－亚类编号依次为1.2.3.4.5.6…….当前9页，总共118页。

（1）氧化还原酶类（Oxidoreductases）：包括脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等

其催化的反应通式：AH2+B=A+BH2

被氧化的底物(AH2）为氢或电子供体被还原的底物（B）为氢或电子受体

系统命名：供体在前，受体在后，再加上氧化还原酶字样，即“醇：NAD+氧化还原酶”

其推荐名：某供体脱氢酶（谷氨酸脱氢酶）或某受体还原酶（硝酸还原酶）当前10页，总共118页。（2）转移酶类（Transferases）：包括酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等催化某基团从供体化合物转移到受体化合物上的一类酶。反应通式：AB+C=A+BC

系统命名--供体：受体+某基团转移酶

如：L-天冬氨酸：2-酮戊二酸氨基转移酶推荐名--

受体（或供体）+某基团转移酶上述同一酶为：L-天冬氨酸氨基转移酶当前11页，总共118页。（3）水解酶类（Hydrolases）：包括蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶、肽酶等；一般不需要辅酶，催化各种化合物进行水解反应的一类酶，其反应通式为：AB+H2O=AOH+BH

系统命名：底物+发生水解作用的化学键位置+水解酶如：5’-核苷酸磷酸水解酶，其底物是5’-核苷酸，水解反应发生在磷酸酯键上

推荐名：底物+酶，如5’-核苷酸酶当前12页，总共118页。（4）裂合酶类（Lyases）：催化一个化合物裂解为2个较小的化合物及其逆反应的一类酶，其反应通式：AB=A+B

一般裂合酶在裂解反应方向只有一个底物，而在缩合反应方向却有2个底物系统命名：底物+裂解的基团-裂合酶,如：草酸：羧基-裂合酶，表明其催化草酸在羧基位置发生裂解反应推荐名：底物+脱羧酶或醛缩酶或脱水酶等，而在缩合反应方向则加“合酶”（synthase)

如草酸脱羧酶（草酸=甲酸+CO2)\苏氨酸醛缩酶（L-苏氨酸=甘氨酸+乙醛），乙酰乳酸合酶（2-乙酰乳酸+CO2=2-丙酮酸）等当前13页，总共118页。

（5）异构酶（Isomerase）：催化分子内部基团位置或构象转换的一类酶，其反应通式：A=B，按异构化的类型不同，分为多个亚类：

底物+异构酶

或底物+消旋酶

或底物+变位酶或底物+表异构酶或底物+顺反异构酶等如：葡萄糖异构酶催化“D-葡萄糖=D-果糖”丙氨酸消旋酶催化“L-丙氨酸=D-丙氨酸”当前14页，总共118页。（6）连接酶或合成酶（Ligaseorsynthetase):

其关系到很多生命物质的合成，其特点是需要ATP等作为能源，有的还需要金属离子作辅助因子，分别形成C-O键（与蛋白质合成有关）、C-S键(与脂肪酸合成有关）、C-C键和磷酸酯键，是伴随着ATP等核苷三磷酸的水解，催化2个分子进行连接反应的酶，其反应通式：

A+B+ATP=AB+ADP+Pi或AB+AMP+PPi系统名：2个底物的名称+连接酶，推荐名：合成产物+合成酶。如：天冬氨酸：氨连接酶，其推荐名是天冬氨酰合成酶（L-天冬氨酸+氨+ATP=L-天冬酰胺+ADP+Pi）当前15页，总共118页。2）R酶的分类和命名

通常按照其催化的作用底物、反应类型和酶本身的机构特点进行分类（1）根据其底物是本身RNA还是其它分子，分为

分子内催化（自我催化）或分子间催化

(2）根据其催化反应的类型分为：剪切酶（只剪）、剪接酶（剪+连接）和多功能酶（3）根据其结构特点，分为：锤头型、发夹型、含I型间插序列（IVS）和含II型IVS的R酶当前16页，总共118页。分子内催化的R酶（1）自我剪切酶：即在一定条件下催化自身RNA分子进行剪切反应；都是RNA的前体，自我催化后，将前体剪切为成熟的RNA分子和另外一个RNA片段如：T4噬菌体RNA前体（215nt）催化自身成为成熟RNA(139nt）和一个76nt的片段（2）自我剪接酶：在一定条件下催化自身RNA分子同时进行剪切和连接反应；都是RNA前体当前17页，总共118页。分子间催化的R酶据其所作用的底物分子不同，分为若干亚类--（1）RNA剪切酶（2）DNA剪切酶（3）多肽剪切酶（4）多糖剪切酶（5）多功能R酶：催化其它分子进行多种反应的R酶，例如L-19IVS能够催化RNA剪接、限制性内切、去磷酸等作用当前18页，总共118页。氧化还原酶类Oxidoreductases转移酶类Transferases水解酶类 Hydrolases裂合酶类 Lyases异构酶类 Isomerases合成酶类 SynthetasesSynthases分子内催化R酶(incisribozyme)

