细胞工程原生质体培养和植物体细胞杂交详解演示文稿

细胞工程原生质体培养和植物体细胞杂交详解演示文稿当前1页，总共84页。（优选）细胞工程原生质体培养和植物体细胞杂交当前2页，总共84页。第六章原生质体培养和植物体细胞杂交当前3页，总共84页。原生质体的概念植物原生质体（protoplast）是指除去了细胞壁后的裸露的球形细胞。当前4页，总共84页。

原生质体能进行植物细胞的各种基本生命活动，如蛋白质和核酸合成、光合作用、呼吸作用以及通过质膜的物质交换等，这极有利于探讨许多细胞生理问题。同时，由于原生质体在诱导条件下能发生融合，离体培养条件下可能再生植株。因此原生质体培养研究在理论上和实践上都具有重要意义。原生质体培养的基本原理当前5页，总共84页。原生质体培养的发展历程：-1880年，Hanstein首次使用原生质体protoplast一词-1960年，Cocking首次采用纤维素酶从番茄幼苗的根尖中分离原生质体获得成功-1971年，Takebe等首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株-1985年，Fujimura等获得第一例禾谷类作物－-水稻原生质体培养再生植株-1986年，Spangenberg等利用单个原生质体培养再生植株，在甘蓝型油菜上获得成功当前6页，总共84页。据统计，自1971年Takebe首次报道从烟草叶肉原生质体再生植株后，已有49个科160多个属的360多种植物经原生质体培养得到了再生植株。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但已开始从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。当前7页，总共84页。原生质体的制备优点：条件温和，原生质体完整性好，得率高等。（一）原生质体的分离--酶解法影响因素：供试材料，酶的种类、浓度以及其组合，酶液渗透压，酶解时间和温度，纯化方法当前8页，总共84页。

1、材料的来源当前9页，总共84页。实践证明，幼嫩叶片，萌发种子的下胚轴、子叶以及愈伤组织和悬浮培养物等均是原生质体的良好来源：--叶肉细胞是分离原生质体的较好材料，从叶片中可分离出大量的较均匀一致的原生质体。由叶片制备原生质体时，植株的年龄和生长条件十分重要一般选用植株上充分展开的叶片；--愈伤组织和悬浮细胞系，由于其生长快速稳定，受环境条件的影响不大容易获得大量高质量的原生质体。细胞系建立时间的长短，继代培养的时间和培养基的成分等都影响原生质体分离的数量和质量。一般选用结构疏松并处于对数生长期的细胞分离原生质体的效果较好。

当前10页，总共84页。外植体材料用黑暗处理、低温处理和不同光质照射以及预培养等方法，可以提高某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处理方法不同：--龙胆试管苗只有用4℃处理后分离的原生质体才能分裂；--甘蔗植株只有在黑暗条件下培养12小时后分离的原生质体才能分裂；--马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48小时后分离原生质体，才会获得较高的原生质体产量。

2、预处理及酶解当前11页，总共84页。

酶酶解渗透压调节剂当前12页，总共84页。酶来源生产厂家纤维素酶类onozukaR–10绿色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin绿色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan果胶酶类MacerozymeR-10根霉YakyltHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase根霉SigmaChemicalCo.,St.Louit,MO63178,USAPectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纤维素酶RhozymeHP-150黑曲霉RohmandHassCo.,Philadelphia,PA19105,USAHemicellulase根霉SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO63178,USA原生质体分离常用的商品酶当前13页，总共84页。当前14页，总共84页。甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等--调节酶液渗透压，使其与所处理细胞的渗透压相似，保证原生质体活力，使用浓度根据植物材料而异，一般在0.2~0.8mol/LCaCl2·2H2O，KH2PO4，MES（2-氮吗啉乙烷磺酸），葡聚糖硫酸钾--提高原生质体膜的稳定性AgNO3、过氧化物歧化酶(SOD)--减轻酶解时产生的乙烯、氧自由基对细胞膜的损伤

