口腔粘膜细胞基因组DNA制备

口腔粘膜细胞基因组DNA制备第1页/共20页基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。是一般的基因工程实验中DNA操作的最初步骤。

一、基因组DNA的提取与纯化目的：第2页/共20页二、人基因组DNA的制备

实验目的及意义：从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNA掌握基因组DNA抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理第3页/共20页分离纯化基因组DNA的常用方法：不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，分离方法也有差异。主要根据不同细胞的特点而有区别，但原理相似，因此它们有共同的步骤：

裂解细胞：SDS裂解细胞，EDTA抑制核酸酶

除去蛋白质：蛋白酶K水解蛋白质，酚和氯仿/异戊醇抽提、分离蛋白质；析出DNA：乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。第4页/共20页细胞样品的核酸提取的主要步骤破碎细胞去除细胞内的其它分子：蛋白质多糖脂类去除盐类、有机溶剂等杂质第5页/共20页实验材料及试剂材料：人口腔上皮细胞试剂：抽提缓冲液：Tris-ClpH8.0，EDTA，NaCl，RNAase，SDS，蛋白酶K水饱和酚氯仿/异戊醇（V/V=24:1）70%乙醇、无水乙醇TE缓冲液：Tris，EDTA第6页/共20页主要试剂的功能抽提缓冲液：由SDS、EDTA、蛋白酶K组成SDS的作用是裂解细胞EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子，防止DNA酶对DNA分子的降解作用。蛋白酶K的作用是水解蛋白质。酚和氯仿/异戊醇：抽提分离蛋白质乙醇：沉淀DNATE：溶解DNA第7页/共20页取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水10~15ml约2~3min，用15ml离心管（4000rpm

10min）收集细胞沉淀

（离心机的使用，平衡）

加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀，转移至1.5mlEP管①

（微量移液器的正确使用）混匀，65℃温育30min

加入等体积的【饱和酚(~0.25ml)：氯仿/异戊醇(~0.25ml)】充分颠倒混匀（不要剧烈震荡！）实验步骤及注意事项（一人一份）：

第8页/共20页12000rpm5min，上层水相转移至新的EP管②

（高速离心机的使用与安全意识）

加入等体积【氯仿/异戊醇】，颠倒混匀12000rpm5min，上层水相转移到新的EP管③

加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀12000rpm10min

第9页/共20页弃上清，沉淀中加入300l70%乙醇

12000rpm2min

轻轻弃去上清，打开EP盖，室温静置5~10min

加入30-50l0.1×TE溶液，充分混匀后检测结果

第10页/共20页核酸分离纯化的原则：

保证核酸一级结构完整排除其它分子的污染：细胞内：蛋白质、脂类、糖、RNA等提取过程中：有机熔剂、金属离子、外源DNA

第11页/共20页核酸提取注意事项减少化学因素对核酸的降解如过量酸碱减少物理因素对核酸的降解机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融高温防止核酸的生物降解核酸酶的预防

第12页/共20页常见问题：

1、提取的DNA不纯原因？改进的方法？2、提取的DNA成涂布状原因？改进的方法？3、没有获得足够量的DNA改进的方法？第13页/共20页分子医学实验注意事项微量移液器的正确使用离心机的正确使用上课纪律撰写实验报告的规范第14页/共20页实验结果及其分析定性分析：DNA琼脂糖凝胶电泳HLA基因多态性分析PCR下次实验课进行第15页/共20页预习电泳的原理基因诊断、分子诊断PCR的原理乙肝病毒临床检测方法HLA基因第16页/共20页实验报告格式实验目的和应用价值实验原理样品与试剂实验基本流程和注意事项实验结果和讨论总结或感想完成两部分的作业：课后作业，实验报告第17页/共20页其它/science-educati