核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座

什么是电泳？带点颗粒在电场作用下，向着与其电性相反电极移动，称为电泳。生物大分子如蛋白质，核酸，多糖等大多都有阳离子和阴离子基团，称为两性离子在电场中，带电颗粒向正极或负极迁移，迁移方向取决于它们带点符号。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第1页凝胶电泳有几类？一·琼脂凝胶电泳（分辨DNA范围为0.2~50kb)二·聚丙烯酰胺凝胶电泳（分辨范围为1~1000kb）三·脉冲电场凝胶电泳（分离到高达107bpDNA大分子）序言；核酸凝胶电泳是分子克隆技术之一，用于分离·判定和纯化DNA或RNA片段。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第2页核酸凝胶电泳基本原理

凝胶电泳原理比较简单。当一个带电分子放在电场当中时，它们就会以一定速度移向适当电极。带点分子在电场作用下移动速度，称之为电泳迁移率，它同电场强度和电泳分子本身携带静电荷数成正比。也就是说，电场强度越大，电泳分子所携带静电荷越多，其移动速度也就越快，反之则慢。在哪电泳中，使用无反应活性琼脂糖与聚丙烯酰胺凝胶作支持介质，从而将电泳分子对流运动降低到极低，使电泳分子移动速度与其分子摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小、极性及介质黏度函数，所以依据分子大小不一样、构型或形状差异，以及所带净电荷多寡，便能够经过电泳将核酸或蛋白质分子混合物中各种成份彼此分离开来。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第3页在生理条件下，核酸分子糖-磷酸骨架中磷酸基团，是呈离子状态。从这种意义上讲，DNA和RNA多核苷酸链可称为多聚阴离子。所以，当核酸分子被放置在电场当中时，它们就会向正极方向迁移。因为糖-磷酸骨架在结构上重复性质，相当数量双链DNA几乎含有等量净电荷，所以它们能以一样速度向正极方向迁移。在一定电场强度，DNA分子这种迁移速度，亦即电泳迁移率，取决于核实分子本身大小和结构。分子质量较小DNA分子比分子质量较大DNA分子，含有较紧密构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子质量涣散型开环DNA分子或线性分子要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段基本原理。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第4页常见电泳仪水平电泳仪垂直电泳仪核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第5页脉冲电泳核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第6页电泳梳子电泳槽核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第7页电泳仪核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第8页一·琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质一个电泳方法。对于分子量较大样品，如大分子核酸、病毒等，普通可采取孔径较大琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶含有网络结构，物质分子经过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到阻力大，所以在凝胶电泳中，带电颗粒分离不但取决于净电荷性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提升了分辨能力。凝胶分辨能力同凝胶类型和浓度相关。分辨DNA片段范围0.2~50kb；而要分辨较小分子质量DNA片段，则要用聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1~1000bp。凝胶浓度高低影响凝胶介质孔隙大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度越低，孔隙就增大，其分辨能力也就越弱。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第9页DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。因为糖-磷酸骨架在结构上重复性质，相同数量双链DNA几乎含有等量净电荷，所以它们能以一样速率向正极方向移动。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第10页琼脂糖凝胶电泳操作操作步骤：配胶EB染色点样

胶图分析成像拍照电泳核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第11页1、配胶按所要分离DNA分子大小，称取适量琼脂糖粉末，放入锥形瓶，加适量1×TAE电泳缓冲液；