牛血清蛋白

--可防止细胞壁降解过程中对细胞膜和细胞器的破坏当前15页，总共84页。酶解时间酶浓度酶解温度利用尽可能低的酶浓度和尽可能短的酶解时间获得大量而有活力的原生质体！当前16页，总共84页。酶解过程一般为将酶解材料放入装有酶液的培养皿中进行酶解，或在静止条件下每隔一段时间轻轻摇动，或将培养皿放在30～50r/min的摇床上轻轻振荡以游离原生质体。应注意以下条件：a、植物材料应按比例和酶液混合，才能有效地游离原生质体b、不同材料其生理特性不同，对酶液中渗透压的要求也不同c、酶的种类、浓度和酶解时间因材料而异d、酶液pH值一般在5.4～6.0e、酶解温度控制在24～28℃左右f、黑暗或弱光下进行

当前17页，总共84页。当前18页，总共84页。

（二）原生质体的纯化因植物材料和所使用的渗透压稳定剂不同，进一步纯化方法有：1、沉降法2、漂浮法3、梯度离心法当前19页，总共84页。沉降法方法：将收集的滤液低速离心，使原生质体沉降于管底。转速的控制以将原生质体沉淀而细胞碎片等杂质仍悬浮在上清液中为准，一般为500～800r/m下离心3～5min。用吸管小心地吸取上清液，再用洗涤液洗原生质体3次，最后用培养基洗涤1次，调整到一定密度后进行培养。--纯化收集方便，操作简单，原生质体丢失少。--在漂洗过程中容易造成原生质体的损伤，并且纯度不够好，存在少量脱壁不完全的细胞和破碎的原生质体。当前20页，总共84页。漂浮法方法：将收集的滤液于1000r/m的转速下离心10min，原生质体将漂浮于溶液的表面，细胞碎片等杂质将下沉到管底。用吸管吸出原生质体并转入到另一离心管中，反复3次，用培养基洗涤1次后调整到所需密度进行培养。--可以收集到较为纯净的原生质体，并且可以避免在离心纯化过程中因振荡撞击或挤压引起的原生质体破裂或损伤。--原生质体在数量上损失较多。当前21页，总共84页。界面法－梯度离心法方法：采用两种比重不同的溶液，离心后使完整无损的原生质体处在两液相的界面之间,而细胞碎片等杂质沉于管底。用此法可获得更为纯净的原生质体。当前22页，总共84页。以柑桔为例：25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液当前23页，总共84页。当前24页，总共84页。（三）原生质体活力的测定

1.荧光素双醋酸酯(FAD)染色法2.酚藏花红染色法3.荧光增白剂染色法4.伊凡蓝染色法当前25页，总共84页。二乙酸荧光素(fluoresceindiacetate,FDA)染色法

FDA本身无荧光，无极性，能透过细胞质膜，一旦进入原生质体后能在内酯酶作用下分解形成有荧光的极性物质－荧光素荧光素不能自由穿越细胞质膜而积累在原生质体当中，在荧光显微镜下观察时，凡发淡绿色荧光的是有活力的原生质体，无荧光或荧光很微弱的已经死亡或活力低的原生质体。当前26页，总共84页。

原生质体的培养原生质体培养基

原生质体培养方法

愈伤组织形成和植株再生

影响原生质体培养的因素

当前27页，总共84页。1.无机盐大量元素浓度；NO3-与NH4+的比例；Ca2+浓度2.有机成分维生素、氨基酸、糖及糖醇、酵母提取物、水解酪蛋白3.激素：生长素先高到低4.渗透压：培养基渗透压和细胞渗透压等渗原生质体培养基

