生物技术概论细胞工程课件

第四章细胞工程

CellEngineering主要讲授内容：1细胞工程概述2植物细胞工程3动物细胞工程4微生物细胞工程本章要求：理解细胞工程的概念；掌握植物组织培养的基本原理和方法；理解植物非试管快繁的基本原理和方法；理解植物细胞培养、人工种子、细胞融合的基本原理和方法；了解植物细胞工程的研究进展与应用前景；理解单克隆抗体技术、细胞核移植与动物克隆、染色体转移、干细胞等研究的基本原理与方法；了解动物细胞工程的研究进展与应用；了解微生物细胞工程的基本原理；了解微生物细胞工程的研究进展与应用。1.1细胞工程概念细胞工程：在细胞水平上研究、开发、利用各类细胞的工程，即人们根据科学设计改变细胞的遗传基础，并通过无菌操作，大量培养细胞、组织乃至完整个体的技术（教材P60）。细胞工程：应用细胞学的方法，按照我们人类的需要和预定的设计，有目的、有计划地保存、改变和创造新细胞及其遗传物质，从而产生新的种或者品种的技术。细胞工程：应用细胞生物学和分子生物学的方法，在细胞水平进行的遗传操作。1细胞工程概述细胞工程：是指以细胞为基本单位进行培养、增殖（细胞培养组织培养）或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性，从而创造新的生物和物种，以获得具有经济价值的生物产品。它主要由两部分构成，其一是上游工程，包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏三个步骤。另一个则是下游工程，是将已转化的细胞应用到生产实践中去，以生产生物产品的过程。1.1细胞工程概念1.2细胞工程研究的对象

细胞或其组成部分和构成的组织、器官等如染色体、细胞核、原生质体、整个细胞、受精卵、胚胎、组织或器官。1细胞工程概述1.4细胞工程的优点1.4.1

细胞工程开辟了基因重组的新途径，它不需要经过分离、提纯、剪切、拼接等基因操作只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中，就能够形成杂交细胞，因而提高了基因转移的效率。1细胞工程概述1.4.2细胞工程克服了常规杂交的局限性，使远缘杂交有了新的途径。它不仅可以在植物一植物之间，动物与动物之间，微生物与微生物之间进行远缘杂交，甚至可以在动物与植物、动物与微生物之间进行细胞融合，形成杂交物种。土豆—番茄、山绵羊、大豆—烟草、芹菜—胡萝卜。1.4.3用细胞工程的技术来改造和创造新生物，比起用基因工程技术来稍为容易些。1.4细胞工程的优点1.5细胞工程与其他生物工程的关系细胞工程与其他生物工程的关系1细胞工程概述优质植物快速培育与繁殖动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种利用动植物细胞培育生产活性产物、药品新型动植物品种的培育供医学器官修复或移植的组织工程转基因动植物的生物反应器工程珍稀动植物资源的保存与保护在遗传学发育学等领域的理论研究在能源、环境保护等领域的应用1.6细胞工程的应用2植物细胞工程2.1植物组织培养2.2植物细胞培养2.3植物非试管快繁2.4植物原生质体培养与融合2.5人工种子的研制2.6植物细胞工程研究进展（综述）2.1植物组织培养

（Planttissueculture）2.1.1几个重要概念2.1.2对植物组织培养实验室的要求2.1.3植物组织培养的步骤2.1.4主要植物组织培养技术2植物细胞工程

脱分化

再分化

外植体愈伤组织生长点

幼茎、根

小植株

植物组织培养：

在无菌条件下，将离体的植物器官（根尖、茎尖、叶、花、果实、种子等）、组织（花药、胚乳、皮层、髓组织等）、细胞（体细胞、生殖细胞等）、胚胎（成熟或未成熟的胚）、原生质体等培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、丛生芽或长成新的完整的植株的一种实验技术。由于在试管内培养，且培养的是脱离植株母体的培养物，所以也叫“离体培养”（Cultureinvitro）或“试管培养”（Intest-tubeculture）。2.1.1几个重要概念外植体(Explant)：植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。愈伤组织(Callus)：外植体产生的排列疏松而无规则且没有发生分化的薄壁细胞。

脱分化（dedifferentiation）：原来已经分化,并且具有一定功能的体细胞(或性细胞),丧失了原有的结构和功能,又重新恢复了分裂功能,就叫做植物细胞的脱分化。2.1.1几个重要概念接种室培养室2.1.2对植物组织培养实验室的要求观察与鉴定室大棚2.1.2对植物组织培养实验室的要求2.1.3植物组织培养的步骤