自我剪切酶(self-cleavagerebozyme)

自我剪接酶(self-splicingrebozyme)

分子间催化R酶(intransribozyme)RNA剪切酶DNA剪切酶多肽剪切酶多糖剪接酶多功能R酶其它R酶蛋白类酶proteozyme核酸类酶ribozyme酶enzyme酶的分类总结当前19页，总共118页。第二节

酶的分子结构与功能

TheMolecularStructureandFunctionofEnzyme

当前20页，总共118页。酶的不同形式单体酶(monomericenzyme)：仅具有三级结构的酶。寡聚酶(oligomericenzyme)：由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。多酶体系(multienzymesystem)：由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。多功能酶(multifunctionalenzyme)或串联酶(tandemenzyme)：一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。当前21页，总共118页。一、酶的分子组成蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)(决定反应的特异性)

辅助因子(cofactor)(决定反应的种类与性质)金属离子小分子有机化合物全酶(holoenzyme)

单纯酶(simpleenzyme)

结合酶(conjugatedenzyme)当前22页，总共118页。金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失（如羧基肽酶Zn、黄嘌呤氧化酶Mo等）。

金属激活酶(metal-activatedenzyme)

金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密（如己糖激酶Mg）。金属离子当前23页，总共118页。小分子有机化合物在催化中的作用

当前24页，总共118页。辅助因子分类（按其与酶蛋白结合的紧密程度）

辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去(NAD+)。

辅基(prostheticgroup):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去(FAD、FMN)。当前25页，总共118页。二、酶的活性中心必需基团(essentialgroup)酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。目录当前26页，总共118页。或称活性部位(activesite)，指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。酶的活性中心(activecenter)当前27页，总共118页。活性中心内的必需基团结合基团(bindinggroup)与底物相结合催化基团(catalyticgroup)催化底物转变成产物位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。活性中心外的必需基团当前28页，总共118页。底物

活性中心以外的必需基团结合基团催化基团

活性中心目录当前29页，总共118页。溶菌酶的活性中心*谷氨酸35和天冬氨酸52是催化基团；*色氨酸62和63、天冬氨酸101和色氨酸108是结合基团；*A~F为底物多糖链的糖基，位于酶的活性中心形成的裂隙中。63当前30页，总共118页。

活性中心结合部位必需基团催化部位酶的结构活性中心以外的必需基团

其它部分当前31页，总共118页。三、同工酶和抗体酶1、同工酶(isoenzyme)

是指催化相同的化学反应但一级结构不同的一组酶，其理化性质、免疫学性质等也不相同。当前32页，总共118页。举例：乳酸脱氢酶

(LDH1～

LDH5)电泳速度，Km值不同1~5速率逐渐变快当前33页，总共118页。*生理及临床意义

用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征；

同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断；同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化1酶活性心肌梗死酶谱正常酶谱肝病酶谱2345近期发现，雄性动物精子中还有另一种同工酶LDH-X，反应精子活力当前34页，总共118页。2、抗体酶（abzyme）或催化抗体（catalyticantibody)

定义：是具有催化功能的抗体本质：免疫球蛋白，其易变区被赋予了酶的属性，即具有催化作用的免疫球蛋白优势：为人们提供了一条合理途径去设计需要的酶，尤其是目前难以获得的甚至是还没有的酶。当前35页，总共118页。将抗体转变为酶主要方法：诱导法：利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗

Pollack等以硝基苯酚磷酸胆碱酯作为半抗原诱导产生单抗，经筛选找到加快其水解反应1.2万倍的抗体酶引入法：借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能拷贝法：主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计