当前28页，总共84页。当前29页，总共84页。液体浅层培养过程：将原生质体以一定密度悬浮在培养液中，用吸管将原生质体悬浮液转移到培养皿或三角瓶中使成一薄层。膜密封后置于人工培养箱中，静置培养。优点：操作简便，对原生质体伤害小，通气性好，代谢物易扩散易于补充新鲜培养基，形成细胞团或小愈伤组织后易于转移，较广泛采用。缺点：原生质体在培养基中分布不均匀，常发生原生质体间的黏连现象或造成局部密度过高，从而影响原生质体再生细胞的进一步发育，并且难以定点观察和跟踪单个原生质体的生长发育过程。当前30页，总共84页。固体培养－－琼脂（糖）平板培养或包埋培养过程：将原生质体悬浮液与35℃的琼脂（糖）培养基等量混合，使琼脂（糖）最终浓度为0.6%左右，迅速并轻轻摇动使原生质体均匀分布，然后转移至培养皿，冷却后原生质体包埋在琼（糖）培养基中，封口后培养。优点：原生质体被彼此分开并固定位置，便于定点观察，跟踪单个原生质体发育过程，易于统计原生质体的分裂频率和植板率；同时避免了细胞间有害代谢产物的影响。缺点：对操作要求较严，在原生质体悬浮液与琼脂（糖）培养基混合时温度必须合适，太高会影响原生质体活力，太低培养基的凝固较快使得原生质体分布不均匀；并且原生质体的生长发育比液体浅层法慢。已较少采用。当前31页，总共84页。液体浅层-固体平板双层培养法过程：在培养皿的底部铺一薄层含琼脂（糖）的固体培养基，再将原生质体悬浮液加于固体培养基表面进行液体浅层培养。优点：固体培养基中的营养成分可以缓慢地释放到液体培养基中，补充培养物对营养的消耗。同时，如在下层培养基中添加一定量的活性炭，可有效地吸附培养物产生的有害物质，促进原生质体的分裂及细胞团的形成。缺点：不易观察细胞的发育过程。当前32页，总共84页。琼脂糖珠培养过程：将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后，向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。优点：可通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于原生质体进一步生长和发育。由于改变了培养物的通气和营养环境，从而可促进原生质体的分裂及细胞团的形成。当前33页，总共84页。饲养层培养-看护培养、滋养培养

过程：该法又可分为分层培养和混合培养。分层培养是先制备固体的饲养细胞层，再在其上植板培养层。用x射线照射部分分离的原生质体，照射后将原生质体洗2～3次，包埋于琼脂培养基中，然后铺于培养皿的底层构成饲养细胞层。将欲培养的有活力的原生质体植板于饲养细胞层上面进行培养。混合培养是将经过x射线照射而失去分裂能力的原生质体与有活力的原生质体相混合，并包埋于琼脂培养基中进行固体平板法培养。优点：适合于原生质体低密度培养和某些难以培养的植物原生质体的培养。当前34页，总共84页。当前35页，总共84页。培养条件主要指培养的光照和温度。原生质体培养对培养条件的要求十分严格，且不同来源的原生质体在不同的培养阶段有不同要求。一般来说：--新分离原生质体应在散射光或黑暗中培养，诱导分化阶段再置于光下培养，光强1000～3000lx，光周期每天10～16h--不同的植物原生质体培养对温度的要求不尽相同，一般为25～30℃当前36页，总共84页。细胞壁再生细胞分裂愈伤组织形成植株再生

愈伤组织形成和植株再生

当前37页，总共84页。--原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。--电镜观察发现，原生质体培养数小时后新壁开始形成，先是由质膜合成形成细胞壁的主要成分微纤维，然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多片层的结构，以后在质膜与片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。(1)细胞壁再生当前38页，总共84页。--原生质体一般培养2～7d后开始第一次分裂，此时间随植物的种类、分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和培养条件而异。--用幼苗的下胚轴和子叶、幼根、悬浮培养的细胞和未成熟种子的子叶等为材料分离的原生质体，一般比用叶肉分离的原生质体容易诱导分裂，第一次分裂出现的时间较快。(2)细胞分裂和生长当前39页，总共84页。--大多数情况下，原生质体培养二周后形成多细胞细胞团，三周后形成肉眼可见的小细胞克隆，大约六周后形成直径1mm的小愈伤组织。--原生质体培养7～10天后必需及时添加新鲜培养基，否则形成的细胞团不继续生长，待小愈伤组织长至1mm左右时应及时转移到固体培养基上使其进一步生长。(3)愈伤组织的形成当前40页，总共84页。--原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化培养基上可进一步成苗。越来越多实验证明，两步成苗法更适合大多数植物原生质体再生植株。即，首先将愈伤组织培养于低浓度生长素培养基上，让其增殖和调整状态再转移到分化培养基上分化成苗。(4)植株再生当前41页，总共84页。基因型原生质体的来源起始培养密度和培养基影响原生质体培养的因素