()2.1.3.1培养基配制2.1.3.2灭菌2.1.3.3接种2.1.3.4培养2.1.3.5试管苗驯化移栽2.1.3.6试管苗增殖率的估算2.1.3.7快速繁殖工作的计划安排

2.1植物组织培养有机营养成分：（配成母液

）碳水化合物：蔗糖和葡萄糖，白糖节约成本一般的使用浓度为2%—4%。植物生长调节物质（常称为激素）：配成母液

生长素：NAA、IAA、IBA、2，4－D；细胞分裂素：KT(激动素)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)、ZT（玉米素）、2－iP（2－异戊烯腺嘌呤）、4PU、CPPU（吡效隆）和TDZ（噻重氮苯基脲）。其它：赤霉素（GA3）；脱落酸（ABA）；多效唑（PP333

）水：①一个完善的培养基成分

②培养基的种类：按培养基组成特点分类第一类为含盐量高的培养基，如MS、LS、BL、ER。第二类为硝酸钾含量高的培养基，如B5、N6、SH。第三类是无机盐中等含量培养基，如H和Nitsch培养基。第四类为低盐含量基本培养基，如White、WS和HE培养基。

按培养基的功能分类脱分化培养基初代培养基分化培养基壮苗培养基生根培养基继代培养基２.1.3.1培养基

的配制2.1.3.1培养基

的配制③怎样选取最佳培养基方案（例：MS+6BA0.5mg/L+NAA1mg/L+Su3%+Agar0.6%）对于某个待培养的目的植物来讲：查资料-----预备性试验----观察培养物的反映-----调整：单因子试验，多因子试验和正交设计-----逐步添加和逐步排除基本培养基的选择激素的选择：激素种类、浓度、激素配比糖的选择：糖的种类、浓度的选择琼脂的选择：主要是浓度的选择附加物的选择：香蕉汁、活性炭、椰子汁等浓度为mg/L细胞分裂素0.5

1.5

34.5生长素0

（1）（2）（3）（4）0.5

（5）（6）（7）（8）1.0

（9）（10）（11）（12）1.5

（13）（14）（15）（16）④培养基的配制方法（药品室进行）MS+6-BA0.5+NAA1+Su3%+Agar0.6%500mL

水+母液：激素或其他成分：如活性碳等糖类：一般30g/L琼脂：一般6－8g/L加热溶化：pH值调整：定容：分注、封口：灭菌：2.1.3.1培养基

的配制2.1.3.2灭菌①湿热灭菌：培养基及布制品的灭菌几种排气的方法：时间与体积的关系：放气方法：容器的体积/mL在121℃灭菌所需最少时间/min20-501575-15020250-500251000302.1.3植物组织培养的步骤②灼烧灭菌：用于无菌操作的器械95%的酒精+酒精灯火焰上灼烧接种器杀菌器：如图③过滤灭菌：不耐热的物质2.1.3.2灭菌④干热灭菌：玻璃器皿及耐热用具等⑤紫外线和熏蒸灭菌：空间灭菌所用（培养室、接种室等）⑥一些物体表面用药剂喷雾灭菌

2.1.3.2灭菌⑦消毒剂表面灭菌：植物材料（超净工作台上，接种室）

消毒剂因素材料采集的因素老嫩因素部位因素天气因素季节因素时间因素

外植体消毒步骤2.1.3.2灭菌消毒剂因素消毒剂使用浓度去除难易消毒时间（分）效果次氯酸钙9％－10％易5－30很好次氯酸钠2％易5－30很好过氧化氢10％－12％最易5－15好溴水1％－2％易2－10很好硝酸银1％较难5－30好氯化汞0.1％－1％较难2－25最好抗生素4－50mg/L中30－60较好酒精70％－75％易数秒－5分好漂白粉饱和易5－30很好2.1.3.2灭菌外植体消毒步骤材料→自来水→蒸馏水→75%酒精30~60S无菌水3~4次→10%次氯酸钠或次氯酸钙饱和液或0.1~0.2%升汞（吐温）5~15min→无菌水洗5~8次。2.1.3.2灭菌２.1.3.３接种（接种室）2.1.3植物组织培养的步骤2.1.3.４培养Culture（培养室）培养方法

固体培养法

液体培养法

培养步骤

初代培养：愈伤组织；原球茎；顶芽和腋芽的发育；不定芽的发育；体细胞胚状体的发生与发育；初代培养外植体的褐变继代培养：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等生根培养:2.1.3植物组织培养的步骤培养条件：环境培养条件：温度（Light)、湿度（Humidity)、光照［光质（Lightwave)、光强（Lightintensity)、光周期（Lightperiod)］化学环境条件：渗透压（Penetratingpressure)、ｐＨ、气体（Gas)1.3.４培养2.1.3.5试管苗驯化移栽①试管苗与大田苗在生理、形态等方面的差异②异养型自养型③无菌有菌④管理：保持小苗的水分供需平衡。防止菌类滋生。一定的温、光条件。保持基质适当的通气性。