然后置微波炉内加热摇匀至完全溶化成透明状，适当冷却后倒入胶托；胶完全冷凝后放入电泳槽，电泳槽里缓冲液必须没过胶面。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第12页铺胶核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第13页凝胶凝固后取出梳子核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第14页加缓冲液核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第15页2、EB染色溴化乙锭是一个扁平分子，能够嵌入核酸双链配对碱基之间。在在紫外照射EB-DNA复合物时，出现不一样效应。注意：严格区分污染区和非污染区，不把污染区物品拿到非污染区碰过EB手套要及时丢弃！核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第16页3、点样依据样品不一样可分两种点样体系：A、样品+6XloadingbufferB、样品能够直接点样核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第17页4、电泳点完样后连接电源，设置好电源参数，开始电泳。当溴酚蓝带（蓝色）移动至一定长度即可停顿电泳。电压要求：≤20V/CM胶，在样品出孔用低压（3V/CM，15min）,然后调回标准电压，跑出条带很好。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第18页成像拍照核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第19页胶图分析核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第20页注意事项核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第21页一、配胶1.电子称使用，要时刻注意保持电子称准确性，保持清洁，依据不一样浓度胶称取琼脂糖。2.加TAE量要适当，以防止配出来胶太薄造成胶孔太浅或浓度太低。3.倒胶前胶托一定要洗洁净，并檫干。倒胶时要待胶冷到一定温度摇匀尽可能不要产生气泡。若胶液温度太高胶托轻易变形。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第22页二、EB染色1.碰到EB手套要及时丢弃。2.加量要适当，加EB至终浓度0.5μg/ml3抹布要严格区分，不可交叉使用。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第23页三、点样电泳1.加样时，枪头要上紧，吸样均一准确，排液时吸头不要有残留。2.点完样后及时盖上胶垫，注意不要盖反。3.点电泳前最好检验待用胶是否合格，点电泳时要对准胶孔，尽可能点完全部样。4.点完样勿忘marker,并摆正胶位，电泳仪正负极不要插反，电泳槽盖子要盖紧。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第24页二·聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)，N，N，N’，N’四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联向成含有网状立体结构凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可依据不一样分子所带电荷差异及分子大小不一样所产生不一样迁移率将DNA或蛋白质分离成若干条区带，假如分离纯化样品中只含有同一个DNA蛋白质，样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一个阴离子表面活性剂能打断蛋白质氢键和疏水键，并按一定百分比和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷量远远超出其本身原有电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然电荷差异。所以，各种蛋白质SDS复合物在电泳时迁移率，不再受原有电荷和分子形状影响，只是棒长函数。这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAGE)。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第25页聚丙烯酰胺凝胶电泳种类

1.变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS）变性聚丙烯酰胺凝胶是分子生物学惯用技术之一，是依据寡核苷酸大小来分离，所以可将全长产物与不完整短分子分开。电泳时通常每一泳道最少加1mg合成寡核苷酸，电泳后在紫外灯下定位寡核苷酸条带，将长度正确寡核苷酸从凝胶上切下。主要用于单链DNA片段分离或纯化。

用途；放射性DNA探针分离，DNA测序等。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第26页2.非变性聚丙烯酰胺凝胶（native）

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native)或称为活性电泳是在不加入SDS和疏基乙醇等变性剂条件下，对保持活性蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，惯用于酶判定、同工酶分析和提纯。使生物大分子在电泳过程中保持其天然形状和电荷，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子生物活性，对于生物大分子判定有主要意义，用于双链DNA片段分离于纯化。

用途；制备高纯度DNA片段。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第27页操作步骤制板制浓缩胶电泳槽安装加样制分离胶染色电泳固定剥胶脱色观察结果核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第28页1.制胶1）在聚合分离胶上直接灌注浓缩胶，并马上在浓缩胶溶液中插入洁净梳子。小心防止混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间空隙，将凝胶垂直放置于室温下。2）浓缩胶聚合完成后（30分钟）小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。2.样品制备取样品加入0.5ml2×SDS凝胶加样缓冲液混匀。3.加样及电泳用吸嘴吸收50μl，从加样孔底部迟缓加样。注意：加样时不得插伤凝胶孔面，不得产生气泡、样品不得溢出加样孔。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第29页4.接电源与电泳上槽接负极，下槽接正极。调整电压至80V电泳至样品前沿刚好进入分离胶后，把电压提升到120V（凝胶上所加电压为8V/cm），继续电泳直至溴酚蓝抵达分离胶底部上方约1cm（约2—3小时），然后关闭电源，取出插头。5.剥胶从电泳装置上卸下玻璃，用水果刀撬开玻璃板。并用刀在紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶方位。6.染色与脱色用考马氏亮蓝染色液对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行室温染色1~2小时后，用脱色液在脱色摇床上与脱色3~4次，每次20~30分钟。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第30页注意事项1.丙烯酰胺和双丙烯酰胺含有很强神经毒性并轻易吸附于皮肤，操作时应防止沾在脸、手等皮肤上。最好戴一次性手套进行操作。2.过硫酸铵主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合反应，故一定要新鲜，贮存过久过硫酸铵商品不能使用。另外，10％过硫酸铵必须现配现用。3.灌制凝胶时，应防止产生气泡，因为气泡会影响电泳分离效果。4.刚灌制注分离胶混合溶液后，应在分离胶液面上加1~2cm高得水层，以阻隔空气。胶液面上加水层时要尤其小心，缓缓叠加，以免冲坏凝胶胶面。5.聚丙烯酰胺凝胶电泳耗时长，电泳过程中产热多，尤其是夏天产热更多。顾电泳过程中应安装循环冷却水以带走热量，或在4冰箱中电泳。℃核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第31页核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第32页非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第33页三·脉冲电场凝胶电泳（PFGE）在脉冲电场中，DNA分子迁移方向伴随电场方向周期性改变而不停改变。在标准PFGE中，第一个脉冲电场方向在另一侧成45°夹角。由于琼脂糖凝胶电场方向、电流大小及作用时间都在交替改变，使得DNA分子能够随时调整其游动方向，以适应凝胶孔隙无规则改变。与相对分子质量较小DNA相比，相对分子质量较大DNA需要更多脉冲次数来更换其构型和方位，使其按新方向游动。应用脉冲电场凝胶电泳技术，可成功分离到高达107bpDNA大分子。

