哮喘患病及危险因素的研究

哮喘患病及危险因素的研究第1页/共29页ERCC1codon118单核苷酸多态性与草酸铂敏感性的关联性研究第2页/共29页

前言

大肠癌是世界范围内发病及死亡率较高的恶性肿瘤。近年来我国的大肠癌发生率也呈逐年上升趋势。遗传、饮食、肠道内微生态失衡等因素可能与其发生、发展密切相关。早期治疗的大肠癌一般预后良好，但对于进展期大肠癌患者，大多数治疗效果不尽人意。故探求新的有效治疗手段对挽救进展期大肠癌患者生命和提高生存质量具有重要意义。第3页/共29页

草酸铂（Oxaliplatin）是新一代铂类抗肿瘤药物，具有抗癌谱广，毒副作用小等优点，尤其可以用于有效治疗进展期大肠癌。然而由于临床用药的盲目与滥用，无论单独还是联合应用，草酸铂的目标有效率也仅为20%-35%。因此，提高草酸铂使用的有效性及安全性，降低耐药性的相关研究逐渐受到普遍关注。第4页/共29页

铂类药物的细胞毒作用主要归因为铂原子与细胞内DNA特异位点结合形成的铂-DNA加合物产生链间交联或链内交联，抑制DNA复制转录，导致细胞死亡。故其药物抵抗性与肿瘤细胞DNA损伤修复能力密切相关。草酸铂因具有1，2二氨基环己烷（DACH）结构，与DNA链中的鸟氨酸形成的DACH-Pt-DNA加合物更易诱导参与核苷酸切除修复（NER）途径的酶类，启动NER。第5页/共29页

NER过程涉及包括识别DNA损伤位点，切开受损的DNA链，合成并连接DNA链，以取代切除的寡核苷酸等，大约18-25个活性因子在其中发挥作用。第6页/共29页

切除修复交叉互补集团1基因（ERCC1）编码的ERCC1蛋白是NER途径中的关键因子.ERCC1与XPF形成一异源二聚体:ERCC1-XPF，具有重要的结构特异性核酸内切酶活性，在双链DNA交界处酶促5’端裂解，损伤的寡核苷酸可被切除。ERCC1蛋白表达水平的差异，可能直接影响到细胞的DNA损伤修复能力。第7页/共29页

诱导ERCC1蛋白表达，增加细胞的DNA修复损伤能力是一把“双刃刀”。一方面受损的DNA修复系统会增加发生肿瘤的危险性，这在肺癌、头颈肿瘤等恶性肿瘤的病因学研究中得到证实。另一方面ERCC1表达降低则难以清除铂-DNA加合物，增加肿瘤细胞对铂类药物的敏感性也是不争的事实。因此,ERCC1蛋白表达缺陷会降低细胞的DNA损伤修复能力，可能致使细胞对草酸铂敏感性升高。第8页/共29页

据报道ERCC1基因存在着两个常见的单核苷酸多态性,其中一个位于第4外显子118密码子（ERCC1codon118SNPs）,尽管这是一种保守的同义核苷酸突变（AAT→AAC），两者皆编码丝氨酸,但有人认为该SNP不同基因型可能通过改变ERCC1蛋白表达水平而导致肿瘤细胞对于草酸铂敏感性的差异,故将ERCC1codon118SNPs作为判断草酸铂治疗进展期肠癌疗效的一个遗传预测标记。第9页/共29页

研究目的:

*证实ERCC1蛋白表达水平与草酸铂敏感性的关联*阐明ERCC1蛋白在草酸铂细胞毒性机制的作用*构建两种包含ERCC1codon118SNP表达载体，获得稳定表达ERCC1不同基因型蛋白的转染细胞系*比较ERCC1codon118SNP不同基因型对ERCC1蛋白表达水平、细胞DNA损伤修复能力及对草酸铂敏感性的影响

