可移动的遗传因子

可移动的遗传因子第1页/共66页2023/3/102第一节转座子p68原核和真核生物基因组中的可以从一个部位转移到另一个部位的DNA序列，这些序列称为转座子(Transposon)第2页/共66页3BarbaraMcClintock

1902-1992B.MClintock于上个世纪40年代晚期在玉米中首次发现的。60年代，为J.A.Shapirc研究大肠杆菌高效突变实验证实。1983年荣获诺贝尔生物学医学奖。第3页/共66页2023/3/104转座子能够直接或间接地促进基因组的重排，转座作用能引起DNA序列缺失、倒位或将宿主的序列移动到新位点，因此转座子是原核或真核生物基因组内突变的主要来源。第4页/共66页2023/3/105转座方式有复制转座和非复制转座，大多数的转座方式为复制转座（即转座子的一个新的拷贝插入新的位点时，另一个拷贝仍留在原始位点）根据转座机制转座子可分为：转座子和逆转录转座子拷贝:copy的音译第5页/共66页2023/3/106MobileelementsViralfamilyWithLTRsNonviralfamilyWithoutLTRsBacterialISelementBacterialtransposonFruitflyPelementCornAcelementYeastTyelementFruitflycopiaelementSINEs(eg:Alufamily)LINEsThroughRNA(逆转录转座子)ThroughDNA(转座子)WithoutreversetranscriptaseWithreversetranscriptase第6页/共66页2023/3/107一、转座子分类和结构特征转座子都有一个保守结构，有一个或多个开放阅读框，两侧是反向末端重复序列（invertedterminalrepeats,ITR）转座子结构特征:转座酶识别的底物转座子的共同特点有：两端有末端反向重复序列转座后靶位点重复是正向重复编码与转座有关的蛋白可以在基因组中移动第7页/共66页反向倒转重复序列GGAAGGT、、、ACCTTCCCTTCCA、、、TGGAAGG反向重复序列GGAAGGT、、、TGGAAGGCCTTCCA、、、ACCTTCC正向重复序列TACGTTACGT2023/3/108第8页/共66页2023/3/109原核生物的转座子的种类：插入序列Insertionsequence,IS复合转座子Compositetransposon转座子A家族TransposonA,TnA转座噬菌体Mu噬菌体第9页/共66页2023/3/1010（一）插入序列IS末端含反向重复序列识别的靶点大多5-9bp含编码转座酶基因TSTransposasegeneTSIRIRTStargetsite靶位点Transposasegene转位酶基因IRinvertedrepeated反向（倒转重复顺序）第10页/共66页2023/3/1011（二）复合转座子

1.中间为标记基因

2.两侧臂是两个同向重复或反向重复的IS序列复合转座子的臂称为IS或类IS组件IS的末端反向重复第11页/共66页2023/3/1012（三）转座子A家族长约5kb,两端长约38bp的反向重复携带抗性基因和转座酶基因携带编码转座酶和解离酶基因tnpA编码转座酶tnpR编码解离酶Res解离的控制位点第12页/共66页2023/3/1013（四）转座噬菌体——Mu噬菌体,phageMu包括Mu和D108两种噬菌体，是一类温和噬菌体，线状DNA游离态和整合态有相同的基因次序，末端不含反向重复序列侵入的Mu可在溶源化过程插入寄主DNA任意部位，造成靶点倍生，原噬菌体两侧各有一个5bp的靶点重复序列Bar=50nanometers原噬菌体:prophage,整合入宿主DNA中的噬菌体第13页/共66页2023/3/1014真核生物转座子（了解）真核细胞内只要存在转座酶，任何序列片段具有该酶识别的反向重复末端均可发生转移最早发现的是玉米转座子，称为控制因子通常以非复制方式转座第14页/共66页1.复制型转座共联体生成和解离，靶序列的切割与复制。2.非复制型转座将供体DNA转座因子两侧各切断一条单链并与靶序列的两个游离末端连接，随后并没有复制过程，而是由转座酶将供体DNA转座因子的另一端也切断，因此在供体DNA留下一个致死性缺口。转座子的两条游离单链在靶位点退火接合，DNA聚合酶填平缺口。二、转座机制第15页/共66页2023/3/1016复制型转座包括两步：转座子本身的复制和基因靶序列的断裂及倍生1.基因靶序列的断裂及倍生.ATGCATACGT内切酶在靶序列两边切出切口靶序列转座子ATGCATACGT转座子ATGCATACGT第16页/共66页2023/3/1017Replicativetranspositioncreatesacopyofthetransposon,whichinsertsatarecipientsite.Thedonorsiteremainsunchanged,sobothdonorandrecipienthaveacopyofthetransposon.