当前42页，总共84页。当前43页，总共84页。植物原生质体培养程序示意图原生质体分离⑴机械法分离原生质体⑵酶法分离⑶影响原生质体活力的因素原生质体纯化⑴沉降法⑵漂浮法⑶界面法原生质体培养⑴平板培养、浅层液体培养、双层培养法⑵细胞密度104~105个/mL（因种类而异）⑶培养成功的关键细胞壁再生⑴植物种类和材料的生理状态⑵培养细胞所处时期（旺盛分裂期则快）⑶与质膜稳定剂和渗透压稳定剂有关细胞分裂形成细胞团⑴基本培养基筛选⑵激素种类和浓度调节⑶渗透压调节器官形成植株再生⑴基本培养基无机盐浓度筛选⑵激素种类和浓度调节⑶渗透压调节当前44页，总共84页。当前45页，总共84页。原生质体培养的意义：1、原生质体融合原生质体培养成功为开展体细胞杂交奠定了基础，通过不同材料的原生质体融合克服传统育种方法所面临的生殖障碍，创造新的种质材料。2、筛选突变体原生质体在培养过程中能够产生体细胞无性系变异，且对外界理化因子更为敏感易诱发突变，可从中选出具有优良性状的变异体，成为农作物改良的重要遗传资源。当前46页，总共84页。3、遗传转化原生质体容易摄取外源遗传物质，如细胞器、细胞核、细菌、病毒、质粒和各种DNA分子，使其能够作为遗传转化的受体系统。目前，PEG法、电激法、脂质体法、基因枪法等均已用于原生质体转化研究，获得了大豆等一系列转基因植株

4、基础研究原生质体为细胞生物学、发育生物学、细胞生理学、病毒学等学科的基础理论研究提供了理想的实验体系，可用于研究细胞壁再生、细胞膜的结构及离子转运、细胞器的光合作用、呼吸作用等。当前47页，总共84页。当前48页，总共84页。体细胞杂交(somatichybridization)是指两个离体细胞通过一定的诱导技术使质膜接触而融合在一起，随后导致两个细胞核物质融合的技术。植物体细胞杂交则是指除去细胞壁的原生质体融合(protoplastfusion)。一、体细胞杂交的概念当前49页，总共84页。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞有来自双亲的核外遗传系统。在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA，亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。理论上说，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远意义。当前50页，总共84页。对称融合（asymmetricfusion）－即两个完整的细胞原生质体融合。非对称融合（symmetricfusion）－利用物理或化学的方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合，它可以分为几种：

根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大类：当前51页，总共84页。目前开展的融合试验中绝大部分是对称融合，此融合方式在获得农艺性状互补的体细胞杂种方面具有一定的优势，但由于它综合了双亲的全部性状，在导入有利性状同时也不可避免带入了一些不利性状。尤其在一些远缘组合中，由于存在一定程度的体细胞不亲和性，使得杂种植株的表现并非预期理想。

