重要分离方法

重要分离方法第一页，共六十九页，2022年，8月28日一、两相溶剂萃取法

两相溶剂萃取法简称萃取法，是利用混合物中各成分在两种不相混溶的溶剂中分配系数的不同达到分离的方法。分配系数是指在一定温度时，一种物质溶解在相互接触但不混溶的两相溶剂中，溶解平衡后，两溶剂中溶质浓度的比值。此比值在一定的温度及压力下为一常数，可以用下式表示：Ｋ－分配系数

CH－物质在上层溶剂中的浓度

CL－物质在下层溶剂中的浓度

混合物中各成分在两相溶剂中，分配系数相差越大，分离效果越好。第二页，共六十九页，2022年，8月28日``````````````````````````````````````（一）简单萃取法是分离物质最简单最基础的手段，常用于初步分离。（二）逆流连续萃取法是一种两相溶剂逆行的连续萃取方法。其装置如图2-5第三页，共六十九页，2022年，8月28日（三）逆流分溶法（CounterCurrentDistribution，CCD）对性质相似的异构体或同系物，因在两相溶剂系统中的分配系数接近，用一般的萃取及转移操作常须进行几十次乃至几百次，简单的分次萃取已不能满足需要，用逆流分溶法可得到理想的分离效果。逆流分溶法又称逆流分配法、逆流分布法或反流分布法。是一种将液-液萃取反复进行数十次以上的分离方法。如图2-6所示第四页，共六十九页，2022年，8月28日逆流分溶法因操作条件温和、试样易回收，故特别适合于中等极性、不稳定、性质相似成分的分离。另外，溶质浓度越低，分离效果越好。但试样极性过大或过小，或分配系数受浓度或温度影响过大时，则不易采用此法分离。易于乳化的萃取溶剂系统也不易采用此法。第五页，共六十九页，2022年，8月28日（四）液滴逆流分配法（DropletCounterCurrentChromatography，DCCC）

这是在逆流分溶法基础上改进发展起来的一种高分离效能的两相溶剂萃取法。利用混合物中各成分在两液相间分配系数的差别，由流动相形成液滴，通过作为固定相的液体柱而达到分离纯化的目的。其装置示意图见2-7第六页，共六十九页，2022年，8月28日影响液滴逆流分配的主要因素有：①被分离成分在两相溶剂间的分配系数要大；②形成大小合适的移动相液滴，这与两相间的界面张力、密度差、输液管口径和萃取管材料等有关，可以采用数根萃取管预试液滴的形成情况而确定；③液滴间的间隔，与泵的送液速度有关，送液速度过快，液滴间几无间隔变成线流通过固定相，通常也可经过小样探索而定。液滴逆流分配法的分离效果往往比逆流分溶法好，且不会产生乳化现象。移动相用氮气驱动，被分离物质不会因遇空气中氧而氧化。应用该法曾满意地分离纯化多种成分，如皂苷、生物碱、蛋白质、多肽、氨基酸及糖类等。第七页，共六十九页，2022年，8月28日二、超临界流体萃取法超临界流体萃取法（SupercriticalFluidExtraction，SFE）是以超临界流体（简称SF）代替常规有机溶剂进行提取、分离的一种新型方法。第八页，共六十九页，2022年，8月28日1．超临界流体的特性与种类