复制型转座第17页/共66页三、转座的遗传效应1.基因重排可能产生1个新的蛋白分子等，基因重排是进化的动力。2.基因突变插入到基因内部，可引起插入失活。3.插入位点引入新的基因如引进抗药基因。第18页/共66页2023/3/1019

第二节遗传重组p88广义的遗传重组:减数分裂时通过同源染色体的交换和非同源染色体的独立分配，使子代细胞的遗传信息产生重新组合称为遗传重组（geneticrecombination）狭义的遗传重组:仅指涉及DNA分子内的断裂并重新连接而造成基因重新组合的过程即基因交换遗传重组是使生物产生遗传变异的原因之一第19页/共66页2023/3/1020遗传重组的分类

根据重组过程中涉及DNA序列和蛋白质因子的要求不同,将重组分为四类:同源重组(homologousrecombination)位点特异性重组(site-specificrecombination)转座作用(transposition)异常重组(illegitimaterecombination)第20页/共66页AA’复制___个DNA___个染色体___个姐妹染色单体___个DNA___个染色体___个姐妹染色单体重温故知——染色体复制110212第21页/共66页同源染色体

精子的头部卵细胞非同源染色体+受精卵12341和4、2和3真核生物性母细胞有两套染色体,一套来自于父本,一套来自于母本,两套染色体中大小、形状相同的染色体称为同源染色体如1和3、2和4homologouschromosome)第22页/共66页2023/3/1023概念：同源重组指发生在两条DNA的同源序列之间,涉及的是大片段同源DNA序列的交换。只要两条DNA序列相同或相近就可以在序列任一点发生同源重组.存在:真核生物姊妹、非姊妹染色单体的交换；细菌的转化、接合、噬菌体的转导.特点：参加重组的蛋白质因子对重组位点无序列特异性要求.一、同源重组第23页/共66页2023/3/1024（一）、同源重组的分子机制

（1）Hollidaymodel 1964年，美国科学家RobinHolliday提出（2）双链断裂模型Double-strandedBreakModel,DSBmodel

1989年，JackSzostak在酵母和质粒研究中发现两种模型的区别：出现断裂的位点的链不同第24页/共66页2023/3/1025（1）Hollidaymodel

1.切断3.分支迁移4.旋转去交叉结构2.交叉5.Holliday中间体拆分1964年，美国科学家RobinHolliday提出交互重组基因组无重组第25页/共66页2023/3/1026（2）双链断裂模型DSBmodel3’端链的延伸造成缺口处单链置换3’端入侵至另一双链断裂扩大为含3’端的间隙受体双链DNA断裂被置换的单链迁移至另一双链另外一个游离的3’端链延伸双向迁移两个交叉点第26页/共66页2023/3/1027WhatcausedDSBs?TheycanbecreatedbyProblemsinreplicationEnvironmentaldamage,eg.radiationdamageTheshorteningoftelomeresAlltheycancausemutations,soit’sarecombinationrepair.

Recombinationisanimportantmechanismtorecoverfromreplicationerrors!

第27页/共66页2023/3/1028(二)同源重组的酶学

同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。在所有的同源重组中,对E.coli和phage的研究最为深入.编码这些蛋白质的基因有27种,研究最清楚的是RecBCD,RecA,RuvAB,RuvC第28页/共66页2023/3/1029Nature

455,770-774(9October2008)Sae2,Exo1andSgs1collaborateinDNAdouble-strandbreakprocessingEleniP.Mimitou1&LorraineS.Symington1DepartmentofMicrobiology,ColumbiaUniversityMedicalCenter,701West168thStreet,NewYork,NewYork10032,USATheseresultssuggestatwo-stepmechanismforDSBprocessingduringhomologousrecombination.First,theMre11complexandSae2removeasmalloligonucleotide(s)fromtheDNAendstoformanearlyintermediate.Second,Exo1and/orSgs1rapidlyprocessthisintermediatetogenerateextensivetractsofsingle-strandedDNAthatserveassubstrateforRad51.关于真核细胞内蛋白质催化的同源重组机制研究第29页/共66页2023/3/10301.RecBCD含有三种亚基,具有核酸酶活性、解旋酶活性和ATPase活性:（1）DNA内切酶活性,尤其是chi位点附近,单链或双链外切酶活性（2）解旋酶活性（3）ATPase活性产生游离的3’末端RecBCD从一端向chi位点移动，一边降解DNA一边移动，在chi位点发挥内切酶活性，RecD解离，只保留解旋酶活性。第30页/共66页2023/3/10312.RecA又称为重组蛋白活性:单链DNA,双链DNA结合活性