当前36页，总共118页。抗体酶的应用一种抗体酶可切开血纤维蛋白（血凝块的主要成分），可以用于溶栓治疗一些抗体酶可固定在癌细胞突出的蛋白质上，破坏癌细胞膜，将用于癌症治疗一些抗体酶可有选择地使病毒外壳蛋白的肽键裂解，从而防止病毒与靶细胞结合立体专一性抗体酶的研究，使生产高纯度立体专一性的药物成为现实，因此随之出现大量针对性强、药效高的药物抗体酶的固定化已获得成功，将大大地推进工业化进程当前37页，总共118页。第三节

酶的工作原理

TheMechanismofEnzyme-CatalyzedReaction

当前38页，总共118页。酶与一般催化剂的共同点在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。当前39页，总共118页。（一）酶促反应具有极高的效率一、酶促反应的特点酶的催化效率通常比非催化反应高108～1020倍，比一般催化剂高107～1013倍。反应温度一般比较温和。酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的活化能(activationenergy)。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。当前40页，总共118页。反应总能量改变

非催化反应活化能

酶促反应活化能

一般催化剂催化反应的活化能

能量反应过程底物

产物酶促反应活化能的改变活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。当前41页，总共118页。H2O22H2O+O2

无催化化剂时需要的活化能：18kcal/mol

胶体钯催化时需要的活化能：11.7kcal/mol

过氧化氢酶催化需要的活化能：2kcal/mol当前42页，总共118页。根据酶对其底物结构选择的严格程度不同，酶的特异性可大致分为以下3种类型：绝对特异性(absolutespecificity)：只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物

。相对特异性(relativespecificity)：作用于一类化合物或一种化学键。立体结构特异性(stereo

specificity)：作用于立体异构体中的一种。（二）酶促反应具有高度的特异性当前43页，总共118页。（三）酶促反应的可调节性对酶量的调节生成量的调节降解量的调节酶活性的调节別构调节共价修饰调节酶原的激活酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包括两方面的调节：当前44页，总共118页。二、酶促反应的机理（一）酶-底物复合物的形成与诱导契合假说*诱导契合假说(induced-fithypothesis)酶底物复合物E+SE+PES酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶-底物结合的诱导契合假说。当前45页，总共118页。目录当前46页，总共118页。羧肽酶的诱导契合模式底物目录当前47页，总共118页。（二）酶促反应的作用效应1.邻近效应(proximityeffect)与定向排列(orientationarrange)2.多元催化(multielementcatalysis)3.表面效应(surfaceeffect)4.张力作用(distortionorstrain)当前48页，总共118页。第四节酶促反应动力学KineticsofEnzyme-CatalyzedReaction

当前49页，总共118页。概念研究各种因素对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述。影响因素包括有底物浓度、酶浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。※研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。当前50页，总共118页。一、底物浓度对反应速度的影响单底物、单产物反应酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量或产物的生成量来表示研究前提

在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。当前51页，总共118页。当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax目录当前52页，总共118页。随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。[S]VVmax目录当前53页，总共118页。当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应[S]VVmax目录当前54页，总共118页。（一）米－曼氏方程式中间产物

酶促反应模式——中间产物学说E+Sk1k2k3ESE+P当前55页，总共118页。中间产物存在的证明：

H2O2+过氧化物酶（H2O2—过氧化物酶）（褐色）（红色）（H2O2—过氧化物酶）+AH2过氧化物酶+A+2H2O

（红色）

(褐色）当前56页，总共118页。※1913年Michaelis和Menten根据快速平衡学说提出V与[S]关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelisequation)。[S]：底物浓度

V：不同[S]时的反应速度

Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]

Km+[S]

＝──当前57页，总共118页。当反应速度为最大反应速度一半时Km值的推导Km＝[S]∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2当前58页，总共118页。（二）Km与Vmax的意义当前59页，总共118页。当前60页，总共118页。当前61页，总共118页。④指导代谢方向：限速步骤：Km最大的反应可逆反应方向、多条反应途径：Km小的反应趋势强。⑤了解酶底物在体内的浓度水平：

一般与Km值相当。VmaxV[S]KmVmax/2当前62页，总共118页。

Vmax

定义：Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。Vmax=K3[E]意义：K3=Vmax/[E]

如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶的转换数(turnovernumber)，即动力学常数K3。米－曼氏方程式推导的假设之一：E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即V＝k3[ES]。当前63页，总共118页。定义—