超临界流体是指物质在高于其临界温度（TC）和临界压力（PC）时所形成的单一相态。处于超临界状态的物质既不是液体，也不是气体，理化性质介于液体和气体之间，其特性表现为：①超临界流体的密度比气体大，而与液体密度相近，因此分子间距离缩短，分子间相互作用大大增强，溶解作用近似于液体；②粘度低于液体而与气体的粘度相近，扩散系数却比液体大10～100倍，有利于成分的扩散溶解；③超临界流体的密度、粘度和扩散系数等，都与温度、压力和流体组成有关。第九页，共六十九页，2022年，8月28日可用作超临界流体的物质很多，如二氧化碳、一氧化氮、甲烷、乙烷、六氟化硫、氨等。目前使用最为广泛的是二氧化碳，其临界温度（31.3℃）低，可在常温下操作，并对大部分物质呈化学惰性。这样，使中药中的化学成分能在低温条件下安全地被萃取出来，有效地防止了“热敏性”或化学不稳定性成分的氧化和逸散，使萃取物保持中药的全部成分。第十页，共六十九页，2022年，8月28日2．基本原理超临界流体萃取的原理主要是根据超临界流体对物质有很强的溶解能力，且改变温度或压力即可改变流体的密度、粘度和扩散系数，流体对物质的溶解特性也随之改变，因此，可将不同性质的成分分段萃取或分步析出，达到萃取分离的目的。第十一页，共六十九页，2022年，8月28日实际应用中，一般采用程序升压法分步萃取不同极性的成分。超临界流体萃取成分之后，可利用减压法，使流体膨胀，密度降低，变为气体，与成分成为两相而分离。所以此法的优点是萃取物无残留有机溶剂，分离后的气体可循环使用，而且避免了溶剂对环境的污染。工艺流程简图见图2-8。第十二页，共六十九页，2022年，8月28日3．超临界流体萃取法的应用超临界流体萃取法始于20世纪50年代，到70年代末，该法广泛应用于烟草和食品工业，80年代以来，超临界流体萃取技术在医药、化工、食品及环保等领域取得了迅速发展，特别是在中药有效成分提取分离方面日益受到重视。目前主要用于萜类、挥发油、生物碱、黄酮、苯丙素、皂苷和芳香有机酸等成分的提取分离。在青蒿素浸膏、蛇床子浸膏、胡椒精油、肉豆蔻精油等的制备分离方面已达到产业化规模。第十三页，共六十九页，2022年，8月28日三、沉淀法沉淀法是在中药提取液中加入某些试剂，与其中一些成分生成沉淀，或加入某些试剂后可降低一些成分在溶液中的溶解度而自溶液中析出的一种方法如果所需要分离获得的成分生成沉淀，则沉淀反应必须是可逆的；如果是不需要的成分，则将生成的沉淀除去，可以是不可逆的沉淀反应。第十四页，共六十九页，2022年，8月28日（一）乙醇沉淀法此法是在浓缩后的水提取液中，加入一定量的乙醇，使某些难溶于乙醇的成分从溶液中沉淀析出的方法（二）酸碱沉淀法本法是利用某些成分在酸（或碱）中溶解，而在碱（或酸）中沉淀的性质达到分离的方法。第十五页，共六十九页，2022年，8月28日（三）铅盐沉淀法是利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶性的铅盐或铅络合物沉淀，而使各成分得以分离的方法。铅盐沉淀法既可用来除去杂质，也可用来沉淀有效成分。第十六页，共六十九页，2022年，8月28日脱铅方法1．通入硫化氢气体法2．硫酸盐或磷酸盐3．阳离子交换树脂法第十七页，共六十九页，2022年，8月28日（四）盐析法此法是向混合物水溶液中加入易溶于水的无机盐至一定浓度或成饱和状态，使某些中药成分在水中溶解度降低而析出，达到与其他杂质分离的目的。常用于盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。第十八页，共六十九页，2022年，8月28日四、结晶法从非结晶状物质通过处理得到结晶状物质的过程称为结晶。用反复结晶的方法，从不纯的结晶制得较纯结晶的过程称为重结晶。结晶法往往用于固体物质的精制纯化，是利用混合物中各成分对某种溶剂溶解度的差别，使单一成分以结晶状态析出，从而达到分离目的。第十九页，共六十九页，2022年，8月28日（一）结晶的具体操作选用合适的溶剂，将已初步提纯的混合物加热溶解，形成有效成分的饱和溶液（如需要脱色时，可加适量活性炭），趁热滤去不溶杂质，滤液低温放置或蒸去部分溶剂后再低温放置，使有效成分大部分析出结晶，滤过，与溶液中的杂质相分离。第二十页，共六十九页，2022年，8月28日（二）结晶溶剂的选择结晶法的关键是选择适宜的溶剂。恰当的溶剂一般应符合下列条件：

1．溶解度对欲结晶成分热时溶解度大，冷时溶解度小；而对杂质则冷、热均溶或均不溶。

2．与被结晶的成分不发生化学反应。

3．沸点溶剂的沸点适中，若沸点过高，则附着于晶体表面不易除去，过低又不利于晶体析出。第二十一页，共六十九页，2022年，8月28日常用于结晶的溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、醋酸、吡啶等。当用单一溶剂不能达到结晶时，可用两种或两种以上溶剂组成的混合溶剂进行结晶操作。常用的混合溶剂有：水-乙醇、水-丙酮、乙醇-乙醚、乙醇-氯仿、乙醇-醋酸乙酯-乙醚等。第二十二页，共六十九页，2022年，8月28日（三）结晶纯度的判断1．晶形和色泽结晶性纯净物质，一般具有一定的晶形和均匀的色泽。化合物结晶的形状往往因所用溶剂不同而有差异。2．熔点和熔距单体化合物还应有一定的熔点和较小的熔距。如为纯净的化合物，重结晶前后的熔点应该一致。第二十三页，共六十九页，2022年，8月28日