NTP酶活性促进同源联会和链入侵Fig.Singlestrandassimilation第31页/共66页2023/3/1032（1）RuvAB具解旋酶作用,推动Holliday中间体分支迁移（2）RuvC具有内切酶活性,拆分Holliday中间体3.Ruv蛋白Fig.RuvABinbranchmigration第32页/共66页2023/3/1033补充说明

同源重组只涉及基因组DNA部分区域,并非整个染色体参与；当同源序列<75bp时，重组发生率降低；第33页/共66页2023/3/1034二、位点特异性重组p96典型的例子:λphage整合与切离-----原核生物抗体VDJ重排-----真核细胞位点特异性重组(Site-specificrecombination

)指不依赖于DNA序列的同源性,而依赖于能与某些酶相结合的特异DNA序列的重组.第34页/共66页2023/3/1035(一)λphage整合与切离几点说明:λphage溶源和裂解两条途径。Attachmentsite,att附着点,即整合与切离的位点attP,噬菌体,由POP’三部分组成,全长235bpattB,细菌,由BOB’三部分组成,全长23bpO为核心序列,全长15bpProphage:原噬菌体bacteriabacteriaphage第35页/共66页2023/3/1036λphage整合与切离发生DNA序列的重排P’p----B----O----P’---------------P-----O-----B’---第36页/共66页2023/3/1037λphage整合需要两个蛋白

Int,integrase整合酶

IHF,integrationhostfactor

整合宿主因子λphage切离需要三个蛋白

Int,整合酶

IHF,整合宿主因子

Xis,切离酶整合需要识别attP和attB,切离需要识别attL和attR,主要由Xis控制反应的方向 第37页/共66页2023/3/1038λphage整合与切离的特点:λDNA和宿主DNA的这种交换是可逆的,过程无DNA的丢失.λDNA和宿主DNA之间有一段很短的同源序列,重组交换必须通过其特定的序列.第38页/共66页2023/3/1039(二)抗体VDJ重排

利根川进揭示了抗体基因重排机制，获1987年Nobel生理学和医学奖3-D结构第39页/共66页2023/3/1040抗体背景知识针对上百万或上亿万的外来抗原，人体免疫细胞能产生相应于每种抗原的抗体，按照一个基因一条多肽连的说法是否说人类细胞有如此多的抗体基因呢？第40页/共66页2023/3/1041人体有5种主要的重链，形成5类免疫球蛋白第41页/共66页2023/3/1042IgGIgAIgMIgDIgE人体含量最多的抗体尤其存在于对抗微生物及其毒素的细胞外液人体上皮黏液浆液性分泌物中的主要抗体IgM是最早出现的免疫球蛋白,是抵御细菌的第一道防线主要表达在淋巴细胞表面体表保护性抗体，早期抗微生物抗体，与变态反应症状密切相关各类免疫球蛋白的生物学的生物学特征第42页/共66页2023/3/1043基因工程抗体药物第43页/共66页2023/3/1044抗体(antibody),又叫免疫球蛋白(Immunoglobulin),由四条链组成：两条重链，两条轻链.轻链有两种:λ链和κ链抗体与外来抗原结合位点称为可变区（V区），决定抗体特异性和多样性.其他部分称为恒定区（C区），对同一类抗体C区是不变的抗体的蛋白序列第44页/共66页2023/3/1045抗体基因是多基因片段编码的:V区抗体轻链中主要由V基因编码，J基因编码最后12个氨基酸；抗体重链中V和J之间还有一些D（diversity）基因片段C区由C基因编码1.抗体的基因第45页/共66页2023/3/1046抗体基因片段在基因组中的分布FamilyVGenesCGenesManMouseManMouseLambda<3002>64Kappa<300~100011Heavy~300>100098EachimmunoglobulinfamilyconsistsofaclusterofVgeneslinkedtoitsCgene(s).第46页/共66页2023/3/1047ThelambdafamilyconsistsofVgenesegmentslinkedtoasmallnumberofJ-Cgenesegments.λ轻链基因多样性—胚系DNA中ThehumanandmousekappafamiliesconsistofVgenesegmentslinkedto5JsegmentsconnectedtoasingleCgenesegment.κ轻链基因多样性—胚系DNA中第47页/共66页2023/3/1048Asinglegeneclusterinmancontainsalltheinformationforheavy-chaingeneassembly.抗体重链基因多样性—胚系DNA中第48页/共66页2023/3/1049

那么，抗体基因何时发生重排?