2.1.3植物组织培养的步骤2.1.3.6试管苗增殖率的估算①基本数据的统计每一周期（从接种当天到再次可供接种的当天）需要多少天每一周期每一瓶能接种多少瓶每瓶有多少苗①基本数据的统计每一周期（从接种当天到再次可供接种的当天）需要多少天每一周期每一瓶能接种多少瓶每瓶有多少苗2.1.3植物组织培养的步骤②计算出年增殖率的理论值年增殖率：Y；每周期增殖的倍数：X；

全年可增殖的周期数：n=365/每一周期的天数；

Y=Xn

2.1.3.6试管苗增殖率的估算仙茅（石蒜科）葡萄（葡萄科）茶树（山茶科）麻疯树（大戟科）油樟（樟科）生姜（姜科）兰草（兰科）芦荟兰草麻疯树移栽2.1.3.7快速繁殖工作的计划安排人工的配置安排实验启动的时间安排增殖瓶数的控制污染的估测2.1.3植物组织培养的步骤2.1.4植物主要的组织培养技术2.1.4.1植物脱毒与快繁技术2.1.4.2花药及花粉培养2.1.4.3植物胚胎培养2.1植物组织培养2.1.4.1植物脱毒与快繁技术2.1.4植物主要的

组织培养技术①意义快速繁殖，保持优良品质生产无毒苗，提高苗木品质节约土地快速繁殖：一片树叶能变一座森林一年内可从一个兰花茎尖繁殖出400万株遗传性状均一的健康植株；花叶芋：常规繁殖：几倍——几十倍组培繁殖：几万——数百万倍月季、菊花、牡丹、山茶等。脱毒花卉：去病毒后，植株生长势强，花朵变大，色泽鲜艳，抗逆能力提高，产花数量上升。预计在21世纪，这一技术的应用将更为广泛。如：兰花、大丽花、水仙、天竺葵菊花等。脱毒马铃薯：增产40-200%(2000-2500kg/亩)。红薯：增产30%以上。草莓：增产500-1000千克/亩2.1.4.1植物脱毒与快繁技术2.1.4.1植物脱毒与快繁技术②植物脱毒技术为什么植物需要脱毒?脱毒方式：热处理脱毒→病毒钝化(寄主植物很少或不会受到伤害)温汤浸渍处理：在50℃左右的温水中浸渍10分钟至数小时。缺点：易使材料受伤。热空气处理：35-40℃，几十分钟，长可达数月温热治疗室（箱）内。缺点：缺陷是并非能脱除所有病毒热处理需与其他方法配合应用才可获得良好的效果。

生长点（约0.1-1MM区域）几乎不含或含病毒很少.分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。

茎尖培养脱毒2.1.4.1植物脱毒与快繁技术其他途径脱毒

愈伤组织培养脱毒

仅有部分单个细胞含有病毒——病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度或有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。缺陷——植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株，并且一些作物的愈伤组织尚不能产生再生植株。

化学疗法脱毒

许多化学药品（包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等）对离体组织和原生质体具有脱毒效果。2.1.4.1植物脱毒与快繁技术③脱毒效果检测抗血清(antiserum)鉴定：已知植物病毒——核蛋白（抗原）制备抗体；抗血清+未知的病毒植物→可见的沉淀（试管）酶联免疫吸收鉴定（ELISA）：已知植物病毒（抗原）+一抗（已制备）——二抗（酶）——酶的显色底物溶液——酶标仪检测电子显微镜（electricmicroscope)检查法：直接观察病毒的有无或种类指示植物法(indicatingplant)：被鉴定植物的汁液接种指示植物或嫁接接种法（指示植物作为砧木，被鉴定植物作接穗）指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。2.1.4.1植物脱毒与快繁技术2.1.4.2花药及花粉培养①概念与意义花药培养：花药培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花粉的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，产生再生植株，或形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。属器官培养还是细胞培养？花粉培养：花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株。优点：不受花药的药隔，药壁、花丝等体细胞的干扰；缺点是较比花粉培养难度大。属器官培养还是细胞培养？为何更多的要花药培养?(药壁提供营养)共同的目的：花粉细胞→单倍体(haploid)细胞→单倍体植株（但不是最终目的但具应用潜力，为什么？）→经染色体加倍→正常结实二倍体植株。