3．色谱分析法晶体纯度的进一步确认，须采用色谱法，常用的有薄层色谱和纸色谱等。若某成分经同一溶剂数次结晶，其晶形一致，色泽均匀，熔点一定且熔距较小，同时在薄层色谱或纸色谱上，经数种不同展开剂系统鉴定，均得到一个斑点，一般可认为是一个单体化合物。

第二十四页，共六十九页，2022年，8月28日五、透析法透析法是利用小分子物质在溶液中可通过透析膜，而大分子物质不能通过透析膜的性质达到分离的方法（图2-9）。第二十五页，共六十九页，2022年，8月28日透析法分离效果的关键是根据欲分离成分的具体情况选用规格适宜的透析膜。透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸膜）、蛋白胶膜、玻璃纸膜等。透析法分离量较小，时间长，一般在实验室中应用较多。第二十六页，共六十九页，2022年，8月28日六、分馏法此法是利用混合物中各成分沸点的不同进行分离的方法。适用于能够完全互溶的液体混合物的分离。在中药化学成分的研究工作中，常用分馏法分离挥发油及一些液体生物碱。第二十七页，共六十九页，2022年，8月28日一般液体混合物沸点相差在100℃以上，可将溶液重复蒸馏多次，即可达到分离的目的，如沸点相差在25℃以下，则需采用分馏法（图2-10）。沸点相差越小，需要的分馏装置越精细。第二十八页，共六十九页，2022年，8月28日七、色谱法色谱法（chromatography）又称层析法，是一种分离和鉴定化合物的有效方法，其最大的优点在于分离效能高、快速简便。对一些结构性质相似化合物的分离，用经典的萃取法、沉淀法和结晶法等难以达到分离目的时，用色谱法往往可以收到很好的分离效果。第二十九页，共六十九页，2022年，8月28日

色谱法根据分离原理可分为：吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱与离子交换色谱等；根据分离方法又可分为：

薄层色谱法（thinlayerchromatography，TLC）柱色谱法（columnchromatography）纸色谱法（paperchromatography，PC）高效液相色谱法和气相色谱法等

第三十页，共六十九页，2022年，8月28日（一）吸附色谱法1．基本原理2．常用吸附剂（1）硅胶（2）氧化铝第三十一页，共六十九页，2022年，8月28日

硅胶和氧化铝含水量越高、活性级别越大，吸附活性越弱。

只要在110℃左右加热，这些“自由水”就能被可逆性地除去。利用这一原理可以对吸附剂进行活化（去水）和脱活化（加水）处理，以控制吸附剂的活性。

硅胶、氧化铝的含水量与活性级别活性级别硅胶含水量%氧化铝含水量%Ⅰ00Ⅱ53Ⅲ156Ⅳ2510Ⅴ3815第三十二页，共六十九页，2022年，8月28日（3）聚酰胺（4）活性炭