对称融合当前52页，总共84页。

首例非对称杂种是由x射线辐射处理后的欧芹原生质体与烟草原生质体相融合得到的。这一融合方法由于在转移部分遗传物质方面具有独特优点而受到重视。非对称融合当前53页，总共84页。物理方法常采用射线处理，如X射线、射线等，它们能使细胞核失活；化学处理目前常用的试剂有:核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活－罗丹明（R－6－G，一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活的目的）用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两类：当前54页，总共84页。二、原生质体的融合（一）原生质体融合方法PEG融合电融合当前55页，总共84页。PEG诱导融合：1制备原生质体悬浮液；2混合好的原生质体悬浮液中逐滴加入PEG溶液，可在倒置显微镜下观察；3将PEG中的原生质体于室温下保温15～20min；4待大多数细胞圆球化，再在原生质体悬浮液滴顶部加一滴高钙溶液，静置10～20min；5用原生质体培养液洗涤，500r/m离心去除融合液，培养原生质体。当前56页，总共84页。由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键当PEG分子链足够长时，在相邻原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连与膜相连的PEG分子被洗掉后，膜上电荷发生紊乱而重新分配另外，PEG能增加类脂膜的流动性，使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能

PEG融合的机理：当前57页，总共84页。-+-+-桥梁++--PEG被洗掉++--电荷重排++--原生质体膜接触++-融合当前58页，总共84页。融合成本低，勿需特殊设备融合子产生的异核率较高融合过程不受物种限制融合过程繁琐PEG可能对细胞有毒害PEG融合的特点：当前59页，总共84页。电融合诱导法：1、将已制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室中；2、微电极型的两个电极的端部同时与两靠近的原生质体膜表面接触，所产生的5～12mA的脉冲电流间断刺激1～5ms，原生质体瞬时发生暂时性的收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个泡囊，最后形成融合体；3、平行多电极通过1MHz的交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力作用下极化产生偶极子原生质体紧密排开成串珠状，在直流电脉冲作用下，质膜被击穿，进一步形成融合体。当前60页，总共84页。1细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；2膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲后就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起电融合的基本过程：当前61页，总共84页。电融合法的原理交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠负极正极--+-++++--+-+-+-+-+-+-当前62页，总共84页。施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-当前63页，总共84页。当前64页，总共84页。--交流电压--交变电场的振幅频率--交变电场的处理时间--直流高频电压--脉冲宽度--脉冲次数电融合中的主要参数：当前65页，总共84页。一是不存在对细胞的毒害问题二是融合效率高三是融合技术操作简便与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：当前66页，总共84页。交流电使原生质体排成串珠

直流电使原生质体质膜发生不可逆击穿电融合仪的结构特点：一是交变电场部分一是高频直流电击部分当前67页，总共84页。（二）原生质体融合过程1、凝聚作用阶段，其间两个或两个以上的原生质体的质膜彼此靠近；2、在很小的局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，在两个原生质体之间细胞质呈现连续状态，或是出现桥；3、由于细胞质桥的扩展，融合完成，形成球形的异核体或同核体。当前68页，总共84页。原生质体质量融合方法融合参数(三)影响原生质体融合的因素当前69页，总共84页。杂种细胞的发育动态杂种细胞的选择系统与体细胞杂种植株的鉴定体细胞杂种的特点体细胞杂种后代的遗传三、杂种细胞的发育动态及体细胞杂种鉴定当前70页，总共84页。（一）杂种细胞的发育动态核融合核质重组细胞器重组部分核物质或细胞器丢失融合核分裂当前71页，总共84页。（二）杂种细胞的选择系统与体细胞杂种植株的鉴定1、杂种细胞的选择系统外观选择互补选择荧光标记选择当前72页，总共84页。大豆根间悬浮培养细胞的+粉蓝烟草叶肉细胞原生质体原生质体

异核体具有浓厚细胞质的非绿色绿色、液泡化（1）利用天然颜色标记分离杂种细胞：既具有粉蓝烟草原生质体特有的绿色质体又具有与大豆原生质体相似的形态和丰富的细胞质带当前73页，总共84页。Galbraith等用发绿色荧光的异硫氰酸荧光素（FITC）和发红色荧光的碱性蕊香红荧光素分别标记了两种烟草的叶肉原生质体，有效选择出了杂种细胞。（2）利用荧光素标记分离