第10页/共29页材料与方法

细胞系

中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）:AA8（CHO野生型）

UV20（CHO突变型，ERCC1表达缺失）

DMEM培养基，37℃,5%CO2培养箱中培养备用。

第11页/共29页方法:

构建两种包含ERCC1codon118SNP

的基因型T/T或C/C的质粒总RNA提取及cDNA合成PSQTMDNA短序列分析ERCC1SNP基因型ERCC1基因扩增及目的片段的回收Gateway™定向克隆技术构建ERCC1表达载体第12页/共29页Gateway™定向克隆技术构建ERCC1表达载体示意图第13页/共29页2、不同ERCC1SNP的表达载体转染UV20细胞

转染细胞可在含10%G418的DMEM培养基选择生长，次日调G418浓度为5%，五日后，在荧光显微镜下根据是否可见表达绿色荧光蛋白细胞，确定是否转染成功及转染效率。

每次转染实验设立无DNA的空白对照组，以保证实验结果的特异性第14页/共29页3、蛋白提取及Westernblot检测ERCC1表达获得3种稳定转染细胞系UV20-ERCC1(C/C)或

UV20-ERCC1(T/T)及UV20-GFP,聚丙稀凝胶电泳法定性检测ERCC1蛋白表达

4、检测各转染细胞ERCC1mRNA水平

实时-定量PCR法5、PSQTMDNA短序列确定转染细胞基因型

第15页/共29页6、SRB法测定草酸铂的细胞抑制率

7、细胞克隆实验分析草酸铂细胞毒性

8、改良彗星实验检测草酸铂所致DNA损伤9、Rad51免疫荧光实验评价草酸铂所致DNA损伤及修复第16页/共29页结果1、ERCC1入门载体及表达载体的构建、酶切鉴定及测序分析

ERCC1入门载体pDONR-ERCC1(3150bp)可选择生长于含1%卡那霉素培养基平板，质粒纯化后，用PstⅠ进行限制性酶切，得到533bp和2617bp的预期片段。

ERCC1表达载体pIRES-GFP-ERCC1(6626bp)可选择生长于含1%氨苄青霉素培养基平板经HindⅢ酶切后可获1227bp,5039bp片段,而经BglⅡ酶切后可获891bp,5735bp片段。第17页/共29页2、ERCC1在UV20细胞中的表达图1，ERCC1不同SNP转染细胞与UV20的FITC荧光图象比较（╳100）第18页/共29页3、Westernblot验证ERCC1在各细胞系中表达

38kDERCC1图2，WesternBlot检测ERCC1蛋白表达第19页/共29页4、转染细胞ERCC1的SNP确定

第20页/共29页5、不同细胞ERCC1mRNA水平比较

AA8、UV20以及三种转染细胞ERCC1mRNA水平差别具有统计学意义.（F=664.06,P=0.00）ERCC1缺乏细胞UV20和UV20-GFP均无ERCC1表达（LSD,P=0.732）。两种ERCC1SNPs转染细胞ERCC1表达接近.（LSD,P=0.648）

第21页/共29页6、草酸铂的细胞抑制率测定及细胞克隆实验结果

图4，各细胞草酸铂染毒后SRB细胞抑制率测定结果第22页/共29页图5，各细胞草酸铂染毒后细胞克隆实验结果第23页/共29页图7，草酸铂染毒后细胞培养24h两种转染细胞彗星实验图象（╳100）

第24页/共29页7、改良彗星实验测定各细胞DNA损伤修复程度

第25页/共29页第26页/共29页图9，ERCC1不同SNPs转染细胞草酸铂处理后24h免疫荧光图象（╳100）第27页/共29页讨论ERCC1基因存在着两个常见的单核苷酸多态性有报道认为ERCC1codon118SNP拥有T/T基因型的卵巢癌细胞系与ERCC1mRNA水平降低相关,有人将ERCC1codon11819007T>CSNP作为判断草酸铂治疗进展期肠癌疗效的一个遗传预测标记。但与此相反，通过对31例进展期肠癌分析数据发现，T/T基因