1）粉末状活性炭

2）颗粒状活性炭

3）锦纶活性炭第三十三页，共六十九页，2022年，8月28日3．展开剂化合物被吸附剂吸附后，需用合适的溶剂进行展开，这种溶剂称为展开剂，在柱色谱中习惯称为洗脱剂。展开剂在吸附色谱中主要作用是解吸附。在吸附色谱中，展开剂的展开能力与其极性有关。对于极性吸附剂，展开剂的极性越大，其展开能力越强，化合物在色谱中移动的速度就越快，而对非极性吸附剂则相反，展开剂的极性越小，其展开能力越强。第三十四页，共六十九页，2022年，8月28日4．被分离成分被分离成分与吸附剂、展开剂共同构成了吸附色谱中的三要素。对硅胶、氧化铝等极性吸附剂来说，对极性大的化合物吸附强，移动慢，Rf值小；而对极性小的化合物吸附弱，Rf值大，从而将各成分分离开。全面考虑吸附剂、展开剂和被分离成分三者的相互关系，是分离成败的关键。第三十五页，共六十九页，2022年，8月28日5．操作方式吸附色谱常见的操作方式是薄层色谱和柱色谱。薄层色谱主要用于化学成分的预试、鉴定及探索柱色谱分离的条件，柱色谱主要用于化学成分的分离制备及含量测定。第三十六页，共六十九页，2022年，8月28日（1）吸附薄层色谱法此法是将吸附剂均匀地铺在玻璃板上形成薄层，把欲分离的试样溶液点加到薄层板的一端，然后用合适的展开剂展开，使混合物中各成分得以分离的方法。吸附薄层色谱的操作主要包括铺板（制板）、点样、展开和显色四个方面。实际工作中常用硅胶-羧甲基纤维素钠（硅胶CMC-Na）薄层板，展开方式有上行法、下行法、单向展开、双向展开等多种。第三十七页，共六十九页，2022年，8月28日将计算出的Rf值与已知化合物的Rf值对照，也可与文献上记载的Rf值比较，进行定性鉴别。第三十八页，共六十九页，2022年，8月28日薄层色谱广泛应用于植物各类化学成分的分离鉴定，也可应用于中草药品种、药材及其制剂真伪的检查、质量控制和资源调查。《药典》一部采用薄层色谱法作鉴别的中药材和中药成方制剂品种已达1523种第三十九页，共六十九页，2022年，8月28日（2）吸附柱色谱法吸附柱色谱法是将试样加入到一定规格装有吸附剂的玻璃柱里，再用适当的溶剂洗脱，使结构性质不同的成分达到分离的方法。其分离原理、吸附剂和洗脱剂的选择均与吸附薄层色谱法基本相同。柱色谱的具体操作可分为装柱、加样和洗脱三步。第四十页，共六十九页，2022年，8月28日（二）分配色谱法分配色谱法是一种利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数的不同，进行分离的色谱方法。第四十一页，共六十九页，2022年，8月28日1．基本原理1．基本原理分配色谱的原理来自于两相溶剂萃取法。2．载体载体又称支持剂、担体，在分配色谱中只起支持固定相的作用，对被分离成分无吸附作用，而且作为分配色谱的载体均为中性多孔粉末，不溶于两相溶剂中，也不与被分离成分发生化学反应。第四十二页，共六十九页，2022年，8月28日3．固定相、流动相与被分离成分据固定相与流动相的极性差别，分配色谱有正相与反相色谱法之分。在正相分配色谱法中，流动相的极性小于固定相极性，而在反相分配色谱法中，流动相的极性则大于固定相的极性。第四十三页，共六十九页，2022年，8月28日

反相分配色谱法应用广泛，其常用的固定相是在普通硅胶表面进行化学修饰，键合上长度不同的烃基（R）形成亲脂性表面，习称键合相，如十八烷基或辛基硅烷键合相。第四十四页，共六十九页，2022年，8月28日4．操作方式（1）纸色谱法（2）分配薄层色谱法（3）分配柱色谱法第四十五页，共六十九页，2022年，8月28日（三）高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）

此法是在经典的液相色谱基础上发展起来的一种快速分离分析新技术。是采用了高效填充剂，利用加压手段加快流动相流速的一种高效能液相色谱法。按分离原理可分为：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱及凝胶色谱等，其中液－液分配色谱应用最广泛，根据其固定相与流动相极性的差别，亦分为正相分配色谱和反相分配色谱两类。正相色谱主要用于极性物质的分离测定；反相色谱主要用于非极性、中等极性物质的分离测定。第四十六页，共六十九页，2022年，8月28日高效液相色谱仪由输液泵、进样系统、色谱柱、检测器和数据处理器等组成（图2-11）。

第四十七页，共六十九页，2022年，8月28日羟基喜树碱（Ⅰ）R1=R2=OH喜树碱（Ⅱ）R1=OH，R2=H10-甲氧基喜树碱（Ⅲ）R1=OH，R2=OCH3脱氧喜树碱（Ⅳ）R1=R2=H第四十八页，共六十九页，2022年，8月28日高效液相色谱法分离速度快、效率高、试样分析重现性好，而且试样不需气化，只需制成溶液，即可在室温下进样分析，所以此法应用范围极广，对挥发性差或遇热不稳定的成分及某些高分子化合物的分离极为有利。近年来，高效液相色谱除了在中药化学领域应用外，在有机化工、环境化学及高分子工业等方面也得到了广泛应用。第四十九页，共六十九页，2022年，8月28日（四）气相色谱法（gaschromatography，GC）此法是以气体作为流动相的一种色谱方法。流动相的气体又叫载气，常用的是氮气。气相色谱法就其操作形式而言属于柱色谱法。根据流动相和固定相的状态及分离原理的不同又可分为气-固吸附色谱和气-液分配色谱两种，气-液分配色谱应用最广。本法所用的仪器是