2.1.4植物主要的

组织培养技术2.1.4.2花药及花粉培养单倍体植物三个明显的特点：

体细胞染色体数减半；

生长发育弱，体形小、各器官明显减小；

雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。单倍体的应用潜力：迅速获得纯合型材料，缩短育种年限

获得育种中间材料

与诱变育种相结合可以提高诱变频率与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义

作为遗传工程受体更为有效（当代表达）

用作基础遗传研究的各个领域加倍后的二倍体特点：属于真正的纯系。和常规多代自交纯化方法相比，可节省大量的时间和劳力。

2.1.4.2花药及

花粉培养2.1.4.2花药及

花粉培养②花药培养的基本程序是：

外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。

烟草、茄子3～5℃72小时

水稻10℃10～14天

柑橘3℃5～10天

马铃薯4℃48小时低温处理的作用：可以激发花粉母细胞产生两个相等核:一个营养核一个生殖核；

保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老；激发花粉产生原胚；

促使细胞同步分裂。2.1.4.2花药及

花粉培养③花药培养中单倍体形成的途径营养细胞发育途径:生殖核退化,营养核发育生殖细胞发育途径:营养核退化，生殖核发育营养细胞和生殖细胞同时发育的途径:花粉均等分裂途径:

2.1.4.2花药及

花粉培养形成胚状体或愈伤组织④花粉及小孢子培养花粉培养的基本程序是：

取材时期的确定－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—花粉或小孢子的分离—接种—培养取材时期的确定四分体—单核早期—单核晚期—双核早期—双核晚期—三核期预处理有利于改变正常的发育途径，而且还可以促进花粉植株的形成花粉或小孢子的分离:花药→小烧杯(有基本培养基)→挤压花药(注射器内管)花粉释放→过滤(尼龙筛)→低速离心（100-160r/min)→吸管吸掉碎片→加入新鲜培养基→连续进行两次过滤，到每毫升含103-104个花粉/mL

培养方法

花药看护培养

花粉悬浮培养（微室培养）

2.1.4.2花药及

花粉培养⑤单倍体植株的鉴定与二倍化鉴定方法：形态学鉴定染色体分析单倍体植株的二倍化：继代加倍创伤法加倍秋水仙素处理加倍2.1.4.2花药及

花粉培养2.1.4.3植物胚胎培养植物胚胎培养包括胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养。①植物胚培养(embryocultureofplants)克服杂交育种中杂种胚的早期夭折胚培养包括成熟胚(matureembryo)培养；幼胚(immatureembryo)培养幼胚培养中，常见的生长方式有三种：(1)、胚性发育(embryonaldevelopment)幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。(2)、早熟萌发(earlymaturesprouting)幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。(3)、愈伤组织(callus)在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。2.1.4.3植物胚胎培养②子房培养子房培养包括授粉前和授粉后的子房培养。材料的选择品种间的差异胚囊发育时期与花粉发育时期的相关性（大麦）花粉发育时期胚囊发育时期

单核中期大孢子四分体

单核靠边期单核至四核胚囊

二核花粉期八核胚囊

三核花粉期成熟胚囊

2.1.4.3植物胚胎培养胚胎培养中单倍体的来源和发育途径由助细胞或胚囊的无配子生殖产生单倍体卵细胞、助细胞、反助细胞均可发育产生单倍体非正常发育的大孢子四分体产生单倍体2.1.4.3植物胚胎培养③胚乳培养胚乳细胞的全能性？被子植物与裸子植物胚乳（三倍体或单倍体？）（在离体培养条件下，胚乳细胞是否与其它体细胞和花粉一样，具有全能性而再生植株。）大多数被子植物的胚乳是三倍体，能否通过胚乳培养获得三倍体植株而得到无籽结实；通过胚乳培养技术，探索改良农、林及园艺植物三倍体育种技术的可能性。到目前为止，已有40多种植物的胚乳进行了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等的胚乳培养得到了再生植株。其它有的分化除芽、根、叶等或得到愈伤组织。2.1.4.3植物胚胎培养裸子植物很特殊，它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳为配子体的一部分，由大孢子直接分裂发育而成，因此它是单倍体组织。在被子植物中胚乳是双受精的产物，在倍性上属于三倍体，事实上我们培养胚乳的首要目的也是为了直接获得三倍体植株。2.1.4.3植物胚胎培养2.2.1细胞悬浮培养