核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第34页倒转电场系统垂直交变电场箝位匀强电场系统反转电场系统脉冲电场凝胶电泳类型核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第35页脉冲电泳操作步骤DNA样品制备限制酶消化脉冲分离、纯化大DNA片段EB染色，拍照紫外递质监测DNA搜集目标DNA核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第36页1.脉冲电泳凝胶电泳DNA样品制备（以金黄色葡萄球菌为例）（1）取100ml对数生长久金黄色葡萄球菌细胞于4℃，5000g离心5分钟（2）用20mlTEN缓冲液冲洗沉淀，一样条件离心5分钟。在用10mlEC缓冲液使细胞悬浮。（3）取1.5ml细胞样品与相同体积含2%SeaPLaque琼脂糖EC缓冲液快速混合均匀并等分流溶液至封闭模块中于4℃凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至50℃。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第37页（4）对于每一个菌株，需要15-20个凝胶块，将它们放至含有30-45ug/mlRNase10mlEC缓冲液中，于37℃振荡过夜。（5）去掉裂解缓冲液，换为10mlESP缓冲液于50℃轻度摇温育48h。（6）将凝胶块放在10ml含有174ug/ml苯甲基磺酰氟（PMSF）TE缓冲液中，室温温育4h,以灭活ESP中蛋白酶K。（7）用TE清洗琼脂块6h，至于TE中4℃保留。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第38页2.限制酶消化（1）25ul10x反应缓冲液，30U限制酶，加双蒸馏水至250ul混匀。（2）取一个凝胶块置其中，适当温度下过夜后，用TE缓冲液洗涤并贮存。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第39页3.应用PFGE对样品DNA进行分析（1）用0.5xTBE缓冲液制备一个0.8%SeakemHGT琼脂糖凝胶，胶厚度尽可能与样品凝胶块相符。若用WideMini-SubCell进行电泳话，50ml该溶液即可。（2）凝胶后，小心移去样品梳。将凝胶块用小刀切成与样孔一致大小，将样心插入加样孔，防止产生气泡。（3）把胶放入电泳槽内，加缓冲液，刚好覆盖胶表面即可，缓冲液事先14℃冷却。

核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第40页（4)将电泳槽和一个连着稳压电源程序性开关设备相连。打开电源，调整蠕动泵到适当流速(5～10mL/rain)或打开变速泵至40。

（5)经过计算机开启极性转换程序。大于50kb限制性片段在1.2s和0.4s正向和反向电脉冲下得以分离，时间普通为3.5h或更长。小于50kb

限制性片段在0.4s正向和0.2s反向电脉冲(比率为2:1)下得以分离，时间为3～5h。

（6)在0.5μg/mL溴化乙锭中进行染色并拍照。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第41页4.分离、纯化大DNA片段

（1)凝胶染色、分析后，在目标带前(靠近正极处)切一个0.25cm2左右槽，注入0.8%Seaplaque琼脂糖，使之凝固。

（2)重新打开极性转换开关，用紫外递质检测DNA迁移，当目标带进入Seaplaque凝胶中时，关闭开关，切下目标带，移至1.5mLEP管中。

（3)加入2μLtRNA，30μL5mol/LNACl，370μL

蒸馏水，在65～70℃之间，化胶并保温10min。

（4)苯酚/氯仿500μL抽提两次。

（5)用2.5倍体积95%乙醇和1/10体积NaAc3mol/L，pH5.2)于-70℃10min沉淀水相。再用70%乙醇洗两次并将沉淀溶于TE

缓冲液中。核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第42页脉冲电场凝胶电泳图核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第43页注意事项1.换缓冲掖时尽可能小心不要碰坏琼脂凝胶。

2.PMSF是一个强烈蛋白酶共价抑制剂，即有毒又挥发，操作时应在通风橱中进行。

3.用蛋白酶K包埋材料时50℃温育时间很长(24～48h)，有些学者提出如此长时间无须要(Mortimeret

al.1990)，且可能造成高分子质量DNA降解。在试验中可视情况而定。

4.琼脂糖凝胶块在TE(pH7.6)中4℃可存放多年，如在0.5mol/LEDTA中可存放更长时间。

核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座第44页5.一些高压电源并不适合脉冲电场凝胶电泳，因为这些电源