如何重排?

有无规律可循?第49页/共66页2023/3/10502.抗体的重排机制胚系DNA中并不存在每条H链和每条L链的完整基因,而是在B细胞的早期发育过程中,通过小段的基因片段拼接而成.如κ轻链:一个Vκ和一个Jκ连接成Vκ-Jκ,当B细胞抗体基因被转录后,细胞核RNA的剪接使得Vκ-Jκ与Cκ相连接.(1)、可变区重排特点轻链重排特点V-J

轻链有两大家族：κ和λ(大部分抗体是κ轻链)

重链重排特点V-D-J第50页/共66页2023/3/1051抗体κ、λ轻链可变区重排过程第51页/共66页2023/3/1052D-JV-DV-D-J抗体重链可变区重排过程第52页/共66页2023/3/1053a.基因两旁有保守的共有序列7聚体、9聚体（consensussequence）b.7聚体和9聚体间有非保守的重排信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)，12bp或23bpc.重排规则:12/23规则，即22bp的信号序列总是与23bp的信号序列连接，从而保证重链与轻链的正确连接

(2)、重排及重排信号

第53页/共66页2023/3/1054232323121212兰色：7聚体绿色：9聚体重链可变区的VDJ重排第54页/共66页2023/3/1055(3)、重组酶

a.重组激活基因，RAG（recombinationactivatinggens）基因编码的重组酶。RAG-1和RAG-2在Pre-T和Pre-B细胞表达，因此成熟的淋巴细胞不再进行抗原受体基因的重排。

b.TdT（末端脱氧核苷酸转移酶）第55页/共66页2023/3/1056关于VDJ重排的总结:抗体的多样性和抗原结合的特异性由其可变区决定,因此重排是指H链和L链可变区的重排,重排产生碱基的丢失和增加；重排发生在DNA水平,而剪接发生在RNA水平；L链可变区发生V-J重排,H链发生V-D-J重排；抗体多样性产生的原因一方面是B细胞成熟前发生的重排，另一方面是体细胞突变。当一个产生抗体的细胞克隆增殖时，如果遇到外来抗原，将产生抗体基因的突变，从而提供更多种类的抗体，与更多抗原作用。第56页/共66页2023/3/1057本章要求概念:转座子,复合转座子,同源重组，位点特异性重组，VDJ重排原核生物转座子的分类和转座特征;遗传重组的分类；同源重组的分子机制和酶学；噬菌体的整合与切离机制；VDJ重排掌握第57页/共66页2023/3/1058遗传重组在分子生物学中的应用GeneTargeting基因打靶

genetargeting

是利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源DNA序列发生重组的性质，进行定点修饰，改造染色体上某一目的基因的技术根据重组后靶基因变化分为两类：基因破坏或剔除genedisruptionorknockout基因取代genereplacement补充资料第58页/共66页2023/3/10591982年，美国学者Palmiter将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵，所生7只子代小鼠中有6只生长加快，体重明显增加，这就是所谓的“超级小鼠”(supermouse)诞生了。“超级小鼠”的建立成功轰动了整个生命科学界，科学家们对此表现出浓厚的兴趣，许多实验室竞相开展这方面的研究工作，因此转基因小鼠技术迅速发展，不断完善。transgenicmousewithanactiveratgrowthhormonegene(left)istwicethesizeofanormalmouse(right).Photograph第59页/共66页

2007NobelprizeforphysiologyormedicineMarioCapecchioftheHowardHughesMedicalInstituteattheUniversityofUtahSirMartinEvansofCardiffUniversityOliverSmithiesoftheUniversityofNorthCarolina,ChapelHill.GeneTargetinginMice第60页/共66页2023/3/1061Independently,bothCapecchiandSmithiesrealizedthathomologousrecombination,itselfthesubjectofthe1958Prize,couldbeusedtorepairdefectivegenes.Thiswasdonebyintroducingacorrectversionofthetargetgeneintothenucleusofacell.MartinEvan'scontributionwastheisolationofthemouseembryonicstemcell(ESC).Bycombiningthetwotechniques,itwasfinallypossibletocreategermlinemutationsthatwouldresultinanewstrainofmicewithaspecificmutation.第61页/共66页2023/3/1062Byreplacingacopyofafunctionalgenewithonethatisdamaged,butincludingagenethatconfersresistanceagainsttheantibioticneomycin,itbecamepossibletoselectforthepopulationofcellsthathadsuccessfullybeentransformed.WhentheseESCswereimplantedintofemalemiceandcarrie