2.2.2固定化细胞培养2.2.3植物细胞大规模培养与有用物质生产2.2植物细胞培养(suspensionculture)2植物细胞工程2.2.1细胞悬浮培养2.2.1.1细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。植物细胞培养中常用方法。怎样获得单个游离细胞?（酶解）怎样获得小细胞团？（愈伤组织分割；机械法；单细胞聚集）2.2.1.2基本过程：外植体（幼胚、胚轴、子叶等）→培养基→愈伤组织（松散性好、增殖快、再生能力强）或酶解物→震荡培养→大量植物细胞→次生代谢产物2.2植物细胞培养(suspensionculture)2.2.1.3悬浮培养三个优点：改善营养供应：增加培养细胞与培养液的接触面；避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；可以适当改善气体的交换。2.2.1细胞悬浮培养2.2.1.4一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：·悬浮培养物分散性良好：细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。·均一性好：细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。·细胞生长迅速：悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。2.2.1细胞悬浮培养2.2.1.5植物悬浮培养系统：封闭式培养系统组成、操作、有缺点（→半连续培养和连续培养）实例（银杏、冬青、蔷薇等）2.2.1细胞悬浮培养机械搅拌式培养系统

机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；为便于取样观察，一般还设计有取样口。优点：很高的溶氧系数，适于耐剪切力强的植物细胞培养。缺点：剪切力大实例：烟草细胞、水母雪莲细胞等气压搅拌式培养系统

考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。2.2.1细胞悬浮培养2.2.1.6植物悬浮培养（小细胞团）的目的（或应用）：种质保存—固体培养基上继代培养得到大量植物细胞产物——基上进行，如人参干细胞粉；紫草细胞消炎药物得到次生代谢产物——液体培养(主要应用)生物转化——利用酶系的作用将第五转化为所需的产物2.2.1细胞悬浮培养2.2.2固定化细胞培养2.2.2.1固定化细胞：指固定在载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。优点：稳定性好，产物易分离，利于连续化生产缺点：只适合分泌到细胞外的次生代谢物的生产细胞生长分裂旺盛时，次生代谢物产量低。采用固相培养，将细胞培养在惰性基质中，细胞生长缓慢，可提高次生代谢物质的产量.2.2植物细胞培养(suspensionculture)2.2.2.2植物细胞固定化的方法①吸附法:利用各种固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法。吸附材料：多孔陶瓷、多孔塑料、多孔玻璃等。实例：多孔泡沫放入辣椒细胞的培养液中；2.2.2固定化细胞培养②包埋法包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；

·附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。2.2.2.2植物细胞固定化的方法2.2.2.3固定化植物细胞的特点（与植物细胞悬浮培养对比）①减轻剪切力和其它外界因素对植物细胞的影响，提高植物细胞的存活率和稳定性（载体的保护作用）②细胞不易聚集成团（细胞被束缚在一定的范围）③更换培养液容易④缩短生产周期（可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产）。⑤固定化细胞易与培养液分离⑥细胞生长缓慢，可提高次生代谢物质的产量。2.2.2固定化细胞培养消除代谢产物积累对细胞生长的抑制作用(培养周期——延迟期（细胞很少分裂或刚刚开始分裂），直线生长期（对数生长期，细胞生长分裂旺盛时，次生代谢物产量低，细胞数目迅速增长，生长速率保持不变生长期，细胞数增长最快，而细胞的干重和蛋白质含量增长较慢），减缓期（细胞数目的增长速度减缓），静止期（细胞分裂停止，细胞数目恒定。培养基中营养耗尽，必须进行继代培养，进入静止期之前，细胞数增长减慢，而细胞鲜重和干重增长超过了细胞数的增长，并一直持续到静止期）

2.2.2固定化细胞培养

2.2.2.4固定化植物细胞培养系统平床培养系统立体培养系统2.2.2固定化细胞培养2.2.2.5固定化植物细胞培养的应用2.2.2固定化细胞培养扫描图：P115（细胞培养书）2.2.2固定化细胞培养2.2.3植物细胞大规模培养与有用物质生产

利用培养细胞生产有用物质（次生代谢物质）的原理细胞的全能性：培养细胞具有该物种的药物生物合成（次生代谢物质）的全能性。每个植物活细胞都具有该物种的新陈代谢、应激性和自体复制等生命基本属性，在合适的离体培养条件下，可以展现这些特征属性。。植物次生代谢产物是指植物中一大类非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。2.2.3.1一般程序

①选材培养器官、组织的选择：取有药效成分的部位，且该部位较易形成愈伤组织。细胞生长状态的选择：自然条件下，一般植物生长不活跃的部分，如老叶、果实和种子，倾向于积累次生代谢物，而分生组织等快速生长的部分，次生代谢物的含量低。植物离体培养下，一般脱分化的细胞生长旺盛，很难积累次生物质。当细胞接近于衰老时，才趋向于积累次生代谢物质。2.2.3植物细胞大规模培养与有用物质生产②细胞株系建立建立悬浮细胞繁殖体系（液体培养）合成能力高的细胞株系的筛选与更新：筛选高产的细胞株系是提高生产率、降低生产成本的重要因素。