当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。意义—

可用来比较每单位酶的催化能力,反映酶的工作效率。

酶的转换数---K3

当前64页，总共118页。（三）Ｋm值与Ｖmax值的测定1.双倒数作图法(doublereciprocalplot)，又称为林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法Vmax[S]Km+[S]V=（林－贝氏方程）+1/V=KmVmax1/Vmax1/[S]两边同取倒数1/[S]斜率＝Km/Vmax1/V-1/Km1/Vmax

0当前65页，总共118页。当前66页，总共118页。当前67页，总共118页。当前68页，总共118页。2.Hanes作图法[S][S]/V-KmKm/Vm在林－贝氏方程基础上，两边同乘[S][S]/V=Km/Vmax+[S]/Vmax

斜率＝1/Vmax3.Eadie-Hofstee作图法纵轴截距为Vmax，斜率为-Km当前69页，总共118页。

4.当前70页，总共118页。四种作图法的区别当前71页，总共118页。二、酶浓度对反应速度的影响当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V=K3[E]0

V

[E]

当[S]>>[E]时，Vmax=k3[E]

酶浓度对反应速度的影响

当前72页，总共118页。双重影响温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，使反应速度降低。三、温度对反应速度的影响最适温度(optimumtemperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。*低温的应用酶活性0.51.02.01.50102030405060温度ºC

温度对淀粉酶活性的影响

当前73页，总共118页。当前74页，总共118页。四、pH对反应速度的影响最适pH(optimumpH)

酶催化活性最大时的环境pH。0酶活性pH

pH对某些酶活性的影响

胃蛋白酶

淀粉酶

胆碱酯酶

246810当前75页，总共118页。五、抑制剂对反应速度的影响酶的抑制剂(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。

区别于酶的变性

抑制剂对酶有一定选择性引起变性的因素对酶没有选择性当前76页，总共118页。

抑制作用的类型不可逆性抑制(irreversibleinhibition)可逆性抑制(reversibleinhibition)：竞争性抑制(competitiveinhibition)非竞争性抑制(non-competitiveinhibition)反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)当前77页，总共118页。(一)不可逆性抑制作用*概念抑制剂通常以共价键与酶活性中心或活性中心以外的必需基团相结合，使酶失活。①有机磷中毒当前78页，总共118页。

②巯基酶抑制剂？当前79页，总共118页。（二）可逆性抑制作用*概念抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制

*类型当前80页，总共118页。１.竞争性抑制作用反应模式定义抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。当前81页，总共118页。*特点抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及底物浓度；I与S结构类似，竞争酶的活性中心；动力学特点：Vmax不变，表观Km增大。抑制剂↑

无抑制剂1/V1/[S]当前82页，总共118页。*举例

丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶琥珀酸琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸当前83页，总共118页。

磺胺类药物的抑菌机制与对氨基苯甲酸竞争二氢蝶酸合成酶二氢蝶呤啶＋对氨基苯甲酸＋谷氨酸二氢蝶酸合成酶二氢叶酸当前84页，总共118页。2.非竞争性抑制当前85页，总共118页。*特点抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系；抑制程度取决于抑制剂的浓度；动力学特点：Vmax降低，表观Km不变。抑制剂↑1/V1/[S]无抑制剂当前86页，总共118页。当前87页，总共118页。３.反竞争性抑制当前88页，总共118页。*特点：抑制剂只与酶－底物复合物结合；抑制程度取决与抑制剂的浓度及底物的浓度；动力学特点：Vmax降低，表观Km降低。抑制剂↑1/V1/[S]无抑制剂例如氰化物对芳香硫酸酯酶的抑制作用当前89页，总共118页。各种可逆性抑制作用的比较当前90页，总共118页。六、激活剂对反应速度的影响激活剂(activator)使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。•

必需激活剂(essentialactivator)•

非必需激活剂(non-essentialactivator)当前91页，总共118页。当前92页，总共118页。当前93页，总共118页。第五节

酶的调节

TheRegulationofEnzyme

当前94页，总共118页。酶活性的调节（快速调节）酶含量的调节（缓慢调节）

调节方式

调节对象关键酶当前95页，总共118页。一、酶活性的调节（一）酶原与酶原的激活酶原(zymogen)有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。酶原的激活在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。当前96页，总共118页。赖缬天天天天甘异赖缬天天天天缬组丝SSSS46183甘异缬组丝SS