对细胞培养的选择有两个基本要求：（1）有用物质的合成积累能力强（2）生长速度快

2.2.3.1一般程序③大量培养将选出的优良细胞株扩大繁殖后，可作为细胞工厂化培养的生产“种子”，进行大量培养。④产品提取与纯化从植物细胞培养物中提取和纯化有的产品。2.2.3.1一般程序2.2.3.2培养方法——二步培养法

细胞生长与次生物质的产生对培养基与培养条件的要求不同，因而在细胞工厂化培养中采用二步培养方法，既使细胞生长快，又使次生物质代谢多。第一步，促进细胞分裂，解决生物量生产问题；第二步，促进次生代谢物合成，解决次生物质的积累问题。在细胞指数生长停止期前后才更换培养基，有利于次生物质的积累。（一部分细胞用于提取物质，另一部分用于继续培养，进行下一个细胞周期）

2.2.3.2

培养方法——二步培养法

2.2.3.3提高有用物质生产效率的技术因素

①细胞株系生物合成能力以特异的器官为材料筛选生物合成能力强的细胞株

Wayner等用柠檬叶、鸡眼藤的培养物，经过筛选细胞株系，其次生代谢物是该植物完整植株的10倍。Zenk从长春花的培养物中，筛选出高产细胞株系，其生产根碱和阿玛碱的总量，比亲本植物高1.5倍，是亲本植物根含量的5倍。②培养基中添加前体前体：有用次生代谢物的前驱物。烟草愈伤组织培养中，将前体物质—烟碱酸加入，会增加烟碱的生成量。（前体物质的加入时间非常重要，应注意。）③培养基中生长调节剂（激素）的作用植物生长调节剂不仅影响植物的脱分化与再分化，而且能影响次生代谢物质的产生。如烟草愈伤组织培养中，培养基中添加吲哚乙酸（IAA），能合成烟碱，而在含有2,4-D的培养基上，烟碱合成受阻。2.2.3.3提高有用物质生产效率的技术因素④培养条件的影响光照、温度等影响次生代谢在胡萝卜愈伤组织培养中，光照条件使紫红色愈伤组织能够生成大量的花箐苷，并且低温条件下，生成量高。2.2.3.3提高有用物质生产效率的技术因素2.2.3.4细胞大规模培养与有用物质的生产生物碱类黄酮类萜类菑体类蛋白质和多肽类①生物碱苦参的愈伤组织——苦参碱——降血压、扩张血管，治冠心病。乌头愈伤组织——乌头碱——驱寒、散风、通经、止痛长春花愈伤组织——长春花碱——治白血病高效药喜树叶愈伤组织——喜树碱——抗肿瘤黄连愈伤组织——小蘖碱（黄连素的主要成分）——抗菌消炎②萜类物质利用人参愈伤组织培养生产皂苷已进入工厂化生产。紫杉醇③醌类物质利用紫草、决明等愈伤组织培养，生产具有抗细菌活性的醌类物质。④蛋白质商品胰岛素多数从动物的胰脏提取，但价格昂贵。从苦瓜离体培养物种可提取胰岛素。SOD、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳酶⑤类黄酮类：银杏黄酮、花青素、查尔酮⑥菑体类：VD、激素、强心苷2.2.3.4若干有用物质的生产2.2.3.5存在问题

植物细胞培养生产有用物质尽管有种种优点，但与微生物培养比还存在许多问题。生长速度较慢，通常完成一次生产周期需4~5周才能完成；而微生物的工业发酵只需几天就可完成发酵全过程。植物细胞培养生产次生代谢物的总量一般比植物本身低，这主要是由于大多数离体培养细胞不能合成和积累所期望的化合物，当然也有些细胞株系产量高，这与微生物大不相同。2.2.3.5存在问题生产技术上还存在一些问题。培养过程需要复杂的培养基及附加物，且易受细菌、真菌的污染；次生物的产量不甚稳定，成本较高等。2.2.3.5存在问题2.3植物非试管克隆技术TechniqueofEfficient&RapidNon-tubePlantCloning该技术是基于一个集温度、湿度、光照、二氧化碳浓度、蒸发系数、营养液浓度等为一体的传感器（智能叶片），通过计算机控制系统为植物的离体材料创造最佳的生根环境，并采用无土栽培及技术，实现苗木快速繁殖的一项高新技术。2植物细胞工程基本流程：插床设置（苗床或营养袋）→铺设基质→插穗来源→插穗规格（硬枝或绿枝）扦插专用药剂处理（药剂型号）→扦插生产周期安排→插后智能叶片管理(T、R、光照、杀菌、补充营养液)→育苗生根成活→炼苗移栽→定植大田或苗圃继续培养非试管繁殖与组培的区别非试管繁殖组培培养地点试管内大田内成活率移栽成活率低移栽成活率高成本投入成本高投入成本低操作操作复杂操作简易品种范围快繁品种范围窄繁品种范围广非试管繁殖与传统营养繁殖的区别非试管繁殖传统营养繁殖季节限制不受季节限制受季节限制集约化程度土地使用率高，有高度的集约化与规模化土地使用率低，集约化与规模化不高品种限制品种限制不大，传统扦插品种限制大插穗需求量对插穗需求量小传统扦插对插穗需求量大操作管理与劳动投入有优势无优势根系发达，成活率高不发达，成活率较低智能叶片智能模拟计算机豆腐菜（马鞭草科）桂花（木樨科）葡萄（葡萄科）松（松科）2.4植物原生质体制备与融合几个概念：什么是原生质体：？原生质体制备：将旺盛生长的植物细胞起来，悬浮在含渗透压稳定剂的高渗缓冲液中，加入适量的细胞壁水解酶，在一定条件下作用一段时间，使细胞壁破坏。除去细胞壁碎片、未作用的细胞等，即得。原生质体培养是将植物原生质体在一定条件下培养，经过细胞壁再生而形成细胞，再分裂成细胞团的过程。2植物细胞工程植物原生质体的特点（与植物细胞比）：仍然具细胞全能性：？（学生总结）吸收能力增强→利于….?（学生总结）分泌能力增强→利于….?（学生总结）稳定性较差→不利于….?（学生总结）解决？原生质体融合，即体细胞杂交。用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。原生质体制备和培养是原生质体融合的先导技术2.4.1基本程序：原生质体制备（材料的选择、酶的使用、渗透压的调控、原生质体的收集与纯化、原生质体活力的测定）→原生质体融合（自发融合、诱导融合）→杂种细胞选择→杂种细胞培养→由杂种组织再生植株→杂种或胞质杂种植株的鉴定2.4植物原生质体制备与融合电融合法：不存在对细胞的毒害问题；二是融合效率高；三是融合技术操作简便。PEG诱导融合法：融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。杂种细胞选择设计一个选择程序，使在某种条件下只有杂种细胞生长，而任一亲本却不能在此条件下生长，或生长速度缓慢、或中途夭折借助于精巧的显微操作技术将融合体和杂种细胞直接挑选出来进行单独培养杂种细胞的选择系统1、外观选择·互补选择·荧光标记选择2．体细胞杂种的鉴定2.4植物原生质体制备与融合鉴定：通过杂种植株和亲本植株的形态学特征来鉴定细胞学鉴定：杂种和亲本的核型分析生化鉴定：杂种和亲本的同工酶谱分析分子生物学的方法：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定杂种植株和亲本植株的其它特性2.4植物原生质体制备与融合2.4.2细胞融合的意义克服远缘杂交不亲和性，为广泛重组遗传物质开辟新途径(如野生种的有效利用等）

可缩短育种年限利用细胞融合技术转移细胞器（如叶绿体、线粒体等）及目的基因等。

2.4植物原生质体制备与融合2.５人工种子（artificialseeds）的研制2.５.1合成种子（syntheticseeds）或体细胞种子（somaticseeds）任何一种繁殖体，无论是在涂膜胶囊中包裹的、裸露的或经过干燥的，只要能够发育成完整的植株，均可称之为人工种子。2植物细胞工程2.5.2优点：2.5.2.1在无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种性，又可以使之具有实生苗的复壮效应；2.5.2.2可以对优异杂种种子不通过有性制种而快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植物更具有重要的实用意义；

·2.５人工种子的研制2.5.2.3对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍体、非整倍体、基因工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大繁殖应用；2.5.2.4与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的危险；2.5.2.5与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输。2.５人工种子的研制

2.5.3人工种子包被繁殖体的预处理（脱水干燥和强制休眠）→繁殖体的包埋(海藻酸钠作包埋介质)→贮存与萌发2.５人工种子的研制2.5.4人工种子的发展和应用前景2.5.4.1微器官人工种子可能最先用于无性繁殖植物2.5.4.2人工种子可用于天然种子繁殖后代群体变异大的植物2.5.4.3以体细胞胚为繁殖体应用的可能性及需要注意的问题2.５人工种子的研制小结：植物细胞工程的应用快速繁殖：一片树叶能变一座森林一年内可从一个兰花茎尖繁殖出400万株遗传性状均一的健康植株；花叶芋：常规繁殖：几倍——几十倍组培繁殖：几万——数百万倍月季、菊花、牡丹、山茶等。植物育种胚培养：对远缘杂交后杂种胚早期败育的杂种植物进行胚培养，得到远缘杂种：如山茶花、百合和鸢尾等许多花卉。烟草与大豆、烟草与天仙子、矮牵牛与小花矮牵牛、番茄与矮牵牛都得到了杂种植株。单倍体育种：花粉培养，如在矮牵牛的育种中已应用。芽变：如兰花；绿色菊花花瓣培养——开紫花的植株；玉簪嵌合体培养——金色斑点兼绿色斑点的植株；百合——四倍体：花大早花。体细胞突变体筛选：在组织培养过程中，植物的体细胞会发生各种各样的变异。利用植物细胞的全能性，可以将突变细胞培养成完整的植株，从而丰富植物的遗传变异，选育出新的品种和类型。离体诱变育种：可采用愈伤组织诱变、花粉培养等多种方法，来进行花卉育种。体细胞杂交和植物基因工程：如番茄与马铃薯的细胞融合。辐射育种培育无病毒苗(脱毒苗）脱毒花卉：去病毒后，植株生长势强，花朵变大，色泽鲜艳，抗逆能力提高，产花数量上升。预计在21世纪，这一技术的应用将更为广泛。如：兰花、大丽花、水仙、天竺葵菊花等。脱毒马铃薯：增产40-200%(2000-2500kg/亩)。红薯：增产30%以上。草莓：增产500-1000千克/亩植物种质保存用组织培养方法保存愈伤组织、胚状体、茎尖等组织：可节省大量人力和物力。也不会受自然环境的变化和病虫危害而流失。保存800个品种的葡萄种质需占地15亩，维持费用也十分昂贵。用试管保存，在温度9℃以下，植株便暂停生长，每年只需换转1次。8OO个葡萄品种，每个品种重复6个，只需1平方米场所。如有需要，随时可按极快速度再复制出来。有的在液氮（-196℃）中保存。P1772.6植物细胞工程研究进展

（学生综述）3动物细胞工程3.1动物细胞工程概述3.2动物细胞工程的主要技术及其实践意义单克隆抗体技术细胞核移植与动物克隆染色体转移干细胞研究3.3动物细胞工程研究进展与应用3.1动物细胞工程概述3.1.1动物细胞特性3.1.1.1动物细胞与植物细胞比较3.1.1.2动物细胞在活体内的特性动物细胞在胚胎期即已高度分化，而且这种分化是不可逆转的，

·活体内的动物细胞按照分裂能力可以分为三大类：

第一类是能保持继续分裂能力的细胞；

第二类细胞群是永久失去分裂能力的细胞；

第三类是静止细胞群，即所谓的G0细胞。3动物细胞工程3.1.2动物细胞培养的环境与营养要求3.1.2.1动物细胞培养的环境要求温度pH溶氧及气体环境渗透压3.1动物细胞工程概述3.1.2.1动物细胞的营养需求天然培养基其优点是营养成分丰富、培养效果好；缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。

·天然培养基的种类主要包括生物性体液（如血清）、组织浸出液（如胚胎浸出液）、凝固剂（如血浆）、水解乳蛋白等。3.1.2动物细胞培养的环境与营养要求合成培养基·合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体内生存环境中已知物质在体外人工条件的模拟，经过反复试验筛选、强化和重新组合后形成的培养基。

·合成培养基的优点：既能给细胞提供一个近似于体内的生存环境，又便于控制和提供标准化体外生存环境。

·合成培养基的主要成分：氨基酸、维生素、糖类、无机离子和其它辅助成分。3.1.2.1动物细胞的营养需求3.2动物细胞工程的主要技术及其实践意义3.2.1单克隆抗体技术路线单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myelomacell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridomacell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridomatechnology)。3动物细胞工程技术路线抗体的检测与杂交瘤选择单克隆抗体的大量生产单克隆抗体的鉴定3.2.1单克隆抗体技术路线应用广泛地由于临床医学的疾病诊断（高度的特异性与灵敏性）。生产各种免疫疫苗（降低生产成本，增加了疫苗的安全性

）某些肿瘤的治疗广泛用于各种基础医学研究3.2.2细胞核移植与动物克隆细胞核移植